Orientadores: Nelson da Silva Cordeiro, Sarah Arana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T17:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barassa_Bianca_D.pdf: 5238777 bytes, checksum: 8c674b6d8dd51bbd55f95465206cedc7 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A susceptibilidade à infecção natural por parasitos do filo Myxozoa foi avaliada em Salminus brasiliensis (dourado) e Leporinus obtusidens (piapara), oriundos de ambiente natural. Durante o período de 2005 a 2007, 60 dourados e 60 piaparas, foram colhidos no rio Mogi-Guaçu em trechos a jusante da barragem da Cachoeira de Emas, localizada no município de Pirassununga, SP, Brasil. (...continua) / Abstract: The susceptibility to natural by Myxozoan parasites was evaluted in Salminus brasiliensis (dourado) na Leporinus obtusidenss (piapara), from the natural environment. During the period of 2005 to 2007, 60 dourado and 60 piapara were collected in the river Mogi-Guaçu, near Cacheira de Emas, located in the municipality of Pirassununga, State of São Paulo, Brazil. (¿to be continued) / Doutorado / Doutor em Parasitologia

Quando as escoriações ocorrem é esperada uma cicatrização sem complicações, utilizando produtos para prevenção de infecções e que proporcionam ambiente que otimiza rápida cicatrização com cicatrizes mínimas. Tratamentos com antissépticos tópicos e produtos cicatrizantes são os mais utilizados. Vários relatos demonstram que o soro do látex (SLX) da seringueira Hevea brasiliensis tem propriedades cicatrizantes para úlceras cutâneas. O objetivo deste trabalho foi avaliar citotoxicidade e potencial proliferativo do SLX em ensaios in vitro e sua eficácia em escoriações cutâneas no dorso de ratos. A citotoxicidade do SLX (10%, 1% e 0,1%) foi avaliada em culturas de fibroblastos 3T3 pela determinação da viabilidade celular. A proliferação/migração celular com queratinócitos humanos foi avaliada pelo método scratch assay nas concentrações (1%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001% e 0,00001%). Para a atividade cicatrizante utilizou-se 72 ratos Wistar submetidos à escoriação no dorso por dermoabrasão, e 3 grupos foram estabelecidos: soro fisiológico (SF), antisséptico (AS-Merthiolate®) e soro do látex (SLX-Regederm®), aplicado diariamente por 10 dias. As lesões foram fotografadas e avaliadas por análise de imagem nos dias 2, 7 e 10 póslesão e calculados os índices de cicatrização das escoriações (ICE) para medir reepitelização. Nos dias 2, 7 e 10 foram sacrificados 8 animais de cada grupo e coletadas amostras para dosagem bioquímica da mieloperoxidase (MPO) e no 10º dia uma parte das biópsias foram separadas para análise histológica da epiderme e crosta. O SLX não apresentou toxicidade aos fibroblastos nas concentrações menores ou iguais à 1%, sendo inviável na concentração de 10%. Pelo scratch assay o SLX apresentou atividade proliferativa sobre queratinócitos humanos principalmente na concentração de 0,01% (89%). O SLX promoveu melhor reepitelização no modelo de escoriação, principalmente no 7º dia, diferente dos demais grupos que tinham atraso na reepitelização. Além disso, quanto às diferenças de espessura da crosta e da epiderme, o grupo SLX promoveu um aumento no número de camadas epidérmicas e menor espessura das crostas. Os grupos SLX e AS apresentaram aumento da enzima MPO no 2º dia, porém com redução significante a partir do 7º dia, diminuindo assim a inflamação e acelerando consequentemente a reepitelização. Os resultados evidenciaram que a aplicação do soro do látex é segura pela não toxicidade e comprova sua eficácia perante a outros produtos, pela propriedade proliferativa para queratinócitos e pela aceleração da cicatrização em modelos de exulcerações cutâneas. / When abrasions occur is expected to heal without complications, using products to prevent infections and provide environment that optimizes rapid healing with minimal scarring. Treatments with topical antiseptics and healing products are the most used. Several reports show that the latex serum (LXS) from Hevea brasiliensis has healing properties for skin ulcers. The objective was to evaluate the cytotoxic and proliferative potential of LXS in vitro assays and their efficacy to heal skin abrasions on the back of rats. LXS cytotoxicity (10, 1 and 0.1%) was evaluated in 3T3 fibroblast cultures by cell viability. The cell proliferation/migration in human keratinocytes was evaluated by the scratch assay method using 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% and 0.00001% concentrations. For healing activity, 72 Wistar rats were underwent to dermoabrasion on the back and 3 groups were stablished: saline (S), antiseptic (AS-Merthiolate®) and rubber latex serum (LXS-Regederm®). The different products were applied daily for 10 days. The lesions were photographed and evaluated by image analysis on days 2, 7 and 10 post-injury and the abrasion healing rate (AHR) were calculated for evaluation of the re-epithelialization. On days 2, 7 and 10, 8 animals from each group were sacrificed, and samples were taken for biochemical determination of myeloperoxidase (MPO) After that, on day 10, a part of the biopsies was separated for histological analysis of the epidermis and crust. The LXS showed no toxicity to fibroblasts at concentrations less than or equal 1%, being impractical at a concentration of 10%. By the scratch assay, the LXS showed proliferative activity on human keratinocytes, particularly at a concentration of 0.01% (89%). The LXS produced better re-epithelialization in the excoriation model, especially on the 7th day, unlike other groups, in which the re-epithelialization was delayed. Furthermore, it showed significant differences regarding the amount of epidermis and crust. The Regederm group presented an increase in the number of epidermal layers and thinner thickness of their crusts. The LXS and AS groups showed an increase of MPO enzyme on the 2nd day, however, with a significant decrease from the 7th day, thus reducing inflammation and consequently accelerating re-epithelialization. The results showed that the application of the rubber latex serum is safe due its non-toxicity and prove its efficacy comparing to other products, because of its proliferative property for keratinocytes and acceleration of healing in cutaneous exulceration models.

A biomenbrana de látex natural (BLN) da serigueira HEVEA brasiliensis, utilizada como curativo no tratamento de úlceras crônicas em humanos, mostra-se eficaz no desbridamento e no estímulo à granulação, acelerando a cicatrização. Seu mecanismo de ação ainda é desconhecido, tornando-se importante avaliar sua atividade como implante na indução tecidual, comparando-a aos outros implantes e à cicatrização normal (SHAM). Foram utilizados camundongos C57BL/6, constituído de 5 grupos distintos pelo implante subcutâneo dorsal (1cm2): 15 implantados com BLN; 15-LUVA cirúrgica (látex desnaturado); 15-ePTFE (PoliTetraFluorEtileno Expandido - implante sintético) e 15-SHAM. A atividade dos implantes foi avaliada no 2º, 7º e 14º dias, sacrificando 5 animais/grupo/tempo para biópsias (punch-4mm). Toda pele da área implantada foi recortada e fotografada. As amostras foram submetidas a estudos histológicos por HE para contagem das células inflamatórias, fibroplasia e angiogênese, utilizando o plugin \"Cell Counter\" no software ImageJ®; pelo Tricrômio de Gomori para quantificação colagênica pelo \"Threshold\" no ImageJ®, e imunohistoquímica para iNOS, IL-1?, VEGF e TGF-?1. A partir do sobrenadante do macerado das biópsias foram realizadas as dosagens de mieloperoxidase (MPO), IL-1? e de TGF-?1 por ELISA. Macroscopicamente, viu-se maior quantidade de tecido neoformado nos animais implantados com BLN já no 2º dia, diferente dos demais grupos. À histologia (HE), constatou-se que a BLN no 2º dia estimulou denso infiltrado inflamatório, principalmente neutrófilos, seguido de maior produção de MPO e de IL-1?, diferente dos demais tratamentos (P<0,01). Com 7 e 14 dias, a quantidade de IL-1? nos grupos LUVA e SHAM foi maior que a da BLN e do ePTFE, mostrando o equilíbrio no estímulo inicial da atividade inflamatória pela BLN. Quanto a angiogênese, os grupos BLN e LUVA com 7 e 14 dias apresentaram maior formação de vasos que o ePTFE e SHAM. Entretanto, na imunohistoquímica observou-se baixa expressão de VEGF no grupo BLN no 7º e 14º dia. Quanto a fibroplasia, o ePTFE com 7 dias apresentou maior fibroplasia que todos os grupos (P<0,01). No 14º dia, a BLN apresentou maior fibroplasia, embora sem diferença estatística entre os grupos. Quanto à colagênese, pelo ImageJ® (\"Threshold\") por Tricrômio de Gomori, os implantes se comportaram de maneira semelhante, inclusive com o SHAM, exceto no 14º dia que o ePTFE apresentou colagênese maior que a LUVA e BLN (P<0,01). O grupo SHAM apresentou maior concentração de TGF-beta1 que os demais grupos no sétimo dia (P<0,01), semelhante à BLN e à LUVA no 14º, entretanto maior que o ePTFE (P<0,01). Conclui-se que a biomembrana de látex da seringueira Hevea brasiliensis atua significativamente na fase inflamatória da cicatrização, importante no recrutamento neutrofílico para o local, confirmado quantitativamente pela concentração de MPO e IL-beta1 e por imunohistoquímica. Este fato parece influenciar diretamente as fases subseqüentes do processo cicatricial, confirmada pela sua capacidade estimuladora de angiogênese, provavelmente não influenciada por VEGF, e pelo estímulo à fibroplasia independente de TGF-beat1 e sem modificação na produção colagênica. / The natural latex biomembrane (NLB) from Hevea brasiliensis rubber tree, used as dressing in the treatment of human chronic ulcers, has been showed efficient in the debridement and the granulation stimulation, accelerating the healing. Its mechanism of action is still unknown, becoming important to evaluate its activity as implantation in the tissue induction, comparing it with the other implants and with the normal healing (SHAM). Mice C57BL/6, consisting of 5 distinct groups had been used of the dorsal subcutaneous implantation (1cm2): 15 implanted with NLB; 15 with surgical GLOVE (unnatural latex); 15 with ePTFE (expanded polytetrafluorethylene - synthetic implantation) and 15 without implant (SHAM). The activity of the implants was evaluated in 2nd, 7th and 14th days. Five animals for group each time were sacrificed for biopsies with 4mm punch. All skin of the implanted area was cut and photographed. The samples had been submitted to the histology studies for haematoxylin-eosin for counting the inflammatory cells, fibroplasia and angiogenesis, using \"Cell Counter\" plugin in the ImageJ® software; by Gomori\'s thrichrome for collagen quantification using \"Threshold\" in the ImageJ®, and iNOS, IL-beta1, VEGF and TGF-beta1 immunohistochemistry. From the biopsies macerated supernatant, the myeloperoxidase assay had been carried through (MPO), IL-beta1 and of TGF-beta1 by ELISA. Macroscopically, it was observed a big amount of new tissue formed in the NLB implanted animals on 2nd day, different of the other groups. In histological analyze by H&E, it was observed that the NLB in 2nd day stimulated dense inflammatory infiltrated, mainly by neutrophils, followed of bigger production of MPO and IL-beta1, different of the other treatments (P<0,01). After 7 and 14 days, the amount of IL-beta1 in the groups GLOVE and SHAM were greater than the NLB and ePTFE, showing the balance in the initial stimulation of the inflammatory activity by the NLB. About angiogenesis, both groups (NLB and GLOVE) after 7 and 14 days had presented greater formation of vessels than ePTFE and SHAM (P<0,01).However, in the immunohistochemistry was observed a low VEGF expression in the NLB group in 7th and 14th days. Related to fibroplasia, ePTFE after 7 days presented greater fibroplasia than all the groups (P<0,01). In 14th day, the NLB presented an important fibroplasia, even so without statistic difference between the groups. The collagen proliferation evaluated by the ImageJ® (\"Threshold\") applied in Gormori\'s thrichrome stained biopsies, the implants showed similar results, also with the SHAM, except in 14th day that ePTFE presented bigger collagen proliferation than the GLOVE (P<0,01).The SHAM group presented greater concentration of TGF-beta1 than the other groups in the seventh day (P<0,01), equal to the NLB and the GLOVE in 14th, however bigger than ePTFE (P<0,01).In conclusion, natural latex biomembrane (NLB) from Hevea brasiliensis rubber tree acts significantly in the inflammatory phase of the healing process, important in the neutrophilic recruitment to injury local, confirmed quantitatively by MPO and IL-beta1 concentrations and by immuno histochemistry. This fact seems to influence directly the subsequent phases of the healing process, confirmed for its stimulatory capacity of the angiogenesis, probably not influenced by VEGF, and the fibroplasia stimulation independent of TGF-beta1 and without modification in the collagen production.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao parte 1 lidiane biologia.pdf: 35041 bytes, checksum: c58f88ce1be4655ee71c7b5ab0bef247 (MD5) Previous issue date: 2008-04-03 / Paracoccidoides brasiliensis is a human pathogenic dimorphic fungus. The recombinant chitinase from P. brasiliensis, Pbcts1r, was overexpressed in Escherichia coli using pET-32a (+) as vector. The enzyme was produced as inclusion bodies and became soluble by Sarkosyl being purified by a single step using a Ni-NTA resin. Pbcts1r showed activity against 4-MU-(GlcNAc)3 and 4-MU-(GlcNAc)2, presenting a endochitinase activity. Immunoblot reaction with anti-Pbcts1r identified two proteins in yeast crude extract. A partial purification of P. brasiliensis yeast crude extract by cationic-exchange chromatography on HPLC revealed two different chitinases, Pbcts1 and Pbcts2, with molecular mass of 45 kDa and 34 kDa, respectively. Pbcts2 has exochitinase activity and Pbcts1 has endochitinase activities. Reactions with anti- Pbcts1r showed the presence of Pbcts1 and Pbcts2 in crude extracts of yeast and transition from mycelium to yeast. On mycelium crude extracts was found only Pbcts1 and on yeast cell wall extract only Pbcts2. Both proteins were found to be secreted by yeast parasitic phase showing their probable importance in the permanence of the fungus in the human host. Phylogenetic relationships between the orthologs Pbcts1 and the putative Pbcts2 indicated the presence of a common ancestral. During evolution, P. brasiliensis could have acquired Pbcts2 and Pbcts1 playing distinct roles in order to growth and survive in diverse environment on saprophytic and parasitic phases / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico humano. A quitinase recombinante de P. brasiliensis, Pbcts1r, foi superexpressa em Escherichia coli utilizando pET-32(a)+ como vetor. A enzima foi produzida em corpos de inclusão e se tornou solúvel pela adição de sarkosyl, sendo purificada em um único passo com a utilização da resina Ni-NTA. Pbcts1r mostrou atividade diante de 4-MU-(GlcNAc)3 e 4- MU-(GlcNAc)2, apresentando atividade de endoquitinase. A reação de imunoblot com anti-Pbcts1r identificou duas proteínas no extrato bruto de levedura. A purificação parcial do extrato bruto de P. brasiliensis por cromatografia de troca-catiônica em HPLC revelou duas quitinases diferentes, Pbcts1 e Pbcts2, com massas moleculares de 45 e 34 kDa, respectivamente. Pbcts2 tem atividade de exoquitinase e Pbcts1 de endoquitinase. Reações com anti-Pbcts1r mostraram a presença de Pbcts1 e Pbcts2 no extrato bruto de levedura e transição de micélio para levedura. No extrato bruto de micélio foi encontrado somente Pbcts1 e no extrato de parede celular de levedura somente Pbcts2. Ambas as proteínas foram encontradas secretadas pela fase parasitária (levedura), mostrando a provável importância dessas proteínas na permanência do fungo no hospedeiro. Relações filogenéticas entre os ortólogos Pbcts1 e a provável Pbcts2 indicam a presença de um ancestral comum. Durante a evolução, P. brasiliensis poderia ter adquirido Pbcts2 e Pbcts1 desempenhando diferentes papéis para o crescimento e sobrevivência do fungo na fase saprofítica e parasitária

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T13:43:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Vieira Tomazett - 2011.pdf: 1259531 bytes, checksum: aa04f3f36448deb32394c0d322cbc8b7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T13:48:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Vieira Tomazett - 2011.pdf: 1259531 bytes, checksum: aa04f3f36448deb32394c0d322cbc8b7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T13:48:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Vieira Tomazett - 2011.pdf: 1259531 bytes, checksum: aa04f3f36448deb32394c0d322cbc8b7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-08-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most important endemic deep mycosis in Latin America. Understanding of the complex interactions between the fungus and host must include the identification of gene expression patterns during infection. Carbonic anhydrase (CA) belongs to the family of zinc metalloenzymes that catalyzes the reversible hydratation of carbon dioxide to bicarbonate. Transcriptional studies have shown that carbonic anhydrase of P. brasiliensis is expressed in yeast cells recovered from liver of infected mice. In the present work, we characterized the cDNAs encoding for four carbonic anhydrases of P.brasiliensis (PbCA1, PbCA2, PbCA3, PbCA4). Recombinant PbCA1, 3 and 4 were obtained in heterologous systems with 33 kDa, 28 kDa and 32 kDa respectively. Mass spectrometry analysis confirmed the sequences of the produced proteins. The expression of PbCAs transcripts was evaluated by using real-time RT-PCR in mycelium, yeast cells and mycelium to yeast transition, in yeast cells exposed to CO2 and yeast cells recovery directly from liver and spleen. In the presence of CO2, PbCA1, PbCA2 and PbCA4 gene expression was reduced in the course of time. PbCA1 transcript expression was induced during the mycelium to yeast transition. PbCA2 and PbCA4 gene expression was higher in yeast cells, when compared to mycelium and mycelium to yeast transition. Pbca1 was induced yeast cells recovery directly from liver and spleen while the transcripts for Pbca2 and Pbca4 were repressed in all condictions. The gene expression data suggest differential roles of the CAs in the fungal physiology. / Paracoccidioidomicose (PCM) é a mais importante micose endêmica na América Latina. A compreensão das interações complexas entre o fungo e o hospedeiro deve incluir a identificação de padrões de expressão gênica durante a infecção. Anidrase carbônica (CA) pertence à família de metaloenzimas de zinco que catalisa a hidratação reversível do dióxido de carbono para bicarbonato. Estudos transcricionais têm mostrado que uma anidrase carbônica de P. brasiliensis é expressa em células de levedura recuperadas de fígado de camundongos infectados. No presente trabalho, nós caracterizamos os cDNAs que codificam para quatro anidrases carbônicas de P.brasiliensis (PbCA1, PbCA2, PbCA3, PbCA4). As recombinante de PbCA1, PbCA3 e PbCA4 foram obtidas em sistemas heterólogos com 33 kDa, 28 kDa e 32 kDa, respectivamente. Análise por espectrometria de massas confirmou as seqüências das proteínas produzidas. A expressão dos transcritos de Pbcas foi avaliada usando real-time RT-PCR em micélio, levedura e transição de micélio para levedura; em células de levedura expostas a CO2 e células de leveduras recuperadas diretamente do fígado e baço. Na presença de CO2, a expressão dos genes de Pbca1, Pbca2 e Pbca4 foi reduzida no decorrer do tempo. A expressão do transcrito de Pbca1 foi induzida durante a transição de micélio para levedura. A expressão de Pbca2 e Pbca4 foi maior em células de levedura, quando comparada com micélio e transição de micélio para levedura.O transcrito para Pbca1 foi induzido em células de leveduras recuperadas diretamente do fígado e baço, enquanto que os transcritos para Pbca2 e Pbca4 foram reprimidos em todas as conduções. Os dados de expressão gênica sugerem diferentes papéis das CAs na fisiologia dos fungos.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas podem ser definidas como proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga reversivelmente de maneira especÃfica a mono ou oligossacarÃdeos. Dentre as lectinas de origem vegetal, as lectinas de leguminosas sÃo as mais estudas, em especial as lectinas pertencentes subtribo Diocleinae. As lectinas da subtribo Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade em sua seqÃÃncia primÃria e estrutura tridimensional, mas apresentam diferentes intensidades em suas atividades biolÃgicas em que sÃo aplicadas, como a induÃÃo da produÃÃo de Ãxido nÃtrico. A estrutura da recÃm cristalizada lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) objetiva esclarecer como essas variaÃÃes ocorrem baseado na geometria dos resÃduos que compÃe o domÃnio de reconhecimento à carboidrato (DRC). A lectina de Canavalia brasiliensis foi purificada e cristalizada pelo mÃtodo de difusÃo de vapor a 293 K. Cristais adequados foram obtidos na condiÃÃo contendo 200 mM de cloreto de sÃdio, 100 mM de hepes pH 8.5 e 1.8 M e sulfato de amÃnio. O cristais apresentam um grupo espacial ortorrÃmbico I222, a cela unitÃria tem dimensÃes de a=68.3 Ã, b=73.0 Ã, c=99.5 à e Ãngulos de &#945; = &#946; = &#947; = 90Â, sendo observado um monÃmero na unidade assimÃtrica e um conteÃdo de 49.5 % de solvente. O refinamento satisfatÃrio apresentou um âRfactorâ e âRfreeâ de respectivamente 20.4% e 25.3%. Foram determinados parÃmetros no potencial de atividade biolÃgica registrada na literatura, onde a lectina de Canavalia maritima (ConM) tem alto potencial de induÃÃo a produÃÃo de Ãxido nÃtrico comparado com a lectina de Canavalia ensiformis (ConA) que tem um baixo potencial de induÃÃo. DiferenÃas significativas foram encontradas entre coordenadas dos resÃduos que compÃe o DRC de lectinas da subtribo Diocleinae, e comparando esses dados com os potenciais de atividade biolÃgica foi estipulado um padrÃo distinto de distancias para lectinas com alto e baixo potencial de induÃÃo. A lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) apresenta um padrÃo de distancias de uma Ãtima indutora de Ãxido nÃtrico como ConM, porÃm apresenta uma atividade inferior que ConA. As distancias da DRC explicam a diferenÃa na atividade, mas a ConBr se mostra um caso excepcional, onde uma avaliaÃÃo do volume do sÃtio mostra um sÃtio extremamente reduzido, o que explica sua discrepÃncia na atividade biolÃgica. / Lectins may be defined as proteins of nonimmune origin that have at least one non-catalytic domain that reversibly binds specifically to mono or oligosaccharides. Among plant lectins, legume lectins are the most studied, in particular those lectins belonging to subtribe Diocleinae. The lectins from subtribe Diocleinae show a high degree of similarity in their primary sequence and three-dimensional structure but have different intensities in their biological activities in which they are applied, such as induction of nitric oxide production. The structure of the newly crystallized lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) aims to clarify how these variations are based on the geometry of the residues that comprise the carbohydrate recognition domain (CRD). The lectin from Canavalia brasiliensis was purified and crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Suitable crystals were obtained under the condition containing 200 mM sodium chloride, 100 mM HEPES pH 8.5 and 1.8 M ammonium sulfate. The crystals have a space group orthorhombic I222, the unit cell has dimensions a = 68.3 Ã, b = 73.0 Ã, c = 99.5 à and angles &#945; = &#946; = &#947; = 90  been observed a monomer in the asymmetric unit with a content of 49.5% solvent. The refinement showed a satisfactory "Rfactor" and "Rfree" of respectively 20.4% and 25.3%. Parameters were determined in the potential of biological activity reported in literature, where the lectin from Canavalia maritima (ConM) has high potential for inducing nitric oxide production compared with the lectin from Canavalia ensiformis (ConA), which has a low potential for induction. Significant differences were found between coordinates of the residues that comprise the CRD of lectins from the subtribe Diocleinae, and comparing these data with potential biological activity was provided a distinct pattern of distances to lectins with high and low potential for induction. The lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) shows a pattern of distances for a great inducer of nitric oxide as ConM, but shows a lower activity than ConA. The distances of CRD explain the difference in activity, but ConBr shown an exceptional case where an assessment of the volume of the site shows a very small site, which explains their discrepancy in biological activity.

Os receptores do tipo Toll compreendem a família de receptores de reconhecimento de padrões melhor caracterizados, que podem ativar diferentes respostas imunes, dependendo de quais receptores e conjuntos de adaptadores são utilizados. Os TLRs, como TLR2, TLR4 e TLR9, e sua sinalização foram implicados no reconhecimento de P. brasiliensis e na regulação da resposta imune, no entanto, o papel do TLR3 ainda não está claro. Assim, a compreensão da função endossomal do TLR3 na PCM experimental é crucial. Utilizamos modelos in vitro e in vivo de infecção por P. brasiliensis, camundongos C57Bl/6 e TLR3-/-, para avaliar a contribuição da TLR3 no desenvolvimento da infecção. Mostramos que ausência de TLR3 leva o aumento de óxido nítrico e a capacidade fagocítica por macrófagos nas primeiras 4 horas de interação com leveduras P. brasiliensis. Mostramos ainda que os camundongos TLR3-/- desempenham papel protetor após 30 dias de infecção intratraqueal com P. brasiliensis, mostrando diminuição do aumento de CFU, perfil de resposta Th1 e Th17, bem como aumento de células citotóxicas T CD8+ produtoras de IFN-&#947; e IL-17. As células citotóxicas T CD8+ mostraram ser essenciais para o controle da infecção nos camundongos TLR3-/-, uma vez que a depleção dessas células levou a progressão da doença. Em estágios iniciais, 3 e 5 dias de infecção, observamos aumento do recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Estudos recentes indicam que o TLR3 é um receptor importante para a resposta imune na micose e sua ausência favorece a infecção por fungos. Em contraste, nossos resultados mostram que, no caso do PCM, o TLR3 é prejudicial ao hospedeiro, sugerindo que a ativação do TLR3 pode ser um possível mecanismo de escape de P. brasiliensis. / Toll-like receptors comprise the best-characterized pattern-recognition receptor family that can activate different immune responses, depending on which receptor and adaptor set are utilized. TLRs, such as TLR2, TLR4 and TLR9, and their signaling have been implicated in the recognition of P. brasiliensis and regulation of the immune response, however, the role of TLR3 remains unclear. Thus, understanding the endosomal function of TLR3 in experimental PCM is crucial. We used in vitro and in vivo models of infection by P. brasiliensis, C57Bl/6 and TLR3-/- mice, to assess the contribution of TLR3 on development of infection. We show that absence of TLR3 leads to increased nitric oxide and phagocytic capacity by macrophages in the first 4 hours of interaction with yeasts P. brasiliensis. We also showed that TLR3-/- mice play a protective role after 30 days of intratracheal infection with P. brasiliensis, showing a decrease in the CFU increase, Th1 and Th17 response profile, as well as an increase in cytotoxic CD8+ cells producing IFN-&#947; and IL-17. The cytotoxic T CD8+ cells were shown to be essential for the control of infection in TLR3-/- mice, since the depletion of these cells led to the progression of the disease. In the initial stages, 3 and 5 days of infection, we observed increased recruitment of neutrophils to the lung. Recent studies indicate that TLR3 is an important receptor for the immune response in mycosis and its absence favors fungal infection. In contrast, our results show that in the case of PCM, TLR3 is detrimental to the host, suggesting that TLR3 activation may be a possible escape mechanism of P. brasiliensis.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Aproximadamente 10 milhões de pessoas que vivem em áreas endêmicas estão infectadas com P. brasiliensis e até 2% destas podem desenvolver a PCM. Períodos extensos de quimioterapia são necessários e problemas de recidiva da doença são frequentes. Vacinas anti-PCM ainda não estão disponíveis para uso em humanos, porém, nos últimos anos, testes em modelo animal mostram que estratégias vacinais são viáveis. Formulações vacinais baseadas na proteína gp43 e no peptídeo P10 específico para células T CD4+ mostram-se promissores como antígenos vacinais. No presente trabalho, testamos as propriedades de uma formulação vacinal terapêutica baseada no peptídeo P10 combinado com flagelina de S. enterica, associada ou não a quimioterapia, como tratamento da PCM experimental. Os resultados indicaram que animais tratados apenas com a vacina, combinada ou não com os quimioterápicos, não demonstraram uma redução significativa da carga fúngica no pulmão. No entanto granulomas mais organizados foram observados no pulmão dos animais que receberam a formulação vacinal. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Approximately 10 million people living in endemic areas may be infected with this fungus and up to 2% of them may develop the disease. Extended periods of chemotherapy are often necessary to treat PCM and relapses occur frequently. PCM vaccines are not yet available for use in humans, but in recent years tests in animal models showed that vaccine strategies are viable. Vaccine formulations based in protein gp43 and a derived peptide P10, representing a CD4+ T cell-specific epitope, have showed promising results as vaccine antigens. In the present work, we tested the properties of a vaccine formulation based on the P10 peptide admixed with the S. enterica flagellin, in combination or not with chemotherapy, as a PCM therapeutic treatment. Treated mice, combined or not with chemotherapy, showed no significant reduction in lung fungal burden. Nonetheless, more organized lung granulomas were observed in animals that received the vaccine formulation.

Como a imunoproteção na Paracoccidioidomicose (PCM) é principalmente mediada por células T, investigamos o impacto da deficiência de CD28, molécula co-estimulatória de linfócitos T, na gravidade da infecção primária e secundária pelo Paracoccidioides brasiliensis. Quando comparados a camundongos C57Bl/6 normais (WT), camundongos CD28-deficientes (CD28KO) apresentaram infecção mais grave associada à produção diminuída de anticorpos e citocinas. Além disso, a pré-imunização de animais deficientes e normais resultou em imunoproteção equivalente. Inesperadamente, a sobrevida de animais CD28KO foi significativamente maior que a dos WT, apesar da sua elevada carga fúngica tecidual. Em conclusão, nosso trabalho mostrou que a deficiência de CD28 resulta em PCM mais grave, porém não letal, associada a resposta imune deficiente. Além disso, verificamos que carga fúngica elevada, na ausência da imunidade adaptativa efetora, não ocasiona diminuição de sobrevida, revelando que a resposta imune na PCM pode tanto proteger como ser deletéria aos hospedeiros. / As immunoprotection in Paracoccidioidomycosis (PCM) is mainly mediated by T cells, and CD28 is a costimulatory molecule for T lymphocytes, we investigated the influence of CD28 deficiency in primary and secondary PCM. Compared with normal C57BL/6 mice, CD28-deficient (CD28KO) mice developed a more severe infection associated with impaired antibody and cytokine production. In addition, CD28KO and WT mice previously immunized by the s.c. route developed equivalent immunoprotection when challenged by the pulmonary route. Interestingly, CD28KO mice presented increased mean survival time despite their elevated fungal loads in the lungs. In conclusion, our work showed, for the first time, that CD28-deficiency results in more severe, but not overwhelming, PCM. Furthermore, in the absence of effector adaptative immunity, elevated fungal loads do not cause lethal infections, revealing the protective and deleterious effects of immune responses to Paracoccidioides brasiliensis infected hosts.

A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica da América Latina causada pelo fungo dimórfico Paraccoccidioides brasiliensis. Os TLRs, e os CLRs são \"Receptores de Reconhecimento Padrão\" (PRRs) que reconhecem os \"Padrões Moleculares Associados aos Patógenos\" (PAMPs). O objetivo deste trabalho foi caracterizar os receptores de macrófagos de camundongos resistentes (A/J) e susceptíveis (B10.A) ao P. brasiliensis envolvidos na interação com o fungo, através do estudo do efeito do tratamento dos macrófagos com agonistas ou antagonistas dos receptores de manose (MR), receptores do tipo Toll 4 (TLR4), receptores de beta-glucanas (dectina-1) e receptores de complemento CR3 (CD11b/CD18), na interação fungo-macrófago. O tratamento dos macrófagos com o agonista de MR (manana), ativou ambos os macrófagos A/J e B10.A. O bloqueio dos receptores MR, TLR4 e CR3 com anticorpos monoclonais específicos, induziu inibição dos macrófagos, mostrando a importância destes receptores no reconhecimento dos carboidratos presentes na parede do fungo. O tratamento com os agonistas de dectina-1 (laminarina e curdlan) induziram ativação dos macrófagos, porém de maneira distinta entre as linhagens. A laminarina pareceu ativar macrófagos B10.A e inibir A/J; curdlan por sua vez, pareceu ativar macrófagos A/J e inibir B10.A.Estes dados sugerem que diferentes perfis de ativação dos macrófagos atuem no reconhecimento do fungo. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis of Latin America caused by Paraccoccidioides brasiliensis, a dimorphic fungus. The TLRs and CLRs are \"Pattern Recognition Receptors\" (PRRs) which recognize \"Pathogen Associated Molecular Patterns\" (PAMPs). The aim of our work was to characterize the macrophages receptors from resistant (A/J) and susceptible (B10.A) mice to P. brasiliensis involved in the interaction with the fungus. We studied the effect of macrophages treatment with agonists or antagonists of mannose receptors (MR), Toll like receptors 4 (TLR4), <font face=\"Symbol\">b-glucans receptors (dectin-1) and complement receptors CR3 (CD11b/CD18), in the interaction fungus-macrophages. The macrophages treatment with mannan agonist of MR activated both A/J and B10.A macrophages. The blockade of MR, TLR4 and CR3 receptors with specific monoclonal antibodies, induced macrophages inhibition, showing the importance of these receptors in the recognition of common carbohydrates presents on the cell wall of the fungus. The macrophages treatment with laminarin and curdlan agonists of dectin-1, induced macrophages activation, however in the distinct manner between both macrophages lineages. Laminarin appeared to activate B10.A macrophages and inhibit A/J; whereas curdlan appeared to activate A/J macrophages and inhibit B10.A. These data suggest that a different profile of macrophages activation plays in the fungus recognition.