La mucoviscidose est la maladie génétique récessive la plus fréquente dans les populations caucasiennes. Elle est dûe à des mutations dans le gène CFTR qui code pour une protéine qui a une fonction canal chlorure et qui est exprimée au pôle apical des épithéliums sécrétoires. La mutation la plus fréquente F508del altère le repliement de la protéine, induisant sa dégradation précoce par le protéasome et son absence à la membrane plasmique. La recherche fondamentale se focalise sur la protéine mutée et cherche à découvrir des molécules capables d’adresser celle-ci au pôle apical des cellules épithéliales où elle pourra remplir sa fonction de canal chlorure. Au sein du laboratoire, nous nous intéressons aux interactions de la protéine CFTR/ F508del-CFTR avec d’autres protéines. Nous avons déjà montré l’existence d’une interaction non voulue entre F508del-CFTR et un filament intermédiaire, la cytokératine 8. En combinant une approche in-silico et du criblage haut débit, nous avons identifié des molécules capables d’interrompre ces interactions. Des tests fonctionnels sur des lignées cellulaires ainsi que sur des modèles murins ont montré une restauration de la fonction canal chlorure après traitements avec ces molécules. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’une d’entre elles qui est la molécule « c407 ». L’objectif de ma thèse était de comprendre les mécanismes d’action de cette molécule. J’ai également évalué l’efficacité des traitements actuels dans le contexte des allèles complexes de F508del-CFTR. Dans une seconde partie de ma thèse, j’ai étudié l’effet d’une cytokine (TNFα) sur la protéine mutée F508del-CFTR. De façon inattendue, j’ai observé que le TNFα, à des concentrations physiologiques, corrige le défaut de routage de la protéine F508del-CFTR. Cette observation pourrait expliquer une fonction résiduelle de la F508del-CFTR chez certains patients atteints de mucoviscidose. En conclusion, mes travaux ont permis de préciser les mécanismes d’action d’un correcteur et de découvrir un effet inattendu d’une cytokine pro-inflammatoire. Ces travaux permettent de relier la correction d’un défaut de routage au processus inflammatoire ouvrant ainsi un nouveau champ d’investigation. / Cystic fibrosis is due to the loss of epithelial chloride transport caused by mutations in the CFTR gene, the most frequent mutation being F508del. One of the strategies developed to find new treatment for Cystic fibrosis (CF) is to discover compounds that correct the trafficking of F508del-CFTR to the plasma membrane. Using hypothesis-driven approach and combining modeling of NBD1, molecular docking and functional assays, we identified 4 compounds that correct F508del-CFTR function in cells (including human primary bronchial cells in culture) and F508del mice. New correctors probably act by interrupting the interaction between F508del-CFTR with keratin 8 (Odolczyk et al EMBO Mol Med 2013). During my PhD, I focused on one of those molecules, the "c407" molecule. The aim of my thesis was to investigate the mechanisms of action of this molecule. I have also evaluated the effectiveness of current treatments in the context of complex alleles F508del-CFTR. In the second part of my thesis, I studied the effect of a cytokine (TNFα) on the protein F508del-CFTR. Unexpectedly, I observed that the TNFα at physiological concentrations, corrects the trafficking of F508del-CFTR protein. This observation could explain a residual function of F508del-CFTR in some CF patients. In conclusion, my thesis helped to clarify the mechanisms of action of new correctors of F508del-CFTR.

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1. / Voltage-activated Ca2+ channels (CaV) are membrane proteins that play a key role in promoting Ca2+ influx in response to membrane depolarization in excitable cells. They form oligomeric complexes that are classified according to the structural properties of the pore-forming CaVα1 subunit. Auxiliary CaVβ subunits modulate cell-surface expression and voltage-dependent gating of high-voltage-activated (HVA) CaV1 and CaV2 α1 subunits. CaVβ subunits are formed by a Src homology-3 (SH3) domain and a guanylate kinase-like (GK) domain connected through a variable HOOK-domain. In order to identify the residues responsible for the CaVβ3-induced membrane density of CaV2.3, we produced mutants along CaVβ3’s fonctionnal domains. Complete deletion of the SH3 domain as well as deletion of the HOOK domain did not alter plasma membrane targeting of CaV2.3 nor its typical activation gating. In contrast, 5-residue deletions in the GK domain disrupted cell surface trafficking and functional expression of CaV2.3. Mutations of residues known to carry nanomolar affinity binding in the GK domain of CaVβ did not significantly alter cell surface density. Mutations of a quartet of leucine residues in the α3, α6, β10, and α9 regions of the GK domain, each expected to curtail protein-protein interaction, were found to significantly impair cell surface targeting of CaV2.3 channels. Altogether, our results confirm that the GK domain includes the molecular determinants carrying the chaperone function of CaVβ. However, CaVβ-induced cell surface targeting appears to be determined by structural elements that are not strictly dominated by high-affinity binding of CaVβ onto CaVα1.

L'Internet est devenu sans conteste en trois décades le support matériel majeur de l'ère de l'information. Durant cette courte période, il a subi deux mutations importantes. Tout d'abord, il a subi une mutation de taille : de quelques dizaines de systèmes interconnectés suivant une topologie fixée et bien connue, l'Internet est passé à une taille phénoménale de plus de 285 millions d'hôtes suivant une topologie désormais à dimension libre dûe au fait que son développement n'est plus centralisé. De plus, il a subi une mutation de forme : nous sommes passés des gros systèmes interconnectés par de simples lignes téléphoniques à des ordinateurs personnels mobiles interconnectés par des technologies radio en bordure de réseau et par des routeurs gigabits reliés par fibre optique en coeur de réseau. Ces deux mutations entraînent deux défis importants pour les chercheurs qui oeuvrent à l'amélioration de l'Internet. Premièrement, il est nécessaire de connaître avec le plus de précision possible, la topologie de l'Internet. Seules des méthodes macroscopiques et statistiques permettent désormais de connaître cette topologie car plus personne n'a autorité sur l'organisation et l'expansion du réseau Internet. De plus, étant donné sa dynamicité, il est aussi souhaitable que cette topologie soit mise à jour fréquemment. Deuxièmement, l'évolution rapide des technologies a fait que les paradigmes qui sous-tendaient à la création des protocoles initiaux de l'Internet ne sont plus valables à l'heure actuelle. Les notions de mobilité, de sécurité et de diffusion quasi-inexistantes à l'origine sont désormais ardemment souhaitées par les utilisateurs mais difficiles à mettre en oeuvre dans les protocoles actuels. Il faut donc trouver les moyens d'offrir ces nouvelles fonctionnalités en conservant les propriétés initiales des protocoles qui ont fait le succès d'Internet. Dans ce mémoire d'habilitation, nous présentons des contributions qui tentent de répondre à certains aspects de ces deux défis majeurs. Nous nous concentrons tout particulièrement sur la cartographie de l'Internet, le stockage d'états dans les routeurs exécutant des protocoles multipoints, l'implémentation de fonctionnalités réseaux dans les hôtes et la conception de réseaux recouvrants.

La réalisation de microsystèmes de multidétection et sans marquage pour la reconnaissance de biomolécules est d'un intérêt fondamental pour la réalisation de tests rapides dédiés au diagnostic biologique. Ces développements nécessitent une méthode d'adressage des sondes de capture sur une plateforme multiplexée associée à une méthode d'analyse sensible. Dans cette étude, la méthode de détection choisie pour les tests développés sur la puce est la voltampérométrie cyclique, et le férrocène a été utilisé pour la modification de sondes oligonucléotidiques de type tige-boucle. Une stratégie d'électroadressage a été développée sur surface d'or. Elle a été réalisée via chimie " click " entre un alcyne et un azoture. Cette réaction peut être électro-catalysée en maintenant le catalyseur cuivre sous sa forme active par l'application d'un potentiel à l'électrode. Une première entité chimique de petite taille, constituée de deux groupements dithiol phosphate et d'un groupement hexynyle a été synthétisé par synthèse supportée et greffée sur électrode d'or. Par la suite, différents éléments ont été immobilisés par chimie " click ". Un dérivé ferrocène porteur d'une fonction azoture a été utilisé pour la détermination des conditions optimales de cette chimie. Puis, cette méthode a été exploitée pour l'immobilisation de nanoparticules fluorescentes et de protéines par l'intermédiaire de la formation du complexe biotine/streptavidine. Enfin, cette méthode a permis l'électroadressage de sondes de capture oligonucléotidiques de type tige-boucle, modifiées par des ferrocènes. Des tests d'hybridation ADN ont été menés en milieu complexe avec une limite de détection déterminée à 100fM

La membrane cellulaire est la barrière qui sépare l'intérieur des cellules de l'environnement extérieur. Elle se compose de lipides et de protéines. Les gènes codant pour les protéines membranaires représentent environ 30% des génomes. Les protéines membranaires sont synthétisées dans le cytosol par les ribosomes, mais suivent des voies spécifiques pour s'intégrer dans la membrane cellulaire. Les ribosomes en cours de traduction de protéines membranaires sont reconnus dans le cytosol et adressés à la membrane. Par la suite, les chaînes naissantes de protéines membranaires sont insérées dans la bicouche lipidique puis repliées de façons appropriées, ce mécanisme s'appelle la translocation. Le processus d'adressage est médiée par la particule de reconnaissance du signal (SRP) et son récepteur, tandis que la translocation est effectuée par un certain nombre de complexes de protéines membranaires.Cette thèse décrit deux des complexes impliqués dans cet adressage et translocation co-traductionnelle chez Escherichia coli : Le complexe ribosome-SRP-FtsY pour l'adressage en conformation «fermé» et le complexe dans lequel le ribosome est lié à l'holo-translocon (HTL) qui se compose de sept protéines membranaires. J'ai utilisé principalement la cryo-microscopie électronique pour caractériser ces complexes. La cryo-EM permet de déterminer la structure des échantillons biologiques à une résolution supérieure au nanomètre dans leur environnement natif, sans avoir à le cristalliser. Dans ce travail, j'ai bénéficié des améliorations récentes dans l'équipementet le traitement d'image.A partir d'un ensemble de données de cryo-EM obtenu par les membres du groupe, j‘ai déterminé la structure du complexe ribosome-SRP-FtsY en conformation «fermé» avec une résolution de 5.7 Å. Différentes stratégies de tri des calculsont été appliquées pour identifier la partie la plus homogène de l'ensemble des données. La structure montre un domaine bien résolu SRP ARN et SRP M avec une séquence signal liée. L'interaction entre les SRP et le ribosome pourrait être modélisée avec une grande fidélité. Cette structure révèle également que les GTPases SRP-ftsY sont détachées de la tétra-boucle de l'ARN et sont flexibles, libérant alors le site de sortie du ribosomepermettant la liaison du translocons.Dans le second projet, différentes approches ont été poursuivis pour résoudre la structure du complexe ribosome-HTL à haute résolution. Une structure initiale à 22 Å a été obtenue en mélangeant HTL solubilisés en détergent avec des ribosomes, démontrantla possibilité de préserver le complexe dans les conditions utilisées pour la préparation des grilles. J'ai ensuite exploré l'utilisation de nanodiscs et un nouveau détergent appelé LMNG pour stabiliser HTL dans des tampons sans détergent. Un deuxième ensemble de données a ensuite été recueilli à partir d'échantillon obtenu par gradient de fixation, la structure a été résolue à 17 Å. La préparation des échantillons a été optimisée utilisant entre autre les amphipoles. On a montré que deux types d'amphipole-HTL peuvent se lier au ribosome, et des structures de plus grande résolution devrait être obtenu à partir de ces échantillons. / The cell membrane is the barrier that separates the interior of cells from the outside environment. It consists of lipids and proteins. Genes encoding membrane proteins make up about 30% of the genome. Membrane proteins are synthesized in the cytosol by ribosomes, but employ special pathways to integrate into the cell membrane. Ribosomes translating membrane proteins are recognized by special factors in the cytosol and targeted to the membrane. Subsequently, nascent chains of the membrane proteins are inserted into the lipid bilayer and are folded into their proper structures, a process termed translocation. The targeting process is mediated by the signal recognition particle (SRP) and its receptor, while the translocation is performed by a number of membrane protein complexes.This thesis describes two of the complexes involved in co-translational targeting and translocation in Escherichia coli: The ribosome-SRP-FtsY targeting complex in the “closed” conformation and the complex of a ribosome with the holo-translocon (HTL) consisting of seven membrane proteins. I mainly used electron cryo-microscopy to characterize these complexes. Cryo-EM allows structural determination of biological samples at sub-nanometer resolution in their native environment, without the need to crystallize the specimen. In this work, I took advantage of the recent advances in both the hardware and the image processing.Starting from a cryo-EM dataset obtained by group members, I have determined the structure of ribosome-SRP-FtsY complex in the “closed” conformation at 5.7 Å resolution. Different computational sorting strategies were applied to identify the most homogeneous sub-pool of the dataset. The structure shows a well-resolved SRP RNA and SRP M domain with a signal sequence bound. The interaction between SRP and ribosome could be modeled with high confidence. This structure also reveals that the SRP-FtsY GTPases are detached from the RNA tetraloop and are flexible, thus liberating the ribosomal exit site for binding of the translocation machinery.In the second project, different approaches were pursued to solve the structure of the ribosome-HTL complex at high resolution. An initial structure at 22 Å was obtained by mixing detergent-solubilized HTL with the ribosome, demonstrating that it is possible to preserve the complex under the conditions used for specimen preparation. I have then explored the use of nanodiscs and a new detergent called LMNG to stabilize HTL in detergent-free buffers. A second dataset was subsequently collected from a sample prepared by gradient-fixation, and the structure was solved at 17 Å. Sample preparation has been optimized further using amphipols. Two types of amphipol-HTL complexes were shown to bind to the ribosome, and higher resolution structures are expected to be obtained from these samples.

Les réseaux de capteurs sans fils linéaires (RdCSL) sont un cas particulier de réseaux de capteurs sans fils où les nœuds de capteurs sont déployés le long de multiples lignes. les RdCSL sont utilisés pour la surveillance des infrastructures routières, ferroviaires, des conduites de gaz, d’eau, de pétrole et de cours d’eau. Les solutions classiques de formation de topologie et d’adressage proposées ne sont pas adaptées à l’environnement des RdCSFL. En effet les paramètres initiaux utilisés par ces protocoles tels que le nombre maximum de nœuds fils (Cm), nombre maximum de nœuds routeurs fils Rm, profondeur maximum de l’arbre (Lm), occasionnent un gaspillage de l’espace d’adressage disponible pour les nœuds et limitent la profondeur de l’arbre adressable (15 sauts pour ZigBee). D’autres solutions adaptées pour les RdCSFL utilisent une organisation en cluster des nœuds du réseau et sont basées elles aussi sur des paramètres fixés à l’avance tels quel le nombre maximum de cluster fils par cluster. De plus, ces solutions requièrent beaucoup d’interventions manuelles sur les nœuds de capteurs (choix des chefs de cluster par exemple) et ne favorisent pas une adaptation face aux changements du RdCSL tels que l’ajout d’un ensemble de nœuds de capteurs. Dans cette thèse, nous proposons donc des protocoles permettant la construction automatique de topologies logiques, l’adressage et le routage pour des réseaux de capteurs sans fil linéaires. Nos protocoles fournissent aussi des mécanismes de gestion dynamique d’un RdSFL avec l’ajout de nouveaux nœuds, la réallocation d’adresses pour les nœuds en cas d’épuisement de blocs d’adresses et la gestion du routage vers plusieurs puits du réseau. Nos différents protocoles sont évalués grâce au simulateur Castalia/Omnet++. Les résultats de nos simulations montrent que nos protocoles permettent de construire un RdCSFL connecté avec peu de nœuds orphelins (nœuds sans adresses logiques) et sans limitations de profondeur. Nous montrons aussi, grâce à nos simulations, que nos contributions permettent d’ajouter un grand nombres de nœuds à un RdCSFL existant de n’importe quelle taille et s’adaptent au déploiement de plusieurs puits et au routage multi-puits et permettent d’améliorer le ratio et la latence de paquets livrés dans les RdCSFL. / Linear wireless sensor network (LWSN) are a sub-case of wireless sensor network where sensor nodes are roughly deployed through multiple long lines with branches. LWSN are used to monitor infrastructures such as roads, pipelines, and naturals entities such as rivers.Classical solutions of topology construction and addressing are inefficient on LWSN . Indeed, with initials networks parameters such as the maximum number of children per node (Cm), the maximum number of children routers per node (Rm), and the maximum tree depth, a solution like ZigBee causes a waste of available address space of network nodes and limit the depth of the addressable tree to 15 hops. Other solutions proposed for LWSN use a cluster-tree organisation and are based on initial network parameters such as the maximum number of children clusters per cluster. In addition, these solutions require a lot of manual intervention on different sensor nodes and do not allow adaptation for a network extension (addition of a set of new sensor nodes). In this thesis, we propose protocols to allow the automatic construction of topologies, the addressing and the data routing for linear wireless sensor networks. Our contribution also provides mechanisms for dynamic management of LWSN (addition of new nodes, addresses reallocation, and data routing to multiple sink nodes). Our different protocols are evaluated using Castalia/Omnet++ simulator. Results of our simulations show that our protocols allow a construction of connected LWSN with very few orphan nodes and without depth limitations. We also show that our contribution allows to add many new nodes on different LWSN, and adapts to the deployment of multiple sinks to improve the ratio and the latency of data delivery packets.

La multiplication de l'usage des équipements connectables à un réseau sans fil tels que les smartphones ou les objets connectés peut être mise à profit pour construire des réseaux reposant sur des communications de proximité : les appareils communiquent directement entre eux, sans le support d'une infrastructure centrale. On parle de réseau ad hoc. Ce type de réseau sans infrastructure est exploité dans de nombreux domaines comme le militaire ou la gestion de catastrophes naturelles. Pour certains cas d'utilisation, le passage à l'échelle, c'est-à-dire la capacité à fonctionner avec la croissance de la taille du réseau, est une propriété indispensable. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la problématique du routage sous l'aspect du passage à l'échelle. Le routage est la fonction responsable de l'acheminement des données au sein du réseau. Pour cela, des informations de contrôle sont échangées entre les nœuds du réseau. Mais le trafic associé à ces échanges peut être un frein pour passer à l'échelle. Afin de le réduire, nous proposons d'agréger les informations concernant des nœuds géographiquement proches. Dans un premier temps, nous mettons en place une structuration de la zone de déploiement du réseau en régions hiérarchiques. Ces régions servent d'agrégateur de nœuds à travers un adressage de ces derniers selon les régions auxquelles ils appartiennent. Par la suite, nous proposons un protocole de routage combinant les approches topologique et géographique. Il s'agit, pour un nœud donné, de maintenir des routes menant, d’une part, vers d'autres nœuds dans un voisinage proche et, d'autre part, vers des zones géographiques de plus en plus étendues au fur et à mesure de l'éloignement. Cette dernière propriété est obtenue en profitant de la structuration hiérarchique précédente des zones d'agrégation. Les résultats montrent la faculté de notre proposition à monter à grande échelle par rapport aux protocoles de routage ad hoc classique et aussi sa capacité à adresser les problèmes propres aux protocoles de routage purement géographique. / The widespread use of wireless devices such as smartphones and connected objects leads to an increasing emergence of infrastructure-less networks relying on device-to-device communication: ad hoc networks. Applications of this type of network vary widely from military operations to emergency situations. Scalability is a key property for some use cases involving a large number of devices, also called nodes. We mean by scalability, the ability of the network to increase in size without drastic loss of performance and with a cost-effective network maintenance. In this thesis, we focus on the scalability from a routing perspective. Routing handles the delivery of data packets from a source to a destination across the network. This is achieved by the exchange of information between nodes. The corresponding traffic may represent a break for scalability in presence of numerous nodes. In this work, we propose an aggregation of routing information. First, we partition the deployment area into smaller hierachical regions based on geographical coordinates. Nodes are assigned hierachical address depending on the regions they are located in. Then, we propose a mixed topological and geographical-based routing protocol. A node maintains precise routing information to other nodes in close proximity and geographically aggregate information for nodes at greater distances. Regions are the units of nodes aggregation. The further the nodes are, the larger the regions referring to them are. The results show that our proposition outperforms regular ad hoc routing in terms of scalability and addresses more efficiently geographical routing-related issues compared to classical geographical routing.

La réalisation de microsystèmes de multidétection et sans marquage pour la reconnaissance de biomolécules est d'un intérêt fondamental pour la réalisation de tests rapides dédiés au diagnostic biologique. Ces développements nécessitent une méthode d'adressage des sondes de capture sur une plateforme multiplexée associée à une méthode d'analyse sensible. Dans cette étude, la méthode de détection choisie pour les tests développés sur la puce est la voltampérométrie cyclique, et le férrocène a été utilisé pour la modification de sondes oligonucléotidiques de type tige-boucle. Une stratégie d'électroadressage a été développée sur surface d'or. Elle a été réalisée via chimie « click » entre un alcyne et un azoture. Cette réaction peut être électro-catalysée en maintenant le catalyseur cuivre sous sa forme active par l'application d'un potentiel à l'électrode. Une première entité chimique de petite taille, constituée de deux groupements dithiol phosphate et d'un groupement hexynyle a été synthétisé par synthèse supportée et greffée sur électrode d'or. Par la suite, différents éléments ont été immobilisés par chimie « click ». Un dérivé ferrocène porteur d'une fonction azoture a été utilisé pour la détermination des conditions optimales de cette chimie. Puis, cette méthode a été exploitée pour l'immobilisation de nanoparticules fluorescentes et de protéines par l'intermédiaire de la formation du complexe biotine/streptavidine. Enfin, cette méthode a permis l'électroadressage de sondes de capture oligonucléotidiques de type tige-boucle, modifiées par des ferrocènes. Des tests d'hybridation ADN ont été menés en milieu complexe avec une limite de détection déterminée à 100fM / This production of microsystem for label-free multi detection of biomolecules is fundamental for the realization of rapid tests dedicated to laboratory diagnosis. A viable method is requires to both address capture probes and to be associates with a sensitive analysis on multiplexed platform. In this study, the method chosen for detection on electrode is cyclic voltammetry, and ferrocene was used to modify stem-loop oligonucleotides. A strategy was developed for the electroadressing of probes on gold surface. It is performed through chemistry “click” between an alkyne and an azide. This reaction may be catalyzed by maintaining the correct potential to the electrode to form an active copper oxidation state on the surface. A first small chemical entity, containing two phosphate dithiol moieties and a hexynyl moiety was synthesized by supported chemistry and grafted on gold electrode. Thereafter, various elements were immobilized by chemistry “click”. Ferrocene derivative carrying an azide function was used to determine the optimal conditions for this chemistry. Then, this method has been exploited for the immobilization of proteins and fluorescent nanoparticles via the formation of biotin/streptavidin complex. Finally, this method allowed to electroaddress stem-loop oligonucleotids, designed as capture probes, modified by ferrocene. DNA hybridization tests were conducted in complex environments with a detection limit determined at 100 fM

L'objectif du travail de recherche concerne la conception et la réalisation de biocapteurs à base de mesures impédimétriques, pour lesquels la demande est forte dans différents domaines d'intérêt sociétal, en particulier l'environnement, la sécurité alimentaire et le biomédical. Les biocapteurs sont des moyens d'analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,…). Dans ce type d'outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN…) doté d'un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d'analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique. Dans la première partie de ce travail, un aptasensor a été développé pour la détection de la thrombine. Deux aptamères different ciblant la thrombine étaient directement immobilisés sur l'électrode en or. L'aptasensor élaboré présente une grande sensibilité, spécificité et stabilité pour la thrombine. Dans la seconde partie, en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS), nous avons surveillé l'immobilisation de protéines et sans marquage sur une surface d'or, au moyen d'une stratégie d'électro-adressage, compatible avec la production de biopuces pour multi-détection.Cette fonctionnalisation est réalisée par la cycloaddition alcyne / azoture, mieux connu comme la réaction «clic». Enfin, un biocapteur utilisant des protéines de phage à été développé pour la détection de E.coli / The objective of the research concerns the design and realization of biosensors based impedimetric measures, for which there is strong demand in various societal benefit areas, particularly the environment, food security and biomedical.Biosensors are rapid, selective and inexpensive devices that combine a biological recognition element, the so-called bioreceptor (e.g. enzymes, antibodies, DNA or microorganisms) to a physical transducer (e.g. electrochemical, optical, thermal or piezoelectrical). They can be used to detect one specific analyte or one family of analytes for a wide range of applications (e.g. environment, food, health). In the first part of this work, an aptasensor was developed for thrombin detection. Two different aptamers targeting thrombin were directly immobilized on the gold electrode. The aptasensor exhibits high sensitivity, specificity and stability in the detection of thrombin. In the second part, using electrochemical impedance spectroscopy (EIS), we have, monitored label-free protein immobilization on a gold surface, through a strategy of electroaddressing, compatible with the production of microarrays for multi-detection. This functionalization is achieved via the alkyne/azide cycloaddition, better known as the "click" reaction.Finally, a biosensor using phage proteins was developed for detecting E. coli

Le syndrome de Brugada (BrS) est une cardiopathie héréditaire à transmission autosomique dominante, se manifestant par une anomalie de l'ECG et un risque accru de mort subite. Les mutations retrouvées dans la sous-unité α du canal sodique cardiaque Nav1.5 chez certains patients entraînent un défaut d'adressage membranaire de ces canaux. Ceux-ci restent alors séquestrés dans des compartiments intracellulaires. L'étude de ces mutants se réduisant souvent à l'utilisation de traitements correcteurs, les mécanismes de rétention impliqués restent encore méconnus. L'objectif de ce travail est d'étudier des mutants Nav1.5 présentant un défaut d'adressage en tenant compte non seulement de l'hétérozygotie des patients BrS mais également de la présence de la sous unité régulatrice β1 prédominante dans le cœur. Des études fonctionnelles et biochimiques mettent en évidence un effet dominant négatif exercé par les mutants R1432G, L325R et S910L sur la densité de courant INa sauvage (WT). Cet effet nécessite la présence de la sous-unité β1 et passe par l'altération de l'adressage membranaire des formes WT. Ceci est la conséquence d'une interaction physique entre des sous-unités α mutantes et WT. D'autre part, les mutants étudiés présentent un profil de maturation lié aux N-glycosylations qui différent de celui des canaux WT. Nos données suggèrent que ces canaux peuvent emprunter (i) la voie classique d'adressage dans leur forme mature (ii) la voie dite non conventionnelle lorsqu'ils sont partiellement glycosylés. En conclusion, ces travaux mettent en évidence le rôle de la sous-unité β1 ainsi que l'implication des N-glycosylations dans la modulation de l'adressage des canaux Nav1.5 / Brugada syndrome (BrS) is an inherited autosomal dominant cardiac channelopathy characterized by abnormal ECG pattern and an increased risk of sudden cardiac death. Several mutations on the cardiac sodium channel Nav1.5 which are responsible for BrS lead to misfolded proteins that do not traffic properly to the plasma membrane and are instead retained in intracellular compartments. Although pharmacological rescue is commonly used to characterize misfolded mutants, underlying cellular retention mechanisms remain unclear. The aim of this work is to investigate trafficking defective Nav1.5 mutants considering BrS patient heterozygosity and the presence of the regulatory β1-subunit which is largely expressed in cardiac tissue. By combining electrophysiology and biochemical approaches, we show that three distinct mutants, R1432G, L325R and S910L, exert a strong dominant negative effect upon wild-type (WT) sodium current density. Our data indicate that this effect requires the presence of the β1-subunit and is mediated by disruption of membrane trafficking of WT channels. Co-immunoprecipitation experiments demonstrate a physical interaction between mutant and WT α-subunits occurring only when the β1-subunit was present. Furthermore, we investigate the maturation pattern of Na channels. Our data show distinct N-glycosylated states between WT and mutant channels, suggesting that Nav1.5 α-subunits traffic (i) via unconventional secretion pathway as a partially glycosylated product, (ii) through the classical secretory pathway for mature fully-glycosylated form. This work highlights that β1-subunit and N-linked glycosylation process play key roles in modulating Nav1.5 trafficki