Orientador: Luciana Alarcão Dias-Melicio / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Ronel Luciano Mamoni / Resumo: Paracocciodioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, causada por fungo dimórfico do gênero Paracoccidioides (Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii), sendo endêmica na América Latina. Nos últimos anos, estudos têm enfocado o papel dos neutrófilos (PMNs) na imunidade, uma vez que a literatura enfatiza o dinâmico envolvimento dessas células durante a defesa do hospedeiro contra diversos micro-organismos. Recentemente, foi demonstrado que neutrófilos podem utilizar uma nova estratégia para destruir patógenos chamada NETose, um tipo de morte celular diferente dos bem elucidados mecanismos de apoptose e necrose. Essa via envolve a liberação de redes extracelulares constituídas de conteúdo nuclear e granular por PMNs ativados. É proposto que as NETs destruam micro-organismos que não sejam fagocitados pelos neutrófilos, por possuírem tamanho ou morfologia maiores que as células, o que pode ocorrer com o Pb, uma vez que esse fungo assume essas características. Nesse contexto, os objetivos desse estudo foram identificar a presença das NETs tanto in vivo como in vitro, analisando lesões tegumentares de pacientes com PCM e culturas de PMNs do sangue periférico de pacientes e indivíduos saudáveis desafiados com diferentes cepas de P. brasiliensis. Fragmentos de biópsias foram marcados com anticorpos anti-histona (Texas-Red), anti-elastase (FITC), e corados com DAPI para avaliação por microscopia confocal, e com H&E para análise histopatológica. PMNs do sangue periférico de pacientes e indivíduos saudáveis foram isolados e desafiados com P. brasiliensis (Pb18 e Pb265) para avaliação de NETs por microscopia de varredura, microscopia confocal e quantificação dessas estruturas por Picogreen dsDNA kit. As imagens de microscopia confocal das biópsias revelaram a presença de constituintes das NETs, localização de DNA extracelular corado com DAPI, com ... / Abstract: Paracoccidiodomycosis (PCM), an endemic systemic mycosis in Latin America, is caused by the thermodimorphic fungus of Paracoccidioides genus (Paracoccidioides brasiliensis (Pb) and Paracoccidoides lutzii). Recently, works in PCM have focused the role of neutrophils (PMNs), since literature has demonstrated the dynamic involvement of these cells in host defense against microorganisms. Studies have shown that PMNs could use a novel strategy to destroy microorganisms (NETosis), a type of neutrophil death distinct from apoptosis and necrosis. This mechanism involves the release of extracellular traps by activated neutrophils, known as neutrophil extracellular traps (NETs). It has been proposed that NETs may destroy microorganisms that were not phagocytosed by neutrophils, and this could be proposed for Pb, since the fungus yeast can present different sizes. In this context, the objectives of this study were identify the presence of NETs in vivo and in vitro, analyzing samples of patients with PCM by different methodologies. Tissue sections from formalin-fixed biopsies were stained with DAPI, anti-elastase (FITC) and anti-histone (Texas-Red) for confocal immunofluorescence microscopy analysis, and with Hematoxylin-Eosin (H&E) for histopathology. Neutrophil cultures were challenged with two isolates of Pb (Pb18 and Pb265), analyzed by scanning electron microscopy and NETs were quantified by the Picogreen dsDNA kit. The images revealed the presence of NETs constituents, nuclear and extracellular localization of DNA, co-localization of elastase and histone, confirmed by the overlay of the three stains. Histopathology showed the presence of Pb and inflammatory infiltrate with high number of neutrophils on the site of the lesion and extracellular DNA (hematoxylin positive) indicating NETs. Both isolates were able to induce NET release in vitro in similar levels. Thus, P. brasiliensis (Pb18 and Pb265) is able to induce NETs formation by ... / Mestre

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Henrique Leonel Lenzi / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Maria José Soares Mendes Giannini / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, agente de doença granulomatosa crônica denominada de paracoccidioidomicose (PCM), com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até disseminadas evoluindo para letalidade. O fungo tem capacidade de aderir, extravasar e invadir barreiras impostas pelos tecidos do hospedeiro. Em ensaios in vitro verificou-se que P. brasiliensis pode aderir e invadir células epiteliais, aparecendo algumas vezes internalizado dentro de um vacúolo. A identificação do mecanismo pelo qual este fungo adere, invade e sobrevive no interior da célula hospedeira é campo fértil para a descoberta de sua patogênese. Para tanto, a análise de proteínas presentes no microrganismo e nas células do hospedeiro e também os marcadores da via endocítica para co-localizar os microrganismos no interior das mesmas é o objetivo deste estudo. Assim, foi realizada a infecção de células epiteliais A549 e macrófagos AMJ2-C11com P. brasiliensis (Pb18) nos períodos de 3, 5, 8, 24 e 3, 5, 10 e 24h, respectivamente e feitas análises por técnicas de imunofluorescência para as proteínas de junções compactas, junções aderentes, junções tipo fenda e proteínas de ancoramento intracelular, bem como as proteínas da via endocítica. Entres estas, foram ensaiadas a expressão de clatrina, Rab7 e LAMP-1 por imunofluorescência e EEA1, Rab7 e LAMP-1 por imunoblot. As proteínas de junções foram expressas nas células, bem como na parede do fungo. A clatrina foi evidente na célula e aparentemente mais expressa na parede do fungo. Nas células A549 não houve alteração na expressão de Rab7 e LAMP-1, tanto na imunofluorescência quanto no imunoblot, sendo que para EEA1 e Rab5 não foi evidenciada alteração na expressão pela técnica de imunoblot. Rab7 foi expressa nos macrófagos, localizada na periferia das células e também no... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus, the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM). PCM is a polymorphic disease manifested by an array of diverse clinical manifestations and varying organ involvement. P. brasiliensis may actively penetrate the mucocutaneous surface and parasitize epithelial cells, thus evading the host defenses and reaching deeper tissues. The ability of this fungus to adhere to and invade non-professional phagocyte cells has been observed. In vitro assays verify that P. brasiliensis can adhere and could appear internalized within vacuole. The identification of the mechanism by which this fungus adheres, invades and survivor inside the host cell is a fertile area for discover their pathogenesis. The aim of this study was analyzed the junctions proteins in the fungus and the host cells, as well as the endocytic markers to colocate the microorganisms inside the cells. Thus, the infection was performed in A549 epithelial cells and macrophages AMJ2-C11 with P. brasiliensis (PB18) for periods of 3, 5, 8, 24 and 3, 5, 10 and 24 h, respectively, and the immunofluorescence analysis was developed for the proteins claudin-1, claudin-4, E-cadherin, conexin 43, talin e vinculin, and the endocytic proteins. The macrophages and the cells A549 have been blemish along anti-clatrin, anti-Rab7 and anti-LAMP-1. The junctions' proteins have been expressed at the cells, as well as on the wall from the fungus. The clathrin was present at the cells and apparently more expressed on the fungus wall. Rab7 and LAMP-1 were not expressed in the cells A549 as demonstrated by the imunofluorescence and the imunoblot. On the contrary Rab7 was expressed in macrophages located at the periphery of the cells and also in the own fungus. The expression of LAMP-1 apparently not presented alteration both at the imunofluorescence and at the imunoblot. The expression of EEA1 was... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4860724 bytes, checksum: f08f9b635c46251caf56790b735a4117 (MD5) Previous issue date: 2013-01-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The genus Zornia has about 75 species worldwide, with 41 representatives in America, 16 in Africa, 13 in Asia-Oceania and 7 (MOHLENDROCK 1961), is the second most numerous representative of clade Adesmia. Occurs in Brazil from the Amazon region to the "pampas" in Rio Grande do Sul Zornia brasiliensis species is popularly known as "urinaria", "urinana" and "carrapicho" is reported by its use in folk medicine as a diuretic. It occurs in several states in Brazil, being abundant in northeastern Brazil occurring in the states of Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco, Rio Grande do Norte and Paraiba. Here we describe the isolation and structural elucidation of flavonoids, chalcones and Pterocarpans aerial parts of Zornia brasiliensis. For this the plant material after drying and pulverization was subjected to extraction processes, partition and chromatography for isolation of the chemical constituents. The same chemical structure was determined by spectroscopic methods IR, Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance 1H and 13C and uni-dimensional as well as comparisons with literature. Phases of dichloromethane and ethyl acetate afforded three of five compounds flavones: 7-methoxyflavone, 5-hydroxy-7-methoxyflavone and 5,7-dimethoxyflavone, a chalcone 2 ', 4'-dihidroxichalcona pterocarpan and a 3 - hydroxy-9-metoxipterocarpano, all isolated for the first time in the genre. Furthermore, this study evaluated the antinociceptive activity of 7-methoxyflavone isolated in this study. Thus, the results contributed to the expansion of knowledge of gender Zornia chemotaxonomic and antinociceptive activity of a flavone, so far not. / O gênero Zornia possui cerca de 75 espécies no mundo, com 41 representantes na América, 16 na África, 13 na Oceania e 7 na Ásia (MOHLENDROCK 1961), é o segundo representante mais numeroso do clado Adesmia. No Brasil ocorre desde a região amazônica até os pampas no Rio Grande do Sul. A espécie Zornia brasiliensis é conhecida popularmente como urinária , urinana e carrapicho é relatada por sua utilização na medicina popular como diurética. Ocorre em vários estados do Brasil, sendo abundante no Nordeste do Brasil ocorrendo nos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Paraíba. Neste trabalho descrevemos o isolamento e elucidação estrutural de flavonoides, chalconas e pterocarpanos das partes aéreas de Zornia brasiliensis. Para isso o material vegetal, após secagem e pulverização, foi submetido a processos de extração, partição e cromatografia para isolamentos dos constituintes químicos. A estrutura química dos mesmos foi determinada pelos métodos espectroscópicos de Infravermelho, Espectrometria de Massas e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C uni e bidimensionais bem como por comparações com modelos da literatura. Das fases diclorometano e acetato de etila obtiveram-se cinco compostos sendo três flavonas: 7-metoxiflavona, 5-hidroxi-7-metoxiflavona e 5,7-dimetoxiflavona; uma chalcona a 2 ,4 -dihidroxichalcona e um pterocarpano o 3-hidroxi-9-metoxipterocarpano, todas isoladas pela primeira vez no gênero. Além disto, este trabalho avaliou a atividade antinociceptiva da 7-metoxiflavona isolada no presente trabalho. Desta forma, os resultados obtidos contribuíram para a ampliação do conhecimento quimiotaxonômico do gênero Zornia e da atividade antinociceptiva de uma flavona até então não estudada.

Saponinas triterpênicas incluem uma ampla variedade de moléculas com diversas aplicações farmacológicas. As saponinas das folhas de Quillaja brasiliensis, espécie nativa do Sul do Brasil, são estrutural e funcionalmente semelhantes às encontradas nas cascas da espécie chilena Quillaja saponaria, as quais são utilizadas atualmente como adjuvantes em formulações comerciais de vacinas. O perfil de acúmulo da fração imunoadjuvante de saponinas triterpênicas de Q. brasiliensis (QB-90) foi avaliado em resposta a diferentes fatores de estresse. O conteúdo de QB-90 em discos foliares aumentou significativamente com a aplicação de diferentes agentes de estresse osmótico. Também pôde ser observado aumento nos teores de saponinas pela exposição de discos foliares a ácido salicílico, ácido jasmônico, ultrassom e luz ultravioleta C. Experimentos com plântulas indicaram um aumento significativo nos teores de QB-90 com o aumento moderado de irradiância luminosa e pela aplicação de dano mecânico nas folhas. Os resultados obtidos apoiam o papel de defesa induzida que estes metabólitos apresentam in planta. Com o objetivo de avançar os estudos de atividade adjuvante de Q. brasiliensis e ampliar a extensão de antígenos testados, uma vacina contra poliovírus foi avaliada em camundongos. Resultados demonstraram que as formulações de vacinas contendo saponinas da espécie brasileira aumentaram níveis de anticorpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a, sugerindo um estímulo de ambos tipos de resposta imune (Th1 e Th2). A resposta celular foi confirmada por ensaios de DTH e pela avaliação dos níveis de mRNA das citocinas IL-2 e IFN- em esplenócitos murinos. A resposta imune de mucosas foi demonstrada pelos aumentos nos níveis de IgA em bile, fezes e lavados vaginais. O segundo objeto de estudo desta Tese é a espécie Centella asiatica (L.) Urban, que também apresenta saponinas triterpênicas bioativas em suas partes aéreas. Uma enzima responsável pela glicosilação de ácido asiático e ácido madecássico foi parcialmente purificada. Usando técnicas de proteômica e dados de sequências de cDNA, a sequência completa do clone que codifica uma glicosiltransferase foi obtida. O produto gênico recombinante, UGT73AD1, foi funcionalmente expresso em Escherichia coli, purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado e funcionalmente caracterizado. UGT73AD1 foi identificada como sendo uma glicosiltransferase triterpênica de ácidos carboxílicos, provavelmente envolvida na biossíntese de monodesmosídeos da espécie. / Triterpene saponins include a large variety of molecules that find several applications in pharmacology. The saponins from leaves of Quillaja brasiliensis, a native species from Southern Brazil, show structural and functional similarities to those of Quillaja saponaria barks, which are currently used as adjuvants in vaccine formulations. The accumulation patterns of an immunoadjuvant fraction of leaf triterpene saponins (QB-90) in response to stress factors were examined. The content of QB-90 in leaf disks was significantly increased by application of different osmotic stress agents. Higher yields of bioactive saponins were also observed upon exposure to salicylic acid, jasmonic acid, ultrasound and UV-C light. Experiments with shoots indicated a significant increase in QB-90 yields with moderate increases in white light irradiance and by mechanical damage applied to leaves. These results support a general induced defense role for these metabolites in planta. Aiming at advancing the studies of Q. brasiliensis adjuvant activity and amplifying the range of antigens tested, an inactivated virus-based vaccine against poliovirus was evaluated in mice. Results demonstrated that saponin formulations were able to enhance poliovirus- specific total IgG, IgG1 and IgG2a, suggesting stimulation of both Th1 and Th2 immune responses. Cellular response stimulation was confirmed by DTH assays and by evaluating the enhancement of IL-2 and IFN-γ cytokine mRNA expression in mice splenocytes. Mucosal immune responses demonstrated that the QB-90-adjuvanted vaccine enhanced IgA titers in bile, feces and vaginal washings. Centella asiatica (L.) Urban, a species accumulating triterpene bioactive saponins in its shoots, was also subject of study in this Thesis. An enzyme capable of glucosylating asiatic and madecassic acids was partially purified. Using proteomic methods and cDNA sequence data, a full-length cDNA clone encoding the glucosyltransferase was obtained. The recombinant gene product, UGT73AD1, was functionally expressed in Escherichia coli, purified by immobilized metal-affinity chromatography and functionally characterized. UGT73AD1 was identified as a triterpene carboxylic acid glucosyltransferase, likely involved in monodesmoside biosynthesis in C. asiatica.

O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistêmicas humanas mais prevalentes na América Latina. Componentes da cadeia respiratória mitocondrial são potenciais alvos quimioterapêuticos. Nesse sentido, em nosso trabalho demonstramos diferenças entre a cadeia respiratória do fungo P. brasiliensis e do hospedeiro mamífero. A respiração, potencial de membrana e fosforilação oxidativa mitocondrial de esferoplastos de P. brasiliensis foram avaliados in situ, os quais demonstraram a presença de uma cadeia respiratória funcional. A adição de ADP induziu a transição da respiração do estado de repouso para o fosforilativo, em esferoplastos energizados com succinato, NADH, NAD+ e substratos ligados ao complex I. A presença de uma NADH-ubiquinona oxidoredutase foi demonstrada pela capacidade das células oxidarem NADH exógeno, assim como, pela respiração insensível a rotenona e sensível a flavona. Além disso, a respiração mantida por NAD+ foi sensível a rotenona e flavona, sugerindo que vias metabólicas citosolicas contribuem para a produção de NADH e substratos ligados ao complexo I. Foi demonstrado também que os níveis de expressão do complexo I e da NADH desidrogenase alternativa alternam-se durante a curva de crescimento de leveduras de P. brasiliensis. A respiração induzida por NADH ou succinato foi parcialmente inibida por KCN ou antimicina A e sensível à inibição por BHAM, indicando a presença de uma oxidase alternativa. A fim de se caracterizar esta enzima oxidase alternativa, o seu gene foi clonado e expressado em xii S. cerevisiae e E. coli, o qual conferiu uma respiração resistente a cianeto e sensível a BHAM. S. cerevisiae expressando oxidase alternativa mostraram uma menor taxa de multiplicação celular e diminuição na geração de EROs. Nós também observamos que inibidores da cadeia transportadora de elétrons retardaram a transição de micélio para levedura em culturas de P. brasiliensis. Além disso, estes inibidores e outras drogas geradoras de EROs aumentaram a expressão do gene da oxidase alternativa, assim como a produção de EROs em leveduras de P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermically dimorphic fungus, is the etiological agent of endemic paracoccidioidomycosis, one of the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. Components of the respiratory chain constitute potential pharmacological targets, and here are reported differences between the respiratory chain of the mammalian host and the fungus P. brasiliensis. Respiration, membrane potential and oxidative phosphorylation of mitochondria from P. brasiliensis spheroplasts were evaluated in situ, which demonstrated the existence of a functional respiratory chain. Adenosine 5\'-diphosphate (ADP) induced a transition from resting to phosphorylating respiration in mitochondria energized by succinate, NADH, NAD+ and complex I linked substrates. The presence of an alternative NADH-ubiquinone oxidoreductase was indicated by: the ability of the fungus to oxidize exogenous NADH; the insensitivity substrate-supported respiration to rotenone and sensitivity of this respiration to flavone. In addition, the sensitivity of NAD+-supported respiration to rotenone and flavone suggest that citosolic pathways contribute to NADH and complex I linked substrates production. Moreover, it was demonstrated that expression levels of complex I and alternative NADH dehydrogenase change during P. brasiliensis growth curve. The partial sensitivity of NADH or succinate-supported respiration to antimycin A and cyanide, as well as the sensitivity to BHAM, indicates the presence of an alternative oxidase. Therefore, to characterize the alternative oxidase its gene was cloned and heterologously xii expressed in S. cerevisiae and E. coli, wich confered, a cyanide resistant respiration and BHAM sensitivity. Moreover, S. cerevisiae that expressed alternative oxidase showed slower growth rate and decreased ROS generation. We also observed that electron transport pathways inhibitors delayed the P. brasiliensis mycelium to yeast transition in cultures. Besides, these inhibitors and other ROS generated drugs increase the ROS production and altenative oxidase expression.

O Brasil apresenta cerca de 10 a 17,6% da biodiversidade mundial e apenas uma fração dela é conhecida. Os fungos filamentosos são bons produtores de enzimas e despertam um grande interesse biotecnológico. O amido é o principal carboidrato de reserva das plantas. Dentre as enzimas amilolíticas estão as glucoamilases, que catalisam a hidrólise das ligações -1,4 e -1,6 das extremidades da cadeia do amido liberando glucose. Neste trabalho foram isolados 25 fungos filamentosos de amostras de materiais em decomposição da Mata Atlântica. Dos micro-organismos com alta atividade amilolítica foram selecionados e identificados Aspergillus brasiliensis e Rhizopus oryzae. Foi realizada a otimização do cultivo e caracterização das amilases do extrato bruto de ambos os fungos. Após a obtenção destes dados foi selecionado A. brasiliensis, pois, sua amilase é mais termoestável e ainda não reportada na literatura. Após purificação a enzima foi identificada como glucoamilase, a qual é monomérica com 69 kDa e contém aproximadamente 21% de carboidratos. Apresenta um domínio de ligação ao amido na porção terminal e estrutura secundária rica em -hélice. Sua atividade ótima ocorre em pH 4,5 a 60°C, seu pI é de 3,21, pode ser ativada com a adição de Mn2+, e é inibida por glucose em concentrações maiores que 0,1 M. A glucoamilase apresenta excelente estabilidade ao pH e boa estabilidade a temperatura (a 50°C mantém 67% de atividade após 7 horas; a 55°C a meia vida é de 147 minutos). Com amido de batata a enzima apresentou as seguintes constantes cinéticas (km 2,21 mg/mL; Vmáx 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). A glucoamilase foi imobilizada em DEAE-PEG com ativação de 12 vezes e possibilidade de reuso de 10 vezes com perda de apenas 31% de atividade. O derivado demostrou maior facilidade para hidrolisar a amilopectina do que à amilose. Também foi realizada uma análise de neighbor joining, que agrupou a glucoamilase de A. brasiliensis próxima às glucoamilases de espécies de Aspergillus, que são consideradas as mais derivadas. / Brazil holds about 10-17.6% of the world\'s biodiversity and just a percentage of it is known. Filamentous fungi are enzyme producers that have great biotechnological application. Starch is the main reserve carbohydrate in plants. Among the amylolytic enzymes there are the glucoamylases, that catalyze the hydrolysis of -1,4 and -1,6 linkages of the end of starch chains, and releases glucose. In this research 25 filamentous fungi from Atlantic forest decaying material samples were isolated. Among microorganisms with high amylolytic activity Aspergillus brasiliensis and Rhizoupus oryzae were selected and identified. The cultivation parameters were optimized and the enzymes of crude extract were characterized. Considering the previous data Aspergillus brasiliensis was selected because its amylases are more thermostable and it has not been described in the literature yet. After purification the enzyme was identified as a glucoamylase, which is monomeric with 69 kDa and about 21% of carbohydrates in its composition. The enzyme has a starch binding domain in the terminal position and its secondary structure is rich in -helix. The optimum pH for glucoamylase activity is 4.5, the temperature is 60ºC and its pI is 3.21. The enzyme can be activated by the addition of Mn+2, and inhibited in concentrations above 0,1M glucose. The glucoamylase has an excellent pH stability and a good temperature stability (at 50ºC 67% of the activity was retained after 7 hours; at 55°C its half-life was 147 minutes). The best kinetic values were obtained with potato starch (km 2.21 mg/mL; Vmax 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). The glucoamylase was immobilized on DEAE-PEG, with an activation of 12 times and enzyme reuse 10 times with just 31% loss of its activity. The immobilized enzyme has a greater activity on amylopectin than amylose. A neighbor joining analysis with glucoamylases from filamentous fungi species was made and Aspergillus brasiliensis glucoamylase was grouped close to the glucoamylases of Aspergillus species, which are considered the most derivative.

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

Saponinas triterpênicas incluem uma ampla variedade de moléculas com diversas aplicações farmacológicas. As saponinas das folhas de Quillaja brasiliensis, espécie nativa do Sul do Brasil, são estrutural e funcionalmente semelhantes às encontradas nas cascas da espécie chilena Quillaja saponaria, as quais são utilizadas atualmente como adjuvantes em formulações comerciais de vacinas. O perfil de acúmulo da fração imunoadjuvante de saponinas triterpênicas de Q. brasiliensis (QB-90) foi avaliado em resposta a diferentes fatores de estresse. O conteúdo de QB-90 em discos foliares aumentou significativamente com a aplicação de diferentes agentes de estresse osmótico. Também pôde ser observado aumento nos teores de saponinas pela exposição de discos foliares a ácido salicílico, ácido jasmônico, ultrassom e luz ultravioleta C. Experimentos com plântulas indicaram um aumento significativo nos teores de QB-90 com o aumento moderado de irradiância luminosa e pela aplicação de dano mecânico nas folhas. Os resultados obtidos apoiam o papel de defesa induzida que estes metabólitos apresentam in planta. Com o objetivo de avançar os estudos de atividade adjuvante de Q. brasiliensis e ampliar a extensão de antígenos testados, uma vacina contra poliovírus foi avaliada em camundongos. Resultados demonstraram que as formulações de vacinas contendo saponinas da espécie brasileira aumentaram níveis de anticorpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a, sugerindo um estímulo de ambos tipos de resposta imune (Th1 e Th2). A resposta celular foi confirmada por ensaios de DTH e pela avaliação dos níveis de mRNA das citocinas IL-2 e IFN- em esplenócitos murinos. A resposta imune de mucosas foi demonstrada pelos aumentos nos níveis de IgA em bile, fezes e lavados vaginais. O segundo objeto de estudo desta Tese é a espécie Centella asiatica (L.) Urban, que também apresenta saponinas triterpênicas bioativas em suas partes aéreas. Uma enzima responsável pela glicosilação de ácido asiático e ácido madecássico foi parcialmente purificada. Usando técnicas de proteômica e dados de sequências de cDNA, a sequência completa do clone que codifica uma glicosiltransferase foi obtida. O produto gênico recombinante, UGT73AD1, foi funcionalmente expresso em Escherichia coli, purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado e funcionalmente caracterizado. UGT73AD1 foi identificada como sendo uma glicosiltransferase triterpênica de ácidos carboxílicos, provavelmente envolvida na biossíntese de monodesmosídeos da espécie. / Triterpene saponins include a large variety of molecules that find several applications in pharmacology. The saponins from leaves of Quillaja brasiliensis, a native species from Southern Brazil, show structural and functional similarities to those of Quillaja saponaria barks, which are currently used as adjuvants in vaccine formulations. The accumulation patterns of an immunoadjuvant fraction of leaf triterpene saponins (QB-90) in response to stress factors were examined. The content of QB-90 in leaf disks was significantly increased by application of different osmotic stress agents. Higher yields of bioactive saponins were also observed upon exposure to salicylic acid, jasmonic acid, ultrasound and UV-C light. Experiments with shoots indicated a significant increase in QB-90 yields with moderate increases in white light irradiance and by mechanical damage applied to leaves. These results support a general induced defense role for these metabolites in planta. Aiming at advancing the studies of Q. brasiliensis adjuvant activity and amplifying the range of antigens tested, an inactivated virus-based vaccine against poliovirus was evaluated in mice. Results demonstrated that saponin formulations were able to enhance poliovirus- specific total IgG, IgG1 and IgG2a, suggesting stimulation of both Th1 and Th2 immune responses. Cellular response stimulation was confirmed by DTH assays and by evaluating the enhancement of IL-2 and IFN-γ cytokine mRNA expression in mice splenocytes. Mucosal immune responses demonstrated that the QB-90-adjuvanted vaccine enhanced IgA titers in bile, feces and vaginal washings. Centella asiatica (L.) Urban, a species accumulating triterpene bioactive saponins in its shoots, was also subject of study in this Thesis. An enzyme capable of glucosylating asiatic and madecassic acids was partially purified. Using proteomic methods and cDNA sequence data, a full-length cDNA clone encoding the glucosyltransferase was obtained. The recombinant gene product, UGT73AD1, was functionally expressed in Escherichia coli, purified by immobilized metal-affinity chromatography and functionally characterized. UGT73AD1 was identified as a triterpene carboxylic acid glucosyltransferase, likely involved in monodesmoside biosynthesis in C. asiatica.

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.

Glicoesfingolipídios (GSLs) podem se inserir em regiões específicas das membranas (lipid rafts) quando adicionados em culturas celulares, modulando sua função. Nós avaliamos se GSLs de Paracoccidioides brasiliensis, glucosilceramida (CMH) e glicoinositolfosfoceramida (GIPC) possuem atividade imuno-moduladora. Foram estudados indivíduos com (grupo curado) ou sem histórico de paracoccidioidomicose (grupo controle). CMH elevou a expressão de CD80 e CD86 em monócitos, a linfoproliferação em PBMCs no grupo controle e reduziu a capacidade de DCs em induzir linfoproliferação. No grupo curado, CMH inibiu proliferação em culturas com CMA e gp43, reduziu a produção de IL-10 por DCs e aumentou a produção de IL-12. Já GIPC aumentou a produção de citocinas Th1, elevou a fagocitose de leveduras, reduziu a maturação de DCs e sua capacidade de induzir linfoproliferação. A avaliação de células iNKT não mostrou diferença no número de células, na expansão e produção de citocinas entre os grupos. Em conclusão, GSLs de P. brasiliensis alteram a função de células do sistema imune. / Glycosphingolipids (GSL) may insert into specific membrane regions (lipid rafts) when added to cell culture, modulating its function. We evaluated whether glucosylceramide (CMH) and glycoinositol-phosphoceramide (GIPC), extracted from Paracoccidioides brasiliensis, are able to modulate immune cells functions of cured paracoccidioidomycosis (PCM) patients (control group) or individuals who never had PCM (cured group). CMH increased CD80 and CD86 expression on monocytes, increased lymph-proliferation on PBMCs and reduced lympho-proliferation in co-cultures with dendritic cells (DCs). In cured groups, CMH decreased gp43 and CMA- induced lymph proliferation, reduced IL-10 and increased IL-12 production by DCs. GIPC increased phagocytic capacity, reduced the maturation levels on DCs and DC capacity to induce lymph-proliferation. iNKT cells were analyzed and there were no differences in iNKT cells number, expansion capacity and cytokines production among the groups. In conclusion, GSL extracted from P. brasiliensis are able to modulate immune cells functions.