FRUTUOSO, Mércia Sindeaux. Efeito adjuvante da lectina de Canavalia brasiliensis no tratamento de Leishmaniose cutânea experimental. 2016. 117 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:05:19Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Rejected by Jairo Viana (jairo@ufc.br), reason: Está faltando título em inglês on 2017-09-19T19:06:36Z (GMT) / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:07:21Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:08:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T19:08:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) Previous issue date: 2017 / The leishmaniases are importante public health problem, comprising a very wide spectrum of clinical presentations. The host protection and cure, depend on his or her capacity to mount an imune response type Th1, and IFN-γ is a key molecule on this protective response. The drugs of first choice for the treatment are the pentavalent antimonials, which cause several side effects and the most concerning side effect is the cardiotoxic ones. On the search for alternative treatment, fluconazole has shown promising results, however it has to be given for a longer time and in higher doses to achieve a better response. The Canavalia brasiliensis lectin (ConBr) has been described as a potent immune modulator, as it induces lymphocytic proliferation, with the production of IFN-γ. Based on these data we studied, if ConBr would potentiate the effect of fluconazole on the treatment of experimental cutaneous leishmaniasis, caused by L. braziliensis. To evaluate this, BALB/c mices (n=40) were infected with L. braziliensis and were divide randomly 10 days post-infection, in 5 groups, with the following treatments: 1- fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os); 2- Glucantime® (60mg/Kg/day/10days, intramuscular); 3- ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 4- Fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os) plus ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 5- Saline solution per os. The parameters evaluated on the 200 day post infection were: the thickness of the lesion every third day; parasite load on the draining lymph node; production of IFN-γ, IL-10, and TGF-β in cell culture of the draining lymph node supernatant, stimulated in vitro with promastigotes of L. braziliensis; relative liver and spleen weight and histopathological analysis of the lesions. Animals that were treated with the association of fluconazole and ConBr, when compared with those treated with saline solution, presented a significant reduction on the parasite load on the draining lymph nodes (p=0,006), reduction in lesion size (p=0,03) and higher production of IFN-γ on the supernatant of cell culture of regional lymph nodes (p=0,03). Similar data were observed on the group treated with Glucantime®, and all together, demonstrate that the association of fluconazole and ConBr was capable of inducing a therapeutic response similar to the one seen in the group treated with Glucantime®, which is considered the gold standard in the treatment for leishmaniasis. / As leishmanioses constituem grande problema de saúde pública, compreendendo um amplo espectro de síndromes clínicas que pode ter manifestações diversas. Proteção e cura do hospedeiro se correlacionam com o desenvolvimento de resposta imune tipo Th1, e IFN-γ é considerada uma molécula chave nesta resposta protetora. A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses é o antimonial pentavalente, que possui vários efeitos colaterais, especialmente seu efeito cardiotóxico. Na busca de novas alternativas de tratamento, o fluconazol vem apresentando dados promissores, porém necessita de um maior tempo de tratamento ou de doses mais elevadas para apresentar uma melhor resposta. A lectina de Canavalia brasilienses (ConBr) tem sido descrita como potente imunomodulador, pois induz proliferação linfocitária com produção de IFN-γ. Com base nesses dados, buscou-se avaliar se ConBr potencializaria o efeito do Fluconazol no tratamento da leishmaniose cutânea experimental por Leishmania (Viannia) braziliensis. Para isso, camundongos BALB/c (n=40) foram infectados com L. braziliensis e divididos aleatoriamente, após 10 dias de infecção, em cinco grupos, com os seguintes tratamentos: 1- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral); 2- Glucantime® (60mg/Kg/dia/10dias, por via intramuscular); 3- ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, por via intramuscular); 4- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral) associado com ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, intramuscular); 5- solução salina por via oral. Os parâmetros avaliados no 20o dia pós-infecção foram: a espessura das lesões a cada três dias; a carga parasitária no linfonodo de drenagem; secreção de IFN-γ, IL-10, TGF-β no sobrenadante de culturas de células do linfonodo de drenagem reestimulados in vitro com promastigotas de L. braziliensis; peso relativo do fígado e do baço e análise histopatológica das lesões. Os animais que foram tratados com a associação Fluconazol-ConBr, quando comparados com o grupo tratado com salina, apresentaram uma redução significativa da carga parasitária do linfonodo de drenagem (p=0,006), redução no tamanho da lesão (p=0,03) e maior síntese de IFN-γ no sobrenadante das culturas de células do linfonodo regional (p=0,03). Dados semelhantes foram observados no grupo tratado com Glucantime®, o que em conjunto, demonstra que a associação Fluconazol-ConBr foi capaz de induzir uma resposta terapêutica semelhante ao tratamento com Glucantime®, considerado padrão ouro.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:53:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luzinei_couto_ioc_mest_2014.pdf: 3229136 bytes, checksum: e00df22ea1070f548fd298cf2fe9a40c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Resultados anteriores demonstraram que a administração oral e intranasal de antígenos brutos de Leishmania (Leishmania) amazonensis (LaAg) protege parcialmente camundongos contra a infecção por L. amazonensis. No entanto, estudos de vacinação contra as espécies do subgênero Viannia, as principais espécies causadora da leishmaniose cutânea e mucosa nas Américas, têm sido dificultados pela falta de modelos experimentais de fácil manuseio que reproduzam a doença humana. Recentemente, foi demonstrado que o hamster dourado é um modelo adequado para o estudo da imunopatogênese da leishmaniose cutânea causada por L. (Viannia) braziliensis. Usando o modelo hamster, investigamos se o efeito protetor da imunização intranasal com LaAg pode ser estendido a infecção por L. braziliensis. Hamsters foram vacinados com duas doses de LaAg (10 \03BCg) intranasal (IN) ou duas doses de LaAg (20 \03BCg) por via intramuscular (IM) e duas semanas após a vacinação foram desafiados com L. braziliensis Os resultados demonstraram que a imunização com LaAg reduziu significativamente o crescimento da lesão e da carga parasitária, bem como os níveis de IgG e IgG2 no plasma. No final do experimento, 114 dias após a infecção, os hamsters que foram considerados protegidos expressaram na pele níveis semelhantes de mRNA para IFN-\03B3 e IL-10 comparados aos níveis na pele de animais não infectados, diferentemente do observado nos animais não protegidos. Comparando com a via nasal, a imunização pela via intramuscular (IM) não induziu proteção. Estes resultados demonstram pela primeira vez que a imunização pela via nasal pode induzir proteção cruzada contra a infecção por L. braziliensis / Previous results have shown that oral and intranasa l administration of crude Leishmania (Leishmania) amazonensis antigens (LaAg) partially protects mice against L. amazonensis infection. However, vaccination studies on species of the subgenus Viannia , the main causative species of cutaneous and mucos al leishmaniasis in the Americas, have been hampered b y the lack of easy-to-handle bio-models that accurately mimic the human disease. Recently, we demonstrated that the golden hamster is an appropriate model for studying the immunopathogenesis of cutaneous leishmaniasis cause d by L. (Viannia) braziliensis. Using the golden hamster model, we investigated whe ther the protective effect of intranasal immunisation with LaAg can be extended t o L. braziliensis infection. Golden hamsters vaccinated with either two intranas al (IN) doses of LaAg (10 μ g) or two intramuscular doses of LaAg (20 μ g) were challenged 2 weeks post-vaccination with L. braziliensis. The results showed that IN immunisation with LaAg s ignificantly reduced lesion growth and parasitic load as well as serum IgG and IgG2 levels. At the experimental endpoint on day 114 post-infection , IN-immunised hamsters that were considered protected expressed IFN- γ and IL10 mRNA at similar levels as uninfected skin. Unlike what was observed in animal s not protected. In contrast to the nasal route, intramuscular (IM) immunisation failed to provide protection. These results demonstrate for the first time that the nas al route of immunisation can induce cross protection against L. braziliensis infection.

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 giselle_silva_ioc_dout_2015.pdf: 2379101 bytes, checksum: bcd0b4f190cd3499302de8d2895fdbe7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A principal estratégia para controlar a leishmaniose tegumentar Americana (LTA) seria a imunoprofilaxia. Entretanto, até o momento ainda não existe uma vacina, dificultando o controle da doença. Ademais, ainda não se conhece quais são as condições que contribuem para que indivíduos infectados evoluam sem desenvolver sinais clínicos da doença, apresentem insucesso terapêutico, ou que venham a desenvolver a forma mucosa da leishmaniose. O propósito desta tese foi avaliar a evolução pós-tratamento de casos de infecção por Leishmania naiffi (Ln) e L. braziliensis (Lb) sob dois aspectos diferentes: 1) descrever uma série de casos de LTA causados por Ln selecionados dentre trinta pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, no período de 2011 a 2013. 2) avaliar se a assinatura imunológica, em termos de subclasses de imunoglobulina e perfil de diferenciação celular e memória, é similar entre pacientes de Lb com até 26 anos de cura após tratamento com dois diferentes esquemas terapêuticos com antimônio. Foram estudados 43 pacientes curados de leishmaniose cutânea (LCC), sendo estes divididos em dois grupos: pacientes de LCC acompanhados desde a fase ativa até três anos (a) após cura da infecção por Lb (n= 23, LCC<3a) e pacientes LCC com até 26 anos de cura da infecção por Lb (n= 12, LCC 12-26a). Além disso, 30 isolados de Leishmania de pacientes de leishmaniose cutânea (LC) proveniente da FMT-HVD foram avaliados Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram analisadas após estímulo in vitro com antígenos de Lb. A fenotipagem das subpopulações de linfócitos T foi realizada através da citometria de fluxo quanto à ativação, imunosenescência e memória imunológica. A produção de IgG e suas subclasses anti-Leishmania foram avaliadas por ELISA. Os isolados de Leishmania foram caracterizados quanto à espécie pela técnica de isoenzimas. A presença do Leishmania RNA vírus (LRV) na Ln foi avaliada por sequenciamento. Após a cura clínica foi observada uma redução dos níveis de IgG1 e IgG3 anti-Lb (p<0.0001). O tempo de cura clínica neste estudo correlacionou-se negativamente com os valores de Índice de ELISA (IE) obtidos a partir de amostras de LCC<3a, para IgG (r= -0.79; p<0.0001), IgG1 (r=-0.64, p<0.001) e IgG3 (r= -0.4; p<0.05). As CMSP dos compartimentos de memória dos LCC 12-26a apresentaram aumento da ativação das células TME e TMC (p<0.05) frente aos antígenos de Lb, apesar de não ter sido observado expansão destes compartimentos. Foi observada uma frequência de 26,7% da Ln entre os isolados de LC. Ademais, dois pacientes de Ln evoluíram com falha terapêutica após o tratamento com antimonial ou pentamidina. Em um caso clínico foi descrita uma possível associação entre o LRV presente na Ln e o insucesso terapêutico por pentamidina Os resultados acima indicam que: (1) após longo tempo de cura ocorre uma modulação da reposta imune de memória capaz de manter suas células ativadas, mas não expandir seus compartimentos frente a uma nova estimulação antigênica específica. Além disso, a IgG1 e IgG3 surge como uma importante ferramenta a ser utilizada no acompanhamento clínico dos pacientes. (2) Os casos de LTA por Ln podem não ser tão raros e nem ter um caráter benigno como é descrito na literatura. Estudos posteriores na região Amazônica poderão fornecer mais informação sobre a LTA causada por L. naiffi / The main strategy to control American tegumentary leishmaniasis (AT L) is immunoprophylaxis. T o date , no vaccine is available to control spread of the disease. Moreover, is still unknown what are the conditions that contribute to infected individuals evolve without developing clinical signs of disease, presenting therapeut ic failure, or otherwise, will develop mucosal leishmaniasis. Thus, the purpose of this thesis was to evaluate the evolution of post - treatment cases of infection with Leishmania naiffi ( Ln ) and L. braziliensis ( Lb ) under two different aspects: 1) describe a series of cases of ATL caused by Ln selected from thirty cutaneous leishmaniasis (CL) patients attend at the FMT - HVD, Manaus, in the period 2011 - 2013. 2) Evaluating the immunological signature, in terms of immunoglobulin subclasses and differentiation pr ofile and memory is similar between patients Lb with 26 years of healing after treatment with two different treatment regimens with antimony. We studied 43 patients cured cutaneous leishmaniasis (CCL), which are divided into groups: CCL patients followed f rom the active phase to three years (y) after cure of Lb infection (n= 23, CCL<3y), CCL patients healed with up 26 years after infection by Lb (n= 12, CCL 12 - 26y ). In addition, 30 isolates of Leishmania of patients with cutaneous leishmaniasis (CL) from FM T - HVD were evaluated. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were analyzed after in vitro stimulation with antigen Lb . The phenotyping of T lymphocyte subpopulations was performed by flow cytometry for the activation, immunological memory and immunosene scence. The production of IgG and its subclasses anti - Lb were evaluated by ELISA. Isolates of Leishmania were characterized as to species by isozyme technique. The presence of LRV in Ln was evaluated by sequencing. After clinical cure was observed a reduct ion in the levels of IgG1 and IgG3 anti - Lb ( p <0.0001). The time of cure this clinical study was negatively correlated with the EI values obtained from CCL<3y samples for IgG (r= - 0.79; p <0.0001), IgG1 (r = - 0.64, p <0.001) and IgG3 (r= - 0.4, p<0.05). PBMC of CCL 12 - 26y patients showed increased activation of TEM and TCM cells ( p <0.05) when stimulated with Lb antigens, despite not having been observed expansion of these compartments. A frequency 26.7% of Ln between CL isolates was observed. In addition, two Ln patients progressed with treatment failure after treatment with antimony or pentamidine. In a clinical case was described a possible association between the LRV present in Ln and therapeutic failure by pentamidine. The above results indicate that: (1) after long time healing there is a modulation of the immune response of memory able to maintain its activated cells but not expand its compartments front of new specific antigen stimulation. Moreover, IgG1 and IgG3 appear as an important tool to be used in clinical patient monitoring. (2) cases of LTA by Ln may not be as rare and even have a benign character as described in the literature. Later studies in the Amazon region may provide more information about ATL caused by L. naiffi

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-10-04T13:54:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1012064 bytes, checksum: 4afa27336f4b5af38cc608a70309aaf8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-04T13:54:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1012064 bytes, checksum: 4afa27336f4b5af38cc608a70309aaf8 (MD5) Previous issue date: 2016-11-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As Leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania e suas manifestações clínicas podem ser do tipo Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Mucocutânea e Leishmaniose Visceral. Constitui importante problema de saúde pública sendo endêmicas em 88 países com aproximadamente 12 milhões de infectados. Para o tratamento são utilizados os antimoniais pentavalentes e como medicação alternativa, a Anfotericina B e Pentamidina. O arsenal terapêutico é bastante limitado, vários medicamentos têm efeitos colaterais significativos e os parasitos muitas vezes são resistentes às drogas disponíveis. Baseado na necessidade do desenvolvimento de novas drogas para o tratamento das Leishmanioses, neste presente trabalho foi testado o potencial leishmanicida de trinta e um compostos derivados do ácido cinâmico contra Leishmania (Viannia) brasiliensis, agente etiológico da Leishmaniose Tegumentar Americana no Novo Mundo. Dentre esses compostos, vinte e um contém o núcleo 1,2,3- triazólico e quatro contém uma porção izobenzofuranona. A triagem inicial foi feita em macrófagos utilizando os compostos na concentração de 10 μM e nenhum deles apresentou efeito tóxico. No ensaio de citotoxicidade direta sobre formas promastigotas, após 48 horas, um deles, o (E)-3-(3,4,5- trimetoxifenil)-acrilato de 3-oxo-1,3-diidroisobenzofuran-5-ila, identificado como S2, apresentou taxa de 52,25% de inibição de crescimento dos parasitos, valor aproximado do efeito da droga controle Anfotericina B (46,62%). Em ensaios de infecção do parasito em macrófagos, após 72 horas, quatro compostos: Cinamato de (1-(2,5-diclorobenzil)-1H-1,2,3-triazol-4- il)metila (MP05), Cinamato de (1-(2,4,6-triclorobenzil)-1H-1,2,3-triazol-4- il)metila (MP06), Cinamato de (1-(4-metoxibenzil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metila (MP25) e novamente o (E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-acrilato de 3-oxo-1,3- diidroisobenzofuran-5-ila (S2), inibiram a sobrevivência de amastigotas em 78,98%, 80,12%, 76% e 70,89% respectivamente. Conforme os resultados obtidos, tais compostos mostram-se potenciais para o tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana. / Leishmaniasis are parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania and its clinical manifestations may be of the Cutaneous Leishmaniasis type, Mucocutaneous Leishmaniasis and Visceral Leishmaniasis. It is an important public health problem and it has being endemic in 88 countries with approximately 12 million infected people. For the treatment, pentavalent antimonials are used and as an alternative medication, they use amphotericin B and pentamidine. The therapeutic arsenal is quite limited, several drugs have significant side effects and the parasites are often resistant to the available drugs. Based on the need for the development of new drugs for the treatment of Leishmaniasis, in this present work the leishmanicidal potential of thirty-one acid cinnamic derived compounds against Leishmania (Viannia) brasiliensis, etiological agent of American Cutaneous Leishmaniasis in the New World, was tested. Among these compounds, twenty-one contains the 1,2,3-triazole nucleus and four contains an izobenzofuranone portion. Initial screening was done on macrophages by using the compounds at the concentration of 10 μM and none of them showed a toxic effect. In the direct cytotoxicity assay on promastigote forms, after 48 hours, one of them, (E) -3- (3,4,5-trimethoxyphenyl) acrylate 3-oxo-1,3- dihydroisobenzofuran-5-yl, identified as S2, presented a 52.25% rate of inhibition of parasite growth, the approximate value of the control drug Amphotericin B (46.62%). In parasite infection trials on macrophages, after 72 hours, four compounds: (1- (2,5-Dichlorobenzyl) -1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl cinnamate (MP05), Cinnamate (1- (2,4,6-trichlorobenzyl) -1H-1,2,3-triazol-4- yl) methylamine (MP06), 1- (4-Methoxybenzyl) -1H-1,2,3- 4-yl) methylamine (MP25) and (E) -3- (3,4,5-trimethoxyphenyl) acrylate 3-oxo-1,3- dihydroisobenzofuran-5-yl (E2) refrained the survival of amastigotes in 78.98%, 80.12%, 76% and 70.89% respectively. According to the obtained results, such compounds are shown to be potential for the treatment of American Cutaneous Leishmaniasis.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6577_MÁRCIO PAIVA BARCELLOS.pdf: 784607 bytes, checksum: f5b3385e81ef47267a52a1f039b91947 (MD5) Previous issue date: 2013-07-19 / Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, Alegre, ES, 2013. A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença difundida em diversos países e os derivados antimoniais pentavalentes são as drogas de escolha no tratamento desta enfermidade para humanos, porém como recomendado pelo Ministério da Saúde, é contra indicado para o tratamento em animais, justificando a busca de novas terapias para o tratamento da LTA em caninos. O objetivo deste trabalho foi testar o uso da furazolidona (FZ) no tratamento de lesões cutâneas em cães portadores de LTA. O estudo foi feito em nove cães com lesões da doença confirmados por técnicas de ELISA, biópsia para PCR e cultura para Leishmania (V.) braziliensis. O medicamento foi administrado via oral na dosagem de 20 mg/Kg a cada doze horas durante sete dias, em três etapas com intervalo de 10 dias, foram realizados exames laboratoriais para monitoramento dos padrões hematológicos e bioquímicos. A regressão da lesão foi observada em 77,77% dos animais, o que demonstrou o efeito terapêutico da droga no tratamento clínico das lesões dos cães com LTA.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6579_MÁRCIO PAIVA BARCELLOS.pdf: 784607 bytes, checksum: f5b3385e81ef47267a52a1f039b91947 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença difundida em diversos países e os derivados antimoniais pentavalentes são as drogas de escolha no tratamento desta enfermidade para humanos, porém como recomendado pelo Ministério da Saúde, é contra indicado para o tratamento em animais, justificando a busca de novas terapias para o tratamento da LTA em caninos. O objetivo deste trabalho foi testar o uso da furazolidona (FZ) no tratamento de lesões cutâneas em cães portadores de LTA. O estudo foi feito em nove cães com lesões da doença confirmados por técnicas de ELISA, biópsia para PCR e cultura para Leishmania (V.) braziliensis. O medicamento foi administrado via oral na dosagem de 20 mg/Kg a cada doze horas durante sete dias, em três etapas com intervalo de 10 dias, foram realizados exames laboratoriais para monitoramento dos padrões hematológicos e bioquímicos. A regressão da lesão foi observada em 77,77% dos animais, o que demonstrou o efeito terapêutico da droga no tratamento clínico das lesões dos cães com LTA.

As chaperonas moleculares da família Hsp70 desempenham funções cruciais nas células de todos os organismos vivos, de procariotos a eucariotos. Nestes, estão presentes em todos os compartimentos celulares e nas mitocôndrias é expressa uma isoforma própria (mtHsp70), que participa dos processos enovelamento e maturação de proteínas bem como de sua importação para a matriz mitocondrial. Diante da crescente demanda de pesquisa sobre doenças tropicais negligenciadas, foi tomado como objeto de estudo neste trabalho uma Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis (LbmtHsp70) com o intuito de caracterizá-la estrutural e funcionalmente em comparação à ortóloga humana com maior identidade: a mtHsp70 também chamada de mortalina, GRP75, HspA9 ou PBP74. A LbmtHsp70 foi purificada em sua forma enovelada, em sistema monodisperso apresentando dados hidrodinâmicos condizentes com a forma monomérica, foi testada sua estabilidade quanto à influência de nucleotídeos de adenosina (ATP e ADP) à sua estrutura e, por fim, foram feitos ensaios para avaliar sua atividade ATPásica e de energia de interação com nucleotídeos. De forma geral, a LbmtHsp70 é bastante similar à mortalina, como pode ser evidenciado pelos resultados obtidos com algumas particularidades. / The molecular chaperones from the Hsp70 family perform critical cell roles in all organisms, from prokaryotes to eukaryotes. In the last ones, they are found in all cell compartments and a particular isoform is expressed in the mitochondria, where it carries out folding and maturation processes as well as the import of proteins to the mitochondrial matrix. In face of the growing demand for research about neglected tropical diseases, in this study a Hsp70 from Leishmania braziliensis\'s mitochondria was taken as object of study for further structural and functional characterization in comparison to the human orthologous which presents the highest identity to LbmtHsp70: the mtHsp70 also known as mortalin, GRP75, HspA9 or PB74. LbmtHsp70 was obtained in folded state in monodisperse system with hydrodynamic data consistent to monomeric conformer, stability and adenosine nucleotides influence to its structure were analyzed, and were performed assays for ATPase activity and nucleotide interaction energy. In a general way LbmtHsp70 is very similar to mortalin as can be shown through the results, but with some peculiarities.

Leishmania braziliensis é o agente responsável pela maior parte dos casos de leishmaniose tegumentar e mucocutânea no Brasil. Entre as espécies incriminadas como vetoras, na região Sudeste encontram-se Nyssomyia intermedia e Nyssomyia neivai. A comprovação destas espécies como responsáveis pela transmissão de Leishmania sp. depende de vários fatores, entre estes, a competência vetorial, definida como a capacidade da espécie se infectar e repassar a infecção para um hospedeiro vertebrado. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo avaliar experimentalmente a competência vetorial de Ny. intermedia e Ny. neivai para transmitir L. braziliensis. Métodos: Fêmeas de primeira geração de ambas as espécies foram alimentadas em hamster infectado com L. braziliensis e após a oviposição, desafiados a um segundo repasto sanguíneo em hamsters susceptíveis (limpos). Adicionalmente, foram obtidos dados do desenvolvimento imaturo das duas espécies. Resultados: em relação ao ciclo imaturo, observou-se que a maior mortalidade ocorreu no primeiro instar larval para ambas as espécies, 27,6% para Ny. intermedia e 53,9% para Ny. neivai. O quarto instar larval teve a maior duração, com mediana de 8 a 12 dias. Quanto à susceptibilidade à infecção das fêmeas colonizadas de ambas as espécies 0,89% das fêmeas de Ny. intermedia e 8,33 % das fêmeas de Ny. neivai apresentaram infecção por L. braziliensis. Nenhuma fêmea de Ny. intermedia realizou um segundo repasto sanguíneo, enquanto que 3 fêmeas de Ny. neivai realizaram. Destas, duas estavam infectadas e o hamster potencialmente infectado ficou em observação por dois meses. Amostras de tecido do hamster exposto demostraram, por meio de PCR, a presença de L. braziliensis. Conclusão: Nyssomyia intermedia apresentou desenvolvimento de formas flageladas porém não repassou a infecção a um hospedeiro suscetível. Nyssomyia neivai, além de se infectar com a L. braziliensis, também repassou a infecção a um hospedeiro suscetível, demostrando assim sua competência vetora. / Leishmania braziliensis is the agent related to cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil. Among the sandflies involved in the Leishmania sp transmission in the Southeast Region, Ny. intermedia and Ny. neivai are suspected vectors. However, the incrimination of these species as vectors in the transmission of Leishmania sp. depends of several factors, including vector competence, defined as the ability of the species to develop the agent and transmit it to a vertebrate host. Objective: The present study aimed to demonstrate the vector competence to Ny. intermedia and Ny. neivai for L. braziliensis. Methods: To develop the experiments,specimens of both species were reared under laboratory conditions and the adults obtained were used to evaluate the vector competence. Thefemales were fed in infected hamsters and after oviposition, challenged to take a bloodmeal in suscetible hamsters (without infection). All females fed on infected hamster were dissected. The hamster bitted in the exposition were follow up for two months, after that, were euthanatized to evaluate the infection by PCR. Result: The highest immature mortality occurred in the first instar larval for both species, 27.6% for Ny. intermedia and 53.9% for Ny. neivai. The fourth larval instar had the longest duration, with a median varying between 8 to 12 days. About the females of Ny intermedia, only 0.89% of them develop the flagellates. For Ny. neivai, among 36 females feed on infected hamster, 2 were infected. None female of Ny intermedia take a second blood meal and 3 of Ny. neivai have had. The hamsters bitted by the infected females were follow up for 60 days. After that the hamster were euthanatized and the infection was observed. Conclusion: The vector competence of Ny. neivai to transmit Leishmania braziiensis was demonstrated. The susceptibility of Ny. intermedia to develop this leishmania was corroborated.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania spp que afetam 98 países. No Brasil, no ano de 2013, foram relatados 3.253 casos de leishmaniose visceral e 18.226 casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. O tratamento de primeira escolha continua sendo realizado com antimoniais pentavalentes, e em casos de insucessos os fármacos de segunda escolha são a pentamidina e a anfotericina B. Tais medicamentos causam intensos efeitos adversos e ultimamente têm surgido cepas resistentes aos mesmos. Em áreas endêmicas têm sido cada vez mais comum o surgimento da co-infecção Leishmania com Mycobacterium tuberculosis. O tratamento para a tuberculose com pirazinamida (PZA) e isoniazida (INZ), controla a leishmaniose. Esses dados sugerem atividade anti-leishmania da PZA e da INZ. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade in vitro da INZ e da PZA e seus compostos derivados (série G e série R, respectivamente) sobre Leishmania (Viannia) braziliensis. As moléculas foram testadas em monocamadas de macrófagos peritoneais de camunongos infectados com L. (V) braziliensis durante 48h. Todas as moléculas testadas inibiram o índice de infecção de forma dose dependente em comparação aos controles. As moléculas da série R foram mais ativas do que a PZA, porém o resultado foi significativo somente para a R02 (p < 0,005). Apenas a molécula R05 (76,64M) foi relativamente tóxica para macrófagos. Os compostos mais ativos foram R02, G01 e G02, cujos índices de seletividade foram 14,31, 19 e 30, respectivamente. A dosagem de nitrito foi feita em sobrenadantes de monocamadas de macrófagos peritoniais infectados e tratados com as substâncias nas concentrações 10 e 100M. A G01 e a G02 estimularam a produção de NO2 nas duas concentrações, entretanto o resultado foi estatisticamente significativo para a G02 em 100M (p < 0,0001), a G05 só estimulou óxido nítrico na maior concentração. Todos os compostos da série R estimularam NO2, contudo, o resultado foi estatisticamente significativo para a R03 e R05 a 100M (p < 0,001). Adicionalmente, foi realizado uma análise preditiva in sílico de parâmetros farmacocinéticos das moléculas mais ativas in vitro, utilizando o software admetSAR. Os dados obtidos mostraram que de forma semelhante às suas moléculas originais a G01, G02 e R02 apresentaram alta capacidade de serem absorvidas pelo trato gastrointestinal, baixo potencial hepatotoxico e carcinogênico. Juntos, esses dados demonstram que essas moléculas são seletivamente tóxicas para o parasito com potencial para serem testadas pela via oral em estudos em modelo experimental de infecção. / Leishmaniasis are a group of diseases caused by protozoan of genus Leishmania spp affecting of 98 countries. In Brazil, in the year 2013 were 3.253 reported cases of visceral leishmaniasis and 18.226 cases of cutaneous leishmaniasis. The first choice of treatment is still performed with pentavalent antimonials and in cases of failures drugs of second line of treatment are pentamidine and anfotericin B. These drugs cause many adverse effects and has lately emerged resistant strains. In endemic areas it has been increasingly common the appearance of co-infection Leishmania and Mycobacterium tuberculosis. The treatment of tuberculosis with pyrazinamid and isoniazid control the leishmaniasis.The aim of this study was evaluate the anti-leishmania activity in vitro of INZ and PZA and yours derivatives compounds (serie G and serie R,respectively) on the Leishmania (Viannia) braziliensis. The molecules were tested on infected monolayers of peritoneal murine macrophages for 48h. All the molecules te inhibited the infection index in a dose-dependent manner in relation to controls. The molecules of the R series were more active than PZA, but the result was only significant for R02 (p < 0,005). Only R05 (CC50 = 76,64M) was relatively toxic to macrophages. The most active compounds were R02, G01 and G02 whose select index were 14,31, 19 and 30, respectively. Nitrite assay was performed in supernatants of infected monolayers of peritonial macrophages treated with the substancies at 10 and 100M. G01 and G02 stimulated NO2 prodution, however, the result was only statistically significant for G02 at 100M (p < 0,001). All the compounds of R serie stimulated NO2 production however the results were statistically significant for the R03 and R05 at 100M (p < 0,001). Additionally, a in silico preditive pharmacokinetic analysis was performed to active molecules using the admetSAR software the data showed that G01, G02 and R02 were similar to their original molecules as to high capacity to be absorbed by the gastrointestinal tract, low hepatotoxic and carcinogenic potencial. Together, these data demonstrate that these molecules are selectively toxic to the parasite with the potencial to be tested orally on studies in experimental infection.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Estudos prévios mostraram que o flavonóide quercetina tem ação terapêutica pela via oral em camundongos infectados com L. amazonensis. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do flavonóide quercetina sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário da quercetina foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos e hamsters. O efeito da quercetina sobre macrófagos foi avaliado pela dosagem de óxido nítrico pelo método de Griess nos sobrenadantes das culturas e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular através do H2DCFDA. In vivo a atividade terapêutica da quercetina foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com quercetina pela via oral (2mg/ 5X / semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas.A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A quercetina não apresentou atividade sobre o crescimento de promastigotas em cultura em nenhuma das concentrações testadas. Em amastigotas intracelulares quercetina apresentou ação dose dependente em macrófagos de camundongos e hamsters inibindo 45% e 54% e 25% e 48 %, respectivamente nas concentrações de 50 e 100g/ml após 48h de tratamento. O pré - tratamento dos macrófagos de camundongos e hamsters com quercetina foi capaz de inibir o crescimento de amastigotas intracelulares em 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58% respectivamente, nas concentrações de 25, 50 e 100 g/ml, apresentado ação inibitória significativa em todas as concentrações testadas. Não houve alteração na produção de NO pelos macrófagos, entretanto macrófagos pré tratados com a quercetina por 24 horas antes da infecção apresentaram um aumento significativo na produção de EROs, quando comparados aos controles. Macrófagos tratados antes e depois da infecção, apresentaram diminuição da produção de EROs. In vivo, a quercetina foi capaz de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado ( P< 0,05). Os animais tratados com quercetina apresentaram maior resposta intradérmica aos antígenos de L. braziliensis. Esses dados mostram que a quercetina tem atividade sobre L. braziliensis, inibindo amastigotas intracelulares in vitro e sendo capaz de controlar o tamanho das lesões em hamsters infectados quando administrada pela via oral. / Leishmaniasis are among the most important endemic diseases in Brazil and are among the most neglected diseases in the world. The therapeutic tools available is restricted, toxic, expensive and ineffective in some situations, due to the emergence of resistant strains of the parasite are reported annually in Brazil more than 20.000 cases of cutaneous leishmaniasis. a Leishmania braziliensis is the main species causing clinical forms of skin and mucosa. Previous studies demonstrated therapeutic effect of quercetin flavonoid by oral route in mice infected with L. amazonensis. The aim of this study was to evaluate the activity of quercetina in Leishmania braziliensis in vitro and in vivo using hamsters as experimental model. The antiparasitic effect was evaluated in vitro on the growth of promastigotes and on intracellular amastigotes in mouse and hamsters peritoneal macrophages. The effect on the modulation of murine macrophage activation was assessed by measuring levels of nitric oxide(Griess reagent) and ROS by H2DCFDA. In vivo therapeutic activity of quercetin was studied in groups of hamsters infected with L.braziliensis in the paw, treated with oral routes by quercetin (2mg/ 5X / week) after 7 days of infection for eight weeks. The therapeutic action was analyzed using the size of the lesion. The immune response was evaluated during treatment by the response of delayed hypersensitivity (DTH) to the total antigen of L. braziliensis. Quercetin showed no activity in promastigotes forms in none of the concentration tested. The antiamastigote action is a dose dependent manner, in mice and hamsters macrophages treated for 48 hours inhibiting 45% e 54% and 25% e 48 %, respectively, at concentrations of 50 and 100 g/ml. No inibihition was observed at concentration of 25 g/ml. The pre- treatment of mice and hamsters macrophages inibihited 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58%, respectively at the concentrations of 25, 50 and 100 g/ml the growth of intracellular amastigotes, showing inhibitory effects on all concentrations tested. No production of nitric oxide was observed in macrophages. Pre treated macrophages before infection, shows an increase of ROS, when compared to controls, while macrophages treated before and after infection showed an decrease of ROS production. In vivo, quercetin was able to control de size of lesion since the third week of of treatment, when compared to untreated controls (P< 0,05). These dates show quercetin activity on L. braziliensis, inhibiting amastigote growth in vitro and being able to control lesion size in infected hamster when administred by oral route.