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Les résultats présentés dans cette thèse précisent certains aspects de la fonction du cotransporteur Na+/glucose (SGLT1), une protéine transmembranaire qui utilise le gradient électrochimique favorable des ions Na+ afin d’accumuler le glucose à l’intérieur des cellules épithéliales de l’intestin grêle et du rein. Nous avons tout d’abord utilisé l’électrophysiologie à deux microélectrodes sur des ovocytes de xénope afin d’identifier les ions qui constituaient le courant de fuite de SGLT1, un courant mesuré en absence de glucose qui est découplé de la stoechiométrie stricte de 2 Na+/1 glucose caractérisant le cotransport. Nos résultats ont démontré que des cations comme le Li+, le K+ et le Cs+, qui n’interagissent que faiblement avec les sites de liaison de SGLT1 et ne permettent pas les conformations engendrées par la liaison du Na+, pouvaient néanmoins générer un courant de fuite d’amplitude comparable à celui mesuré en présence de Na+. Ceci suggère que le courant de fuite traverse SGLT1 en utilisant une voie de perméation différente de celle définie par les changements de conformation propres au cotransport Na+/glucose, possiblement similaire à celle empruntée par la perméabilité à l’eau passive. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à estimer la vitesse des cycles de cotransport de SGLT1 à l’aide de la technique de la trappe ionique, selon laquelle le large bout d’une électrode sélective (~100 μm) est pressé contre la membrane plasmique d’un ovocyte et circonscrit ainsi un petit volume de solution extracellulaire que l’on nomme la trappe. Les variations de concentration ionique se produisant dans la trappe en conséquence de l’activité de SGLT1 nous ont permis de déduire que le cotransport Na+/glucose s’effectuait à un rythme d’environ 13 s-1 lorsque le potentiel membranaire était fixé à -155 mV. Suite à cela, nous nous sommes intéressés au développement d’un modèle cinétique de SGLT1. En se servant de l’algorithme du recuit simulé, nous avons construit un schéma cinétique à 7 états reproduisant de façon précise les courants du cotransporteur en fonction du Na+ et du glucose extracellulaire. Notre modèle prédit qu’en présence d’une concentration saturante de glucose, la réorientation dans la membrane de SGLT1 suivant le relâchement intracellulaire de ses substrats est l’étape qui limite la vitesse de cotransport. / The results presented in this thesis clarify certain functional aspects of the Na+/glucose cotransporter (SGLT1), a membrane protein which uses the downhill electrochemical gradient of Na+ ions to drive the accumulation of glucose in epithelial cells of the small intestine and the kidney. We first used two microelectrodes electrophysiology on Xenopus oocytes to indentify the ionic species mediating the leak current of SGLT1, a current measured in the absence of glucose that is uncoupled from the strict 2 Na+/1 glucose stoichiometry characterising cotransport. Our results showed that cations such as Li+, K+ and Cs+, which interact weakly with SGLT1 binding sites and are unable to generate the conformational changes that are triggered by Na+ binding, were however able to generate leak currents similar in amplitude to the one measured in the presence of Na+. This suggests that the leak current permeating through SGLT1 does so using a pathway that differs from the conformational changes associated with Na+/glucose cotransport. Moreover, it was found that the cationic leak and the passive water permeability could share a common pathway. We then sought to estimate the turnover rate of SGLT1 using the ion-trap technique, where a large tip ion-selective electrode (~100 μm) is pushed against the oocyte plasma membrane, thus enclosing a small volume of extracellular solution referred to as the trap. The variations in ionic concentration occurring in the trap as a consequence of SGLT1 activity made it possible to assess that the turnover rate of Na+/glucose cotransport was 13 s-1 when the membrane potential was clamped to -155 mV. As a last project, we focused our interest on the development of a kinetic model for SGLT1. Taking advantage of the simulated annealing algorithm, we constructed a 7-state kinetic scheme whose predictions accurately reproduced the currents of the cotransporter as a function of extracellular Na+ and glucose. According to our model, the rate limiting step of cotransport under a saturating glucose concentration is the reorientation of the empty carrier that follows the intracellular release of substrates.

L’eugénol permet d’induire une anesthésie chirurgicale chez la grenouille africaine à griffes (Xenopus laevis) sans causer de lésions chez des grosses grenouilles (90-140g). Le premier objectif de la présente étude était de déterminer la durée de l’anesthésie et d’évaluer la dépression du système nerveux central ainsi que les changements de saturation en oxygène et de fréquence cardiaque chez des petites (7.5 ± 2.1 g) et moyennes (29.2 ± 7.4 g) grenouilles Xenopus laevis en fonction du temps d’exposition à un bain d’eugénol de 350 µL/L. Suite à une immersion de 5 ou 10 minutes, la réponse au test à l’acide acétique, au réflexe de retrait et au réflexe de retournement était absente pendant 1 heure (petites grenouilles) et 0,5 heure (moyennes) et l’anesthésie chirurgicale durait au maximum 15 et 30 minutes chez les petites et moyennes grenouilles respectivement. La saturation en oxygène n’était pas affectée de façon significative, mais la fréquence cardiaque était diminuée jusqu’à 1 heure post-immersion dans les deux groupes. Le deuxième objectif était de déterminer la toxicité de l’eugénol chez des grenouilles de taille moyenne après une ou trois administrations à une dose anesthésique, avec ou sans période de récupération d’une semaine. Histologiquement, il y avait de l’apoptose tubulaire rénale et des membranes hyalines pulmonaires après une administration, et de la nécrose hépatique et des hémorragies dans les tissus adipeux après trois administrations. Ces résultats suggèrent que le poids corporel est un paramètre important à considérer lors de l’anesthésie de grenouilles Xenopus laevis par immersion dans l’eugénol. / Eugenol has been shown to induce surgical anesthesia in African clawed frogs (Xenopus laevis) without causing lesions after a single administration in large frogs (90-140g). The first objective of this study was to determine the duration of anesthesia in small (7.5 ± 2.1 g) and medium (29.2 ± 7.4 g) Xenopus laevis frogs and evaluate CNS depression and changes in oxygen saturation and heart rate relative to exposure time in a eugenol bath (350 µL/L). After immersion for 5 or 10 minutes, no responses to the acetic acid test (AAT), withdrawal reflex, and righting reflex were seen for 1 h (small frogs) or 0.5 h (medium frogs), and small and medium frogs were under surgical anesthesia for a maximum of 15 and 30 minutes respectively. Oxygen saturation was not significantly affected by anesthesia, but heart rate was depressed for as long as 1 hour post-exposure in both groups of frogs. The second objective was to determine the toxicity of eugenol in medium frogs after one or three administrations at anesthetic doses, with or without a 1 week recovery period. Histopathology revealed renal tubular apoptosis and pulmonary hyaline membranes after 1 administration, as well as hepatic necrosis and adipose tissue hemorrhages after 3 administrations. These results suggest that body weight is an important parameter to consider when using a eugenol bath for anesthesia of Xenopus laevis frogs.

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La crête neurale (CN) est une structure transitoire apparaissant en bordure de la plaque neurale chez les embryons de vertébrés. Au cours du développement embryonnaire, les cellules de la CN prolifèrent, subissent une transition épithélio-mésenchymateuse, migrent et se différencient en de nombreux types cellulaires tels que des neurones et cellules gliales du système nerveux périphérique, des mélanocytes, des cellules musculaires lisses ou des élements du squelette cranio-facial. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules de la CN, nous avons étudié le rôle de deux facteurs de transcription, Hairy2 et Stat3, via des expériences de perte et gain de fonction chez l’embryon de xénope. <p>Le gène Hairy2 code pour un facteur de transcription bHLH-O répresseur. Il est exprimé précocement au niveau de la bordure de la plaque neurale incluant la CN présomptive. Nous avons montré que Hairy2 est requis pour la prolifération des cellules de la CN en aval de signaux FGFs et qu’il maintient les cellules dans un état indifférencié en réprimant l’expression précoce des gènes spécifiques de la CN. Hairy2 réprime aussi la transcription du gène Id3 codant pour un facteur HLH essentiel à la prolifération des cellules de la CN. Id3 affecte également Hairy2. Nous avons observé que la protéine Id3 interagit physiquement avec Hairy2 et bloque son activité, démontrant que les interactions entre Hairy2 et Id3 jouent un rôle important dans la prolifération et la spécification des cellules de la CN. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Extrazelulläre Purine und Pyrimidine sind wichtige Signalmoleküle, die über membranständige Rezeptoren, so genannte purinerge Rezeptoren ihre biologischen Effekte vermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurden ATP-induzierte Antworten in den Stützzellen des olfaktorischen Epithels mit Hilfe der Calcium-Imaging-Technik charakterisiert.Die Applikation von ATP induzierte Zunahmen der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) sowohl in Anwesenheit, als auch in Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium. Anders bei Anwendung von CPA, einem spezifischen Hemmstoff der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen bzw. endoplasmatischen Retikulums. In diesen Versuchen wurden die ATP-induzierten [Ca2+]i-Zunahmen komplett aufgehoben. Das zeigt, dass die ATP-induzierten [Ca2+]i-Zunahmen in Stützzellen größtenteils, wenn nicht vollständig, durch die Aktivierung von G-Protein gekoppelten P2Y-Rezeptoren ausgelöst werden. Die ermittelte Wirkpotenz purinerger Agonisten war UTP>ATP>ATPγS. Die ATP-induzierten [Ca2+]i-Zunahmen konnten durch die purinergen Antagonisten PPADS und RB2 reduziert werden. Die hemmende Wirkung des purinergen Antagonisten Suramin blieb aus. Zusammen weisen die oben genannten Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass extrazelluläre Nukleotide die Stützzellen des olfaktorischen Epithels über P2Y2 / P2Y4-artige Rezeptoren aktivieren. Zusätzlich zeigten die Versuche mit dem Ektonukleotidase-Hemmstoff ARL 67156, dass im olfaktorischen Epithel von larvalen Xenopus laevis eine hohe Ektonukleotidasenaktivität herrscht.

Proteins are known to form functional clusters in plasma membranes. In order to identify individual proteins within clusters we developed a method to visualize by atomic force microscopy (AFM) the cytoplasmic surface of native plasma membrane, excised from Xenopus laevis oocyte and spread on poly-L-lysine coated glass. After removal of the vitelline membrane intact oocytes were brought in contact with coated glass and then rolled off. Inside-out oriented plasma membrane patches left at the glass surface were first identified with the lipid fluorescent marker FM1-43 and then scanned by AFM. Membrane patches exhibiting the typical phospholipid bilayer height of 5 nm showed multiple proteins, protruding from the inner surface of the membrane, with heights of 5 to 20 nm. Modelling plasma membrane proteins as spherical structures embedded in the lipid bilayer and protruding into the cytoplasm allowed an estimation of the respective molecular masses. Proteins ranged from 35 to 2,000 kDa with a peak value of 280 kDa. The most frequently found membrane protein structure (40/μm2) had a total height of 10 nm and an estimated molecular mass of 280 kDa. Membrane proteins were found firmly attached to the poly-L-lysine coated glass surface while the lipid bilayer was found highly mobile. We detected protein structures with distinguishable subunits of still unknown identity. Since X. laevis oocyte is a generally accepted expression system for foreign proteins, this method could turn out to be useful to structurally identify specific proteins in their native environment at the molecular level. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit die Reproduktionsbiologie von aquatischen Lebewesen durch die Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen (endocrine disruptors, ED) beeinflusst wird. Mit dem Amphib Xenopus laevis steht ein etabliertes Studienmodell zur Untersuchung der Wirkungen von ED auf die Reproduktionsbiologie zur Verfügung, das für die vorliegenden Studien modifiziert und erweitert sowie mit gewässeranalytischen Methoden verknüpft wurde. Die Gefährdung wasserlebender Tiere durch Gewässerbelastung mit ED kann erfasst werden, indem die Wirkung einer ausgewählten Einzelsubstanz auf die Reproduktionsbiologie untersucht wird. Anschließend erfolgt ein Nachweis der Substanz in Umweltproben. Durch Expositionsversuche, histologische Untersuchungen und Expressionsnachweis eines molekularen östrogenen Biomarkers konnte festgestellt werden, dass Bisphenol A (BPA) in Kaulquappen von Xenopus laevis verweiblichend wirkt und seine Effekte über eine Bindung an den Östrogenrezeptor vermittelt. Chemische Analysen während der Expositionsversuche zeigten, dass BPA von den Kaulquappen aufgenommen wird und dass eine geringe Abbaubarkeit der Substanz während eines Zeitraums von 48 Stunden besteht. Die Analyse von BPA in Wasserproben, die aus dem Fluss Alb oder aus Kläranlagenausläufen stammten, zeigte, dass BPA im Gewässer in relevanten Konzentrationen vorhanden ist und hauptsächlich durch eine Kläranlage in den Fluss eingeleitet wird. In einem Gewässer liegt allerdings ein Gemisch aus unterschiedlichen ED mit verschiedenen Wirkmechanismen vor. Die Gewässerbelastung mit endokrin wirksamen Substanzen kann weiterhin untersucht werden, indem Gewässerextrakte fraktioniert und in in vitro-Screeningmethoden getestet werden. Als Screeningmethoden dienten Rezeptorbindungsstudien an Östrogen- und Androgenrezeptoren sowie die Behandlung von Leberzellkulturen mit den Gewässerextrakten aus der Alb, um eine Regulation der Expression bestimmter Biomarkergene durch potenzielle ED nachzuweisen. Dazu wurde als neuer (anti)androgener und (anti)östrogener Biomarker das Retinol-binding Protein eingeführt. Die Untersuchung der Gewässerextrakte mit diesen Methoden zeigte, dass die Alb eine Belastung mit endokrin wirksamen Substanzen aufweist und dass hauptsächlich östrogen wirksame Substanzen vorkommen. Die Proben aus den Kläranlagenausläufen weisen die höchste endokrine Aktivität auf. / The present study examined the influence of endocrine active compounds (endocrine disruptors, ED), which are present in surface waters, on reproductive biology of aquatic organisms. The amphibian Xenopus laevis is a well-established model organism for the study of effects of ED on reproduction. It has been modified and broadened for the purpose of this study, and it was combined with chemical methods for water analyses. It is possible to assess water pollution with ED by detecting effects on repro-ductive biology of one particular substance, and then by looking for this substance in environmental water samples. We showed the feminizing potency of Bisphenol A (BPA) in conducting exposure experiments with tadpoles, in examining histological samples of gonads and in detecting the induction of the expression of a molecular estrogenic biomarker. BPA was recognized to mediate its effects via binding to the estrogen receptor. Moreover, analysis of BPA during exposure experiments revealed that BPA is taken up by tadpoles and is not readily degradable during a time period of 48 hours. Chemical analyses of environmental water samples from the river Alb or samples from sewage treatment works (STW) showed that BPA is released into the environment by STW effluents. In surface waters, there are different kinds of ED with different modes of action. Thus, it is another possibility to assess water pollution with ED by fractionating environmental water samples and by testing these fractions in rapid in vitro-screening methods. In the present work, receptor binding assays were carried out, both examining the binding to estrogen and androgen receptors. Furthermore, Xenopus laevis hepatocyte cultures were treated with fractions of environmental samples and biomarker expression was detected. A new biomarker to assess (anti)androgenic or (anti)estrogenic modes of action, respectively, was established. This new biomarker was the Retinol-binding Protein. The results obtained by these methods revealed that the river Alb is mainly polluted with estrogenic ED. Samples from STW effluents possessed the highest endocrine activity.