A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-26T20:15:20Z No. of bitstreams: 2 Clayson Gomes - 2012 - dissertação.pdf: 1729605 bytes, checksum: 48dd1bd05f0e954a3dd14fb20b162e2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-26T21:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Clayson Gomes - 2012 - dissertação.pdf: 1729605 bytes, checksum: 48dd1bd05f0e954a3dd14fb20b162e2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-26T21:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Clayson Gomes - 2012 - dissertação.pdf: 1729605 bytes, checksum: 48dd1bd05f0e954a3dd14fb20b162e2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-02-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Introduction: Leishmaniasis is a tropical zoonoses that is endemic, causing different clinical forms including cutaneous, diffuse, disseminated, mucosal and visceral manifestations. The L. (V.) braziliensis is the most common parasite found in cutaneous leishmaniasis in Brazil and is the major agent for the mucosal leishmaniasis. The manifestation of the disease and the clinical forms are dependent on several factors related between the parasite and host. Objective: The aim of this study was to compare the ability of amastigote parasite isolated from patients with cutaneous or mucosal leishmaniasis to stimulate the production of cytokines in peripheral blood mononuclear cells cultures (PBMC) obtained from health donors. Methods: Isolates of patients with cutaneous or mucosal lesion were inoculated in IFNγ knockout mice to obtain amastigotes, which were purifyed by density using Percoll. The PBMCs from healthy individuals were separated by density using Ficoll. The cells were incubated in cultures at different times with amastigotes and then the supernatant were collect to quantify cytokines by ELISA or cells that are used to quantify cytokines using the real time PCR. Results: PBMCs produced higher amounts of IL-1β, IL-6, IL-10 and TGFβ in cultures after stimulation with amastigotes than uninfected controls. When comparing isolates from cutaneous or mucosal disease it was not found differerence regarding to the production of IL-6, IL-10 and TGFβ, but amastigotes from patients with cutaneous leishmaniasis induced more IL-1β than in parasites obtained from mucosal lesion. Production of IFNγ IL17, and TNF was was not detected at different times after stimulation with L. (V.) braziliensis amastigotes. Conclusion: The results suggest that amastigotes of patients with cutaneous leishmaniasis interact with innate immunity cells by inducing the production of proinflammatory or anti-inflammatory and isolated from mucosal lesions induce less IL-1 than parasites obtained from skin lesions. The greatest amount of IL-1 promotes an inflammatory response with migration of cells to the site of infection, so a low xvii production would cause a slower disease and would prejudice an effective acquired response. Thus, the parasite would be able to survive longer in host in a silent way. / Introdução: A leishmaniose é uma zoonose tropical endêmica com diferentes formas clínicas, incluindo as formas cutânea, difusa, disseminada, mucosa e visceral. L. (V.) braziliensis é o parasito mais comumente encontrado na leishmaniose tegumentar no Brasil sendo, o principal agente da leishmaniose mucosa. A manifestação da doença e as formas clínicas existentes são dependentes de diversos fatores relacionados ao parasito e ao hospedeiro. Objetivo: Comparar a habilidade de formas amastigotas isoladas de pacientes com leishmaniose cutânea ou mucosa em estimular a produção de citocinas em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) obtidas de doadores sadios. Métodos: Isolados obtidos de pacientes com lesões cutâneas ou mucosas foram inoculados em camundongos deficientes de IFNγ para obtenção de formas amastigotas, que foram separadas por gradiente de densidade usando o Percoll. As PBMCs de indivíduos sadios foram separadas por gradiente de densidade usando o Ficoll e cultivadas por diferentes tempos com as formas amastigotas. O sobrenadante foi coletado para quantificar as citocinas por ELISA e as células restantes foram lisadas para análise do mRNA para citocinas usando o PCR em tempo real. Resultados: As PBMCs produziram IL-1β, IL-6, IL-10 e TGFβ em culturas após a estimulação com amastigotas. Os isolados de lesões cutâneas produziram quantidades semelhantes de IL-6, IL-10 e TGFβ quando comparados com isolados de lesões mucosas. Formas amastigotas obtidas de pacientes com leishmaniose cutânea induziram uma maior produção de IL-1β do que parasitos obtidos de lesões mucosas. A produção de IFNγ, IL-17, e TNF não foi detectada em todos os tempos avaliados, após a estimulação com amastigotas de L. (V.) braziliensis. Conclusão: Os resultados sugerem que formas amastigotas de pacientes com leishmaniose tegumentar interagem com células da imunidade inata, induzindo a produção de citocinas pró e anti inflamatórias, sendo que isolados oriundos de lesão mucosa induzem menos IL-1 do que parasitos obtidos de lesões cutâneas. A maior quantidade de IL-1 favorece uma resposta inflamatória com a migração de células para xv o local da infecção. Uma baixa produção dessa citocina faria com que a doença fosse mais lenta prejudicando a formação de uma resposta adquirida eficiente. Portanto, o parasito poderia ser capaz de sobreviver por um tempo maior no hospedeiro de uma maneira silenciosa, causando a forma mucosa.

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-06-09T14:25:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-09T19:30:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-06-09T19:32:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-09T19:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Nivea Maria Simões Falcão.pdf: 1851149 bytes, checksum: 9f64cfee0db539642d59a412a4bf9eea (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmaniasis is a world public health problem wide considered by the World Health Organization as one of five infectious endemic diseases of major relevancy. The search for leishmanicids agents with fewer side effects is one of the greatest challenges in modern research, and is increasingly related to the uses of medicinal plants and other natural products. The species Caesalpinia ferrea Martius widely distributed in Brazil it is popularly used for many therapeutic purposes, including the treatment of various infections like those caused by leishmaniasis, making it a promising tests of biological activity against leishmania. The objective of this study was to evaluate by bioassays the activity of hexane and methanol extracts against protozoa, analyzing semi-purified fractions obtained from the most active. The fruits of C. ferrea were collected at the National Institute of Amazon Research, V8’s Campus in the City of Manaus - AM and processed in the departments of Natural Products and leishmaniasis and Chagas Diseases at INPA. The studies were performed with the whole fruit and its separate parts, coconut shell and seed. Hexane e methanol crude extracts were prepared from the fruits, coconut shell and seeds, which were tested to evaluate the biological activity in vitro against promastigotes of the stationary phase of the protozoan Leishmania (Viannia) guyanensis. The extracts were analyzed by thin layer chromatography Comparison (CCDC) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to determine the chromatographic profile. All biological assays were carried out experimentally in vitro in microplates containing 106/mL promastigotes to axenic cultures of L. (V.) guyanensis evaluating the inhibitory activity and stimulating parasite growth. The most active crude extract was submitted to CCDC and fractionation by partition líquid-líquid resulting in semi-purified fractions that were evaluated for their chemical composition. The results showed that the epicarp methanolic extract of C. ferrea, showed anti-leishmanial activity for L. (V.) guyanensis in the concentration of 20 mg/mL/24h. However, contrary to expectations, there was a stimulatory effect on L. (V.) guyanensis by the hexanic extract obtained from the fruit seed of C. ferrea. Chemically analyzing the coconut shell and fruits methanolics extracts of, which showed anti-leishmanial activity, we verified the presence of substances such as chlorophyll, flavonoids, xanthones, tannins, triterpenes and saponins as major constituents, and shows antioxidant activity. The results showed that the methanolics extracts of coconut shell and fruitsof C. ferrea can be considered as an promising alternative in the treatment of cutaneous leishmaniasis and should be undertaken pharmacological and toxicological tests in vivo of extract, making other fractioning in order to isolate the substances responsible for the anti-leishmanial activity. / A leishmaniose é um problema de saúde pública mundial considerada pela Organização Mundial da Saúde como uma das cinco doenças infecto-parasitárias endêmicas de maior relevância. A busca por agentes leishmanicidas com poucos efeitos colaterais é um dos maiores desafios na pesquisa moderna, e cada vez mais está relacionada aos usos de plantas medicinais e outros produtos naturais. A espécie Caesalpinia ferrea Martius largamente distribuída no Brasil, é usada popularmente para muitos fins terapêuticos, inclusive no tratamento de diversas infecções como as causadas pela Leishmaniose, tornando-a promissora para a realização de ensaios de atividade biológica contra a leishmania. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar, através de bioensaios, a atividade de extratos hexânicos e metanólicos contra protozoários, analisando também frações semi-purificadas obtidas do extrato de melhor atividade leishmanicida. Os frutos de C. ferrea foram coletados no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Campus do V8 na Cidade de Manaus-AM, e processados nos departamentos de Produtos Naturais e de Leishmaniose e Doença de Chagas no INPA. Os estudos foram realizados com os frutos inteiros e suas partes separadas, epicarpos e sementes. Foram preparados extratos brutos hexânicos, e metanólicos a partir dos frutos inteiros e também das partes separadas, epicarpos e sementes, os quais foram submetidos aos ensaios para avaliação da atividade biológica in vitro contra formas promastigotas da fase estacionária de protozoários da espécie Leishmania (Viannia) guyanensis. Os extratos brutos foram analisados através de Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para determinação do perfil cromatográfico. Todos os ensaios biológicos foram realizados experimentalmente in vitro, em microplacas contendo 106/mL formas promastigotas de culturas axênicas de L. (V.) guyanensis (MHOM/BR/75/IM 4147) avaliando-se a atividade inibitória ou ativadora de crescimento parasitário. O extrato bruto de melhor atividade biológica foi submetido à CCDC e fracionamento por partição líquido-líquido obtendo-se frações semi-purificadas que foram avaliadas quanto a sua composição química. Os resultados mostraram que o extrato metanólico do epicarpo de C. ferrea, apresentou atividade leishmanicida para L. (V.) guyanensis na concentração de 20 mg/mL/24h. No entanto, ao contrário das expectativas, houve um efeito estimulante em L. (V.) guyanensis pelo extrato hexânico obtido das sementes de frutos de C. ferrea. Analisando quimicamente o extrato metanólico de frutos e epicarpos, os quais demonstraram atividade leishmanicida, verificou-se a presença de substâncias como a clorofila, flavonóides, xantonas, taninos, triterpenos e saponinas como constituintes majoritários, além de apresentar atividade antioxidante. Os resultados obtidos demonstraram que os extratos metanólicos de frutos e epicarpos de C. ferrea podem ser considerados como importantes alternativas no tratamento das leishmanioses, devendo ser realizado testes farmacológicos e toxicológicos in vivo desses extratos, realizando outros fracionamentos a fim de se confirmar alguma substância de melhor atividade leishmanicida.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Renata da Silva Ribeiro.pdf: 705558 bytes, checksum: e16373fa17f99c734d58ede2a54543c6 (MD5) Previous issue date: 2007-02-27 / Ouratea cuspidata (Ochnaceae) crude extracts were added to experimental systems containing either host macrophages, or Leishmania braziliensis promastigotes (L566). The biological effect by the use of the hexane (OCH), methanol (OCMeH) and ethyl-acetate (OCAcEt) extracts added at different concentrations: 2mg/mL; 4mg/mL; 8mg/mL, 16mg/mL e 32mg/mL. The OCMeOH was the only fraction to which the anti parasitic potentiality was achieved at doses rates that generated bio protective effects in the host cells. The parasiticide action, due by direct exposure of promastigotes to OCMeOH, as well as the parasitic growth, and morphological alterations intermediary metabolism alterations (mitochondrial activity) were concomitantly measured. Biological macrophagic functions were also evaluated using Cricetus cricetus peritoneal macrophages as a model (Mf). Bio-protective assays were carried out in order to determine the free radical generation by the extract constituents. The results were compared with non treated L566 and Mf. 78% of the 16 mg/106 Mf/mL treated Mf were viable but a significant decrease of their phagocytosis capability (92%) was detected. Such alterations were evident in 62% of the cells treated with 32mg/106 Mf/mL. At this concentration cells were 70% viable and presented 98% phagocytosis suppression. The macrophages enzymatic- mitochondrial activity was gradually diminished, with 87% activity at exposures to 8mg/106 Mf/mL; 66,3% at exposures to 16mg/106 Mf/mL, and 49% at exposures to 32mg/106 Mf/mL, respectively. The anti parasitic effects were not associated to the promastigotes lack of viability. Instead, a significant rising on the L566 cells counting was detected when compared to control non treated parasites, from the first 6 hours treatment until 24 hours exposure. Morphological changes were detected in 62% of the 8mg/106 L566/mL parasite treated cells; 78% after 16mg/106 L566/mL treatment, and 98% of the cells presented morphological changes after 32mg/106 L566/mL treatment. Cells were either round-shaped, showing incomplete mitosis, or presenting double flagella, suggesting that the present extract containing substances that might interfere in the parasitic topoisomerase function. The parasitary mitochondrial activity evidenced the occurrence of a metabolic acceleration due by the OCMeOH treatment. The mitochondrial enzymatic activity was of 220% at exposures to 8mg/106 L566/mL; 389% at exposures to 16mg/106 L566/mL and of 480% at exposures to 32mg/106 L566/mL, respectively, when compared to the non treated parasites (100%). The anti parasitic potential (Therapeutic Index) was considered to be positive (acceptable) (TI=4,0) when estimated in function of the morphological changes observed at the extract concentration of 32mg/106 Mf/mL (LD62%), and at 8mg/106 L566/mL (ED62%), respectively. Since bi-flavonoids are the main constituents present in the OCMeOH, results were suggestive the anti parasitic effect was due to this group of secondary metabolites. As such biologically active molecules are known COX2 selective inhibitors, its internal use should be avoided. Otherwise, bi- flavonoids are good candidate substances to be applied as topical medicine to treat the American Tegumentar Leishmaniasis. / Os efeitos dos extratos de Ouratea cuspidata (Ochnaceae) foram avaliadas a partir da exposi??o de c?lulas hospedeiras e de promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (L566) ?s fra??es oriundas da sua parti??o hex?nica (OCH), metan?lica (OCMeOH) e acetato de et?lica (OCAcEt). Dentre estas, a fra??o OCMeOH foi a ?nica que apresentou potencial antiparasit?rio em doses que geraram bioprote??o aos sistemas hospedeiros. Assim, procederam-se an?lises de a??o parasiticida direta do extrato OCMeOH sobre formas promastigotas, onde, tamb?m, foram avaliados o crescimento, altera??es morfol?gicas e fun??es do metabolismo mitocondriais. Do mesmo modo, foram realizadas observa??es semelhantes em macr?fagos peritoneais de hamsters Cricetus cricetus (Mf) afim de se determinar a toxicidade relativa para o hospedeiro. Finalmente, foram realizados ensaios complementares de bioprote??o e gera??o de radicais livres, com a finalidade de confirmar a poss?vel aplica??o terap?utica dos constituintes presentes no extrato. Em todas as etapas experimentais, foram utilizadas cinco concentra??es de OCMeOH (2mg/mL; 4mg/mL; 8mg/mL; 16mg/mL e 32mg/mL), sendo que os resultados obtidos foram comparativamente avaliados em rela??o a sistemas de controle (L566 e Mf n?o tratados). Os (Mf) tratados com 16 mg/106 Mf/mL do extrato sofreram uma diminui??o significativa (92%) de sua capacidade fagocit?ria, mas permaneceram vi?veis, em sua maioria (78%). As altera??es morfol?gicas mostraram-se mais evidentes em 62% das c?lulas tratadas com 32mg/106 Mf/mL, com 70% de viabilidade e 98% de inibi??o da fagocitose. A atividade enzim?tica-mitocondrial macrof?gica apresentou diminui??o gradativa, com a preserva??o de 87% das fun??es enzim?ticas nas c?lulas tratadas com 8mg/106 Mf/mL; 66,3% daquelas tratadas com 16mg/106 Mf/mL e 49% das tratadas com 32mg/106 Mf/mL. As L566 n?o apresentaram a perda da viabilidade ap?s exposi??o de 24horas ?s diferentes concentra??es de OCMeOH. Ao contr?rio, houve um aumento significativo no n?mero de promastigotas que, a partir de seis horas de cultivo, mostraram-se sempre superiores ? quantidade de parasitos n?o tratados. Foram detectadas altera??es morfol?gicas em 62% das L566 tratadas com 8mg/106 L566/mL; 78% daquelas tratadas com 16mg/106 L566/mL e 98% das tratadas com 32mg/106 L566/mL. As promastigotas tratadas apresentaram-se arredondadas, com mitose incompleta, ou apresentando dois flagelos, sugerindo que as subst?ncias presentes no extrato podem interferir nas topoisomerases parasit?rias. A atividade mitocond rial parasit?ria evidenciou a ocorr?ncia de acelera??o metab?lica induzida pelo tratamento com OCMeOH. A atividade enzim?ticamitocondrial foi de 220% no tratamento com 8mg/106 L566/mL; de 389% com 16mg/106 L566/mL e 480% com 32mg/106 L566/mL quando comparadas ao controle (100%). O potencial antiparasit?rio (Indice Terap?utico) foi considerado positivo (IT=4,0) em fun??o das altera??es morfol?gicas observadas nas concentra??es de 32mg/106 Mf/mL (LD62%), e 8mg/106 L566/mL (ED62%). Sendo biflavon?ides os constituintes presentes em maior propor??o, atribuiu-se a este grupo de subst?ncias a a??o antiparasit?ria e imunot?xica observadas para OCMeOH. Os bi-flavon?ides presentes no extrato metan?lico de Ouratea cuspidata est?o entre os inibidores seletivos de COX2, sugerindo o desenvolvimento de pesquisas que visem sua utiliza??o t?pica em animais naturalmente infectados.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T00:30:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mestrado BP - Camila Mesquita Rodrigues.pdf: 2143075 bytes, checksum: ece36df5bf0e778217222b79d03c4bd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T00:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mestrado BP - Camila Mesquita Rodrigues.pdf: 2143075 bytes, checksum: ece36df5bf0e778217222b79d03c4bd8 (MD5) Previous issue date: 2011-12-08 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O ferro é um elemento essencial para a sobrevivência dos microorganismos in vitro e in vivo, atuando como cofator de diversas enzimas e desempenhando um papel crítico durante a interação parasito-hospedeiro. Somente os parasitos mais virulentos são dotados de mecanismos eficazes para adquirir ferro do hospedeiro sadio, conseguindo invadir, colonizar, se multiplicar e estabelecer a infecção. L. (V.) braziliensis é um parasito distribuído por todo o continente americano sendo considerado o principal agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). No presente estudo, o efeito do ferro sobre a proliferação, a ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis é analisado pelo uso do quelante 2,2-dipyridyl. A curva de crescimento de L. (V.) braziliensis foi afetada tanto pela concentração do quelante quanto pelo tempo de cultivo em meio depletado de ferro. Nos ensaios de citotoxicidade, a relação entre a intensidade da fluorescência e a concentração do quelante de ferro também foi dose dependente. As concentrações de 100, 140 e 180 µM de 2,2-dipyridyl afetaram significativamente a fluorescência emitida por ambos os isolados após 24 e 48 horas de incubação. Os valores da IC50 foram calculados após 24 e 48 horas e o isolado IOC-L 2483, relacionado à forma disseminada da LTA, foi escolhido para a realização de todos os ensaios subseqüentes. A análise ultraestrutural das formas promastigotas tratadas com 100 µM de 2,2-dipyridyl revelou grande dano a mitocôndria que sofreu perda da matriz e da crista e passou a apresentar estruturas membranares concêntricas em seu interior. A depleção de ferro também induziu a ruptura do complexo de Golgi e a intensa vacuolização citoplasmática. A análise de parasitos incubados com TMRE e PI por citometria de fluxo demonstrou que a depleção de ferro acarreta na dissipação do potencial de membrana mitocondrial embora não esteja associada permeabilização da membrana celular. A incubação dos parasitos com TUNEL demonstrou que a privação de ferro não acarreta em fragmentação do DNA nuclear. A análise dos extratos totais das formas promastigotas por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas revelou que as proteínas que tiveram sua expressão aumentada ou diminuída após tratamento com o quelante estão relacionadas à manutenção da homeostase do ferro, ao metabolismo dos ácidos nucléicos e à indução de modificações pós traducionais. Nossos resultados demonstram que a depleção de ferro afeta a proliferação, a ultraestrutura e a expressão protéica de L. (V.) braziliensis, induzindo à disfunção mitocondrial e levando a morte do parasito. / Iron is an essential element for in vitro and in vivo survival of microorganisms, acting as a cofactor of several enzymes and playing a critical role in host-parasite relationship. Only the more virulent strains, endowed with effective mechanisms to acquire iron from healthy hosts can invade, colonize, multiply and establish infection. Leishmania (Viannia) braziliensis is a parasite widespread in the new world and considered to be the major etiological agent of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL). In the present study, the effect of iron on growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis is analyzed by use of the chelator 2,2-dipyridyl. Growth curve of L. (V.) braziliensis was affected by both concentration of iron chelator and time of culture in depleted medium. In citotoxicity assays, the ratio between fluorescence intensity and concentration of iron chelator was also dose dependent. Concentrations of 100, 140 and 180 µM of 2,2-dipyridyl significantly affected the fluorescence emitted by both isolates after 24 and 48 hours of incubation. The IC50 values were calculated after 24 and 48 hours and IOC-L 2483, related to the disseminated clinical manifestation of the LTA, was chosen to perform all the subsequent assays. Ultrastructural analysis of treated promastigotes revealed a remarkable mitochondrial swelling with loss of cristae and matrix and presence of concentric membranar structures inside the organelle. Iron depletion also induced Golgi disruption and intense cytoplasmic vacuolization. Fluorescence- activated cell sorting analysis of tetramethylrhodamine stained parasites showed that 100 µM of 2,2-dipyridyl collapsed the mitochondrial membrane potential. Incubation of parasites with propidium iodide demonstrated that disruption of mitochondrial membrane potential was not associated with plasma membrane permeabilization. TUNEL labelling for DNA fragments was negative. Two dimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis of whole extracts from promastigotes showed that proteins involved in homeostasis of iron, metabolism of nucleic acids and coordination of post-translational modifications suffered up- or down- regulation after treatment with the iron chelator. Our results show that iron depletion affects growth, ultrastructure and protein expression of L. (V.) braziliensis leading to mitochondrial dysfunction and cell death.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T13:53:11Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Parcial - Pauline Soldera.pdf: 748540 bytes, checksum: 966764b9bef7541de4b3724ad90c77a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T13:53:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Parcial - Pauline Soldera.pdf: 748540 bytes, checksum: 966764b9bef7541de4b3724ad90c77a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T13:53:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Parcial - Pauline Soldera.pdf: 748540 bytes, checksum: 966764b9bef7541de4b3724ad90c77a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-06T13:53:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Parcial - Pauline Soldera.pdf: 748540 bytes, checksum: 966764b9bef7541de4b3724ad90c77a6 (MD5) Previous issue date: 2015-07-11 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Leishmaniasis is an infectious disease - parasitic caused by a parasite of the genus Leishmania and transmitted by the bite of infected female sandfly. Human infections caused by Leishmania can manifest in different ways, depending on the causal species, such as cutaneous leishmaniasis (CL) or visceral leishmaniasis (VL). The therapeutic arsenal against LT is still very restricted. The pentavalent antimony remain the drugs of choice for the treatment and, despite its efficacy, have side effects with prolonged treatment time. Medicinal Chemistry Inorganic have offered new possibilities for research, and metals, especially transition, offer some advantages over drugs, including the variety of oxidation states, enabling their participation in redox biological processes. In the present work we studied the in vitro effect of two metal complexes silver base (Ag1 and Ag2), against promastigotes and amastigotes of Leishmania. (Leishmania) amazonensis and Leishmania. (Viannia) guyanensis in periods of 24, 48 and 72 hours. The metal complexes were synthesized by the team of "Istituto per l'Energetica and le Interfasi" IENI, Padua, Italy (CNR, National Research Council, IT) and sent to biological testing at the National Institute for Amazonian Research (INPA). Results of bioassays with L. (L.) amazonensis showed that Ag2 substance showed higher anti-leishmania activity in the concentration of 160μM/ml, from 72h, EC50 14.53 uM/ml in the manual counting method, and by the MTT method at 24 hours period with EC50 11.35 uM/mL. In cons tests the amastigote form, there was little infection of macrophages by Ag1 complex, 25% infected, compared with 61% without infection amastigotes. Results with L. (V.) guyanensis, the manual counting method, Ag1 did not show satisfactory values, with EC50> 60 uM / ml, Ag2 showed moderate activity in the period of 24h and 48h, EC50 43.22 uM / ml and 57, 64 uM / ml. For the MTT the two substances had EC50 values> 60 uM / ml. Against amastigote forms, with Ag1 complex was cell death of the macrophages. Ag2 showed 38% infection rate, with 47% of uninfected macrophages. Thus, the two metal complexes did not perform well when tested across the promastigote and amastigote forms of L. (V.) guyanensis. Against forms L. (L.) amazonensis, both complexes showed satisfactory results, and the Ag2 complex, with better results in promastigote and amastigote forms / A leishmaniose é uma doença infecto – parasitária causada por um parasita do gênero Leishmania e transmitida pela picada do flebotomíneo fêmea infectado. Infecções humanas causadas pela Leishmania podem manifestar-se de diferentes formas, dependendo da espécie causal, como leishmaniose tegumentar (LT) ou leishmaniose visceral (LV). O arsenal terapêutico contra a LT ainda é muito restrito. Os antimoniais pentavalentes permanecem como as drogas de primeira escolha para o tratamento e, apesar de sua eficácia, apresentam efeitos colaterais, com tempo de tratamento prolongado. A Química Inorgânica Medicinal têm oferecido novas possibilidades para a pesquisa, e os metais, em especial os de transição, oferecem algumas vantagens sobre os fármacos, incluindo a variedade de estados de oxidação, permitindo sua participação em processos biológicos redox. No presente trabalho foi estudado o efeito in vitro de dois complexos metálicos a base de prata (Ag1 e Ag2), contra as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania. (Leishmania) amazonensis e Leishmania. (Viannia) guyanensis nos períodos de 24, 48 e 72 horas. Os complexos metálicos foram sintetizados pela equipe do “Instituto per l’Energetica e le Interfasi”, IENI, Pádua, Itália(CNR, Conselho Nacional de Pesquisas, IT) e encaminhados para testes biológicos no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). Resultados dos bioensaios com L. (L.) amazonensis demonstraram que a substância Ag2 apresentou maior atividade anti-leishmania na concentração de 160μM/mL, no período de 72h, EC50 14,53 μM/mL no método de contagem manual, e pelo no método MTT, no período de 24h, com EC50 11,35 μM/mL. Nos testes contras as forma amastigota, houve pouca infecção de macrófagos pelo complexo Ag1, 25% infectados, contra 61% sem infecção do formas amastigotas. Resultados com L. (V.) guyanensis, pelo método de contagem manual, Ag1 não apresentou valores satisfatório, com do EC50 >60 μM/ mL, Ag2 apresentou atividade moderada nos período de 24h e 48h, EC50 43,22 μM/ mL e 57, 64 μM/ mL. Pelo método MTT as duas substâncias apresentaram valores de EC50 >60 μM/ mL. Contra as formas amastigotas, com o complexo Ag1, houve a morte celular dos macrófagos. Ag2 apresentou taxa de infecção de 38%, contra 47% de macrófagos não infectados. Sendo assim, os dois complexos metálicos não desempenharam bons resultados quando testados frente as formas promastigota e amastigota de L. (V.) guyanensis. Contra as formas de L. (L.) amazonensis, ambos complexos apresentaram resultados satisfatórios, sendo o complexo Ag2, tendo melhores resultados em formas promastigota e amastigota.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6315_1.pdf: 1356784 bytes, checksum: ed82e0e5c10b92208b91c8e8a95cb0f7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A investigação da possibilidade de diagnóstico para a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), a partir de sangue venoso e através da Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction = PCR), foi realizada em duas amostras de populações de área endêmica do Estado de Pernambuco, Brasil. Foi coletado um total de 119 amostras de sangue venoso, sendo 63 do município do Cabo de Santo Agostinho e 56 do município de Triunfo. Inicialmente, realizaram-se alguns experimentos para padronização da técnica de PCR, e os primers escolhidos amplificaram o fragmento de 750 pares de bases pertencente ao minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA) da Leishmania Viannia braziliensis, espécie identificada com esta patologia em Pernambuco. Os resultados revelaram 48,7% de indivíduos positivos para a PCR, dos quais 31% tinham sido tratados e considerados clinicamente curados por apresentarem a lesão cicatrizada. Esses achados demonstram que: a) o sangue venoso pode ser utilizado como ferramenta para diagnóstico; b) a ausência de lesão nem sempre corresponde a uma PCR negativa; c) a existência de DNA circulante de parasita em indivíduos tratados, chama atenção para a possível presença do mesmo e conseqüente risco de recidiva; d) o tratamento preconizado não parece ser capaz de eliminar completamente os parasitas

Leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e se apresentam sob forma tegumentar ou visceral. No Brasil, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada, na sua maioria, por Leishmania (Viannia) braziliensis e conhecem-se principalmente as formas cutânea (LC), mucosa (LM) e disseminada (LD) da doença. Na LTA as formas clínicas tem sido atribuídas a diferenças na resposta imune do hospedeiro, mas recentemente vinculam-se também à variabilidade intraespecífica da L. (V.) braziliensis. Neste estudo avaliamos se haveria variabilidade biológica nos isolados de L. (V.) braziliensis, provenientes de pacientes com LC, LM e LD, principalmente em resposta a fator de crescimento insulina-símile-I (IGF-I). Os fatores de crescimento do hospedeiro tem sido alvo de estudos no desenvolvimento das leishmanioses, sendo IGF-I um deles. Havíamos demonstrado em estudos anteriores, utilizando Leishmania (Leishmania) amazonensis, que IGF-I induz proliferação, aumentando a atividade da arginase, com geração de poliaminas e diminuindo a síntese de óxido nítrico. No presente estudo analisamos o efeito de IGF-I em L.(V.) braziliensis, espécie prevalente no Brasil. Avaliamos inicialmente as características dos diferentes isolados enquanto promastigota e no prosseguimento enquanto amastigota em células de linhagem monocítica humana THP-1, com e sem estímulo de IGF-I. Nossos dados sugerem que há diferenças na atividade da arginase basal entre os isolados de L. (V.) braziliensis, sendo maior naqueles provenientes de pacientes com LM. IGF-I aumentou a atividade da arginase nos isolados de LC e LD, mas não de LM. Nos isolados em forma amastigota nas células de linhagem monocítica humana THP-1, o efeito de IGF-I foi de aumento do parasitismo nos isolados de LC e LM e de diminuição com os de LD. Nos isolados de LD a atividade da arginase basal foi menor que nos de LC. Por outro lado, a produção de óxido nítrico tendeu a ser maior em isolados de LD quando sob estímulo de IGF-I. Os dados sugerem que diferenças nas características biológicas dos parasitos podem contribuir na apresentação clínica dos casos da LTA. / Leishmaniasis are diseases caused by protozoa of the genus Leishmania that may manifest as cutaneous or visceral disease. In Brazil, American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused mostly by Leishmania (Viannia) braziliensis and cutaneous (CL), mucosal (ML) and disseminated (DL) forms of the disease are known.The diversity of clinical manifestations has been attributed to differences in the host immune response, but recently it has also been related to intraspecific variability of L. (V.) braziliensis. In the present study we evaluated whether there were biological variability in different isolates of L. (V.) braziliensis from patients with CL, ML, and DL, mainly in response to insulin-like growth factor-I (IGF-I). Growth factors of the host have been investigated in the development of leishmaniasis including IGF-I. In previous studies using Leishmania (Leishmania) amazonensis IGF-I was shown to induce proliferation, to increase the activity of arginase, generating polyamines and to decrease the synthesis of nitric oxide. In this study we analyzed the effect of IGF-I in L. (V.) braziliensis, a species prevalent in Brazil. Initially we evaluated the characteristics of individual isolates as promastigote and further as amastigote within human macrophage cell line THP-1 with and without IGF-I stimulation. Our data suggest that there are differences in the basal arginase activity amongst isolates of L. (V.) braziliensis, being higher in those from patients with ML. IGF-I increased the activity of arginase in the isolates of CL and DL, but not of ML. In isolates in the form of amastigotes within THP-1 cells, IGF-I induced the increase of parasitism of isolates from CL and ML, and decrease of those from DL. In isolates of DL the basal arginase activity was lower than in those of CL. Moreover, the production of nitric oxide tended to be higher with isolates of DL upon IGF-I stimulation. The data suggest that differences in the biological characteristics of parasites may contribute to the diversity of clinical presentation of ATL.

No ciclo natural de transmissão da leishmaniose, as fêmeas infectadas de flebotomíneos regurgitam promastigotas na pele de hospedeiro junto com a saliva. Tem sido descrito que componentes da saliva do vetor possuem propriedades imunomodulatórias que facilitam o estabelecimento da infecção no hospedeiro, contudo a maior parte dos estudos emprega lisado de glândula salivar (LGS) de vetores colonizados em laboratório. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a especificidade do LSG dos flebotomíneos Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus capturados no campo na infectividade de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Camundongos BALB/c foram inoculados no coxim plantar traseiro com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na ausência ou presença do LGS de L. flaviscutelata, e L. (P.) complexus. A evolução da infecção foi acompanhada semanalmente e biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para análise histopatológica e determinação de carga parasitária na 4ª e 8ª semana pós-infecção (PI); e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram também cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-10, IL- 12 e IL-4) no sobrenadante. A infecção por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis não se mostrou exacerbada nos grupos co-inoculados com o LGS de ambas as espécies em relação ao grupo controle, inoculado somente com o parasito. O tamanho de lesão e carga parasitária do grupo controle foi maior ou igual aos grupos com saliva. Na infecção por L. (L.) amazonensis houve diminuição dos linfócitos CD4+ e aumento na população de linfócitos CD8+ enquanto na infecção por L. (V.) braziliensis houve manutenção da população de linfócitos CD4+ e aumento de linfócitos CD8+ em todos os grupos quando comparados ao grupo saudável. A produção de IL-10 e IL-12, não diferiram entre os grupos, assim como a produção de IL-4 no grupo infectado por L. (V.) braziliensis. No entanto, nos grupos infectados apenas com L. (L.) amazonensis e com saliva de L. flaviscutellata, foi observada uma maior produção de IL-4 em relação ao grupo saudável. De forma geral, os resultados mostraram que a saliva de L. flaviscutellata e de Lutzomyia (P.) complexus, no seu binômio natural vetor/parasito ou não, não favoreceram o estabelecimento da infecção causada por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c. / During the natural transmission of leishmaniasis, the infected female phlebotomine regurgitates promastigotes into the host\'s skin together with the saliva. It has been reported that components of vector saliva contain immunomodulatory properties that facilitate the establishment of infection in the host, however the most studies employed salivary gland lysate (SGL) of laboratory colonized vectors. Thus, the main objective of this study was to evaluate the specificity of SGL of the phlebotomines Lutzomyia flaviscutellata and Lutzomyia (Psychodopygus) complexus caught in the field in the infectivity of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. BALB/c mice were inoculated in the hind footpad with promastigotes of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in the absence or presence of L. flaviscutelata, and L. (P.) complexus SGL. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and biopsies from the site of infection were collected for histopathological analysis and determination of parasite load in the 4th and 8th week post infection (PI), and the draining lymph node to characterize subsets of T cells by flow cytometry. The draining lymph nodes cells were also cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-10, IL-12 and IL-4) in the supernatant. L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis infection was not exacerbated in the groups co-inoculated with the SGL of both species in the control group, only inoculated with the parasite. The lesion size and parasite burden of the control group was higher or equal to the groups with saliva. In L. (L.) amazonensis infection there was a decrease of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells while in L. (V.) braziliensis infection there was a maintenance of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells in all groups compared with the health group. The production of IL-10 and IL-12, did not differ between groups, as well as the production of IL-4 in the group infected by L. (V.) braziliensis. However, in the groups infected only with L. (L.) amazonensis in the presence of L. flaviscutellata saliva, it was observed a higher production of IL-4 in relation with the health group. As a whole, the results show that the saliva of L. flaviscutellata and L. (P.) complexus, in the natural vector/parasite binomium or not, did not favor the establishment of the infection caused by L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in BALB/c mice

No ciclo natural de transmissão da leishmaniose, as fêmeas infectadas de flebotomíneos regurgitam promastigotas na pele de hospedeiro junto com a saliva. Tem sido descrito que componentes da saliva do vetor possuem propriedades imunomodulatórias que facilitam o estabelecimento da infecção no hospedeiro, contudo a maior parte dos estudos emprega lisado de glândula salivar (LGS) de vetores colonizados em laboratório. Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a especificidade do LSG dos flebotomíneos Lutzomyia flaviscutellata e Lutzomyia (Psychodopygus) complexus capturados no campo na infectividade de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Camundongos BALB/c foram inoculados no coxim plantar traseiro com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na ausência ou presença do LGS de L. flaviscutelata, e L. (P.) complexus. A evolução da infecção foi acompanhada semanalmente e biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para análise histopatológica e determinação de carga parasitária na 4ª e 8ª semana pós-infecção (PI); e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram também cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-10, IL- 12 e IL-4) no sobrenadante. A infecção por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis não se mostrou exacerbada nos grupos co-inoculados com o LGS de ambas as espécies em relação ao grupo controle, inoculado somente com o parasito. O tamanho de lesão e carga parasitária do grupo controle foi maior ou igual aos grupos com saliva. Na infecção por L. (L.) amazonensis houve diminuição dos linfócitos CD4+ e aumento na população de linfócitos CD8+ enquanto na infecção por L. (V.) braziliensis houve manutenção da população de linfócitos CD4+ e aumento de linfócitos CD8+ em todos os grupos quando comparados ao grupo saudável. A produção de IL-10 e IL-12, não diferiram entre os grupos, assim como a produção de IL-4 no grupo infectado por L. (V.) braziliensis. No entanto, nos grupos infectados apenas com L. (L.) amazonensis e com saliva de L. flaviscutellata, foi observada uma maior produção de IL-4 em relação ao grupo saudável. De forma geral, os resultados mostraram que a saliva de L. flaviscutellata e de Lutzomyia (P.) complexus, no seu binômio natural vetor/parasito ou não, não favoreceram o estabelecimento da infecção causada por L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c. / During the natural transmission of leishmaniasis, the infected female phlebotomine regurgitates promastigotes into the host\'s skin together with the saliva. It has been reported that components of vector saliva contain immunomodulatory properties that facilitate the establishment of infection in the host, however the most studies employed salivary gland lysate (SGL) of laboratory colonized vectors. Thus, the main objective of this study was to evaluate the specificity of SGL of the phlebotomines Lutzomyia flaviscutellata and Lutzomyia (Psychodopygus) complexus caught in the field in the infectivity of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis. BALB/c mice were inoculated in the hind footpad with promastigotes of L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in the absence or presence of L. flaviscutelata, and L. (P.) complexus SGL. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and biopsies from the site of infection were collected for histopathological analysis and determination of parasite load in the 4th and 8th week post infection (PI), and the draining lymph node to characterize subsets of T cells by flow cytometry. The draining lymph nodes cells were also cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-10, IL-12 and IL-4) in the supernatant. L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis infection was not exacerbated in the groups co-inoculated with the SGL of both species in the control group, only inoculated with the parasite. The lesion size and parasite burden of the control group was higher or equal to the groups with saliva. In L. (L.) amazonensis infection there was a decrease of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells while in L. (V.) braziliensis infection there was a maintenance of CD4+ cells and an increase in the population of CD8+ cells in all groups compared with the health group. The production of IL-10 and IL-12, did not differ between groups, as well as the production of IL-4 in the group infected by L. (V.) braziliensis. However, in the groups infected only with L. (L.) amazonensis in the presence of L. flaviscutellata saliva, it was observed a higher production of IL-4 in relation with the health group. As a whole, the results show that the saliva of L. flaviscutellata and L. (P.) complexus, in the natural vector/parasite binomium or not, did not favor the establishment of the infection caused by L. (L.) amazonensis and L. (V.) braziliensis in BALB/c mice