In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a "license". Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die "Lizenz" IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.

Multiple Sklerose (MS) ist eine heterogene Krankheit des Zentralnervensystems, deren pathologische Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Die gegenwärtige Hypothese ist, daß pro-inflammatorische T-Zellen entscheidend an der Pathogenese der MS beteiligt sind. Man geht davon aus, daß eine Fehlregulation der T-Zell-Kontrolle, möglicherweise bedingt durch ein Ungleichgewicht an Apoptose-regulierenden Molekülen, dabei eine Rolle spielt. Tatsächlich zielen therapeutische Strategien darauf ab, T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Produktion von Zytokinen zu verringern, oder T-Zell-Eliminierung zu fördern. Diese Arbeit sollte zum einen die Bedeutung regulatorischer Faktoren klären, die für das überleben der T-Zellen von MS-Patienten verantwortlich sind. Zum anderen sollten die antiproliferative oder Apoptose-fördende Wirkung potentiell therapeutisch wirksamer Moleküle untersucht werden. Eine eingeschränkte Regulation der autoreaktiven T-Zellen durch Apoptose in der Peripherie und im ZNS trägt möglicherweise zur Pathophysiologie der MS bei. Als Schlüsselfaktoren der Regulation von Apoptose wurden Mitglieder der Bcl-2-Familie in MS-Patienten und Probanden untersucht. Diese Faktoren wurden in Relation zu der Suszeptibilität der T-Zellen gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (sog. Activation-induced cell death oder AICD) überprüft. Um die in-vivo-Elimination der Antigen-reaktiven T-Zellen nachzuahmen, wurde ein in-vitro-Modell des AICD mit repetitiver T-Zell-Stimulation verwendet. Tatsächlich zeigten polyklonale T-Zellen von MS-Patienten eine verringerte Suszeptibilität für AICD, nachgewiesen sowohl durch verminderte Caspaseaktivtät (p=0.013) als auch durch DNA-Fragmentierung (p=0.0071). Weiter wurden höhere Spiegel des Proteins Bcl-XL in den Immunzellen von MS-Patienten mit Immunoblotting gemessen (p=0.014). Eine inverse Korrelation zwischen der Expression an Bcl-XL und der Empfindlichkeit der T-Zellen gegenüber AICD steht in Übereinstimmung mit vorhergehenden Daten bezüglich der Bedeutung dieses Proteins für die Apoptose-Resistenz von T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, daß dieses Molekül die Ausprägung der experimentell-autoimmun Enzephalomyelitis, des Tiermodells der MS, verstärkt. Zusammen mit den erhöhten Bcl-XL-Werten bei MS-Patienten, ergeben sich nun Perspektiven für einen therapeutischen Ansatz. Abgesehen von dem Konzept die apoptotische Eliminierung von T-Zellen zu unterstützen, streben gegenwärtige therapeutische Strategien an, die Aktivierung und weitere Proliferation der schädlichen T-Zellen zu hemmen. Basierend auf klinischer Erfahrung mit eher unselektiven Therapien, ist es ein therapeutisches Ziel, neue immunomodulatorische Substanzen mit besserer Selektivität zu finden, um das Nutzen/Risiko-Verhältnis zu maximieren. Aus diesem Grund wurden zwei unterschiedliche Substanzen untersucht die beide den Zellzyklus beeinflussen. Als erster Kandidat wurde der kürzlich entdeckte Todesligand TRAIL (engl.: TNF-related apoptosis inducing ligand) aus der TNF/NGF-Familie untersucht, da diesem bereits T-Zell-regulatorische Funktionen zugeschrieben worden waren, humane Antigen-spezifische T-Zellen jedoch resistent gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose sind. Der zweite Kandidat mit potenziell therapeutischer Wirkung bei MS ist Atorvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der bereits als Lipidsenker bei Patienten eingesetzt wird. Um die Hypothese zu überprüfen, daß diese Substanzen T-Zell-Rezeptor-Signale beeinflussen können, wurden humane Antigen-spezifische T-Zell-Linien von MS-Patienten und gesunden Probanden eingesetzt. Diese wurden hinsichtlich T-Helfer-Phänotyp und Peptid-Spezifität charakterisiert. Eine Behandlung mit TRAIL führte zur Hemmung der Proliferation in unterschiedlichem Ausmaß (6.2% - 63.8%). Atorvastatin hemmte in Abhängigkeit von der Dosis ebenso die Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen. Beide Substanzen wirkten antiproliferativ unabhängig von der Antigenpräsentation, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proliferation in Abwesenheit von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen zu vermindern. Diese Eigenschaft weißt auf einen direkten Einfluß auf die T-Zell-Funktion hin. Die TRAIL-induzierte Hypoproliferation war assoziiert mit einer Herunterregulation der Zyklin-abhängigen Kinase CDK4 (engl.: cyclin dependent kinase 4), einem Schlüsselenzym für die nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation einsetzende Transition von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus. Inkubation mit Atorvastatin induzierte ebenso eine Verminderung von CDK4, begleitet von einer Erhöhung von p27Kip1. Die Atorvastatin-vermittelte Proliferations- und Zellzyklus-Blockade konnte durch Mevalonat rückgängig gemacht werden. Mevalonat ist ein Zwischenprodukt des HMG-CoA-Reduktaseweges. Atorvastatin scheint demnach einen direkten Einfluß auf diese Enzymkaskade zu haben, der wichtig für die Isoprenylierung von GTPase-Proteinen der Rho-Familie ist. T-Zell-Rezeptor-Stimulation führt zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern und nachfolgend zur Öffnung transmembranöser Kalzium-Kanäle (sog. calcium release-activated calcium oder CRAC-Kanäle), die eine für die T-Zellaktivierung notwendige und anhaltende Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration hervorruft. Nach Behandlung mit TRAIL wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition des Einstroms extrazellulärer Kalzium-Ionen durch die CRAC-Kanäle beobachtet. Dies wurde mit löslichem TRAIL-Rezeptor-Fusionsprotein, einem TRAIL-Antagonisten, rückgängig gemacht. Die Blockade von Kalzium-abhängigen Aktivierungssignalen stellt damit möglicherweise einen primären immunregulatorischen Mechanismus für diese Todesliganden dar. Jedoch wurde keine Auswirkung von Atorvastatin auf die T-Zellaktivierung beobachtet, da der Einstrom von extrazellulärem Kalzium nicht beeinflußt wurde. Während Studien zum TRAIL-vermittelten Einfluß auf die T-Zell-Aktivierung und dem Zellzyklus erst in der präklinischen Phase sind, werden Statine, die ebenfalls den Zellzyklus beeinflussen, bereits in der Therapie anderer Erkrankungen angewand. Darüber hinaus werden derzeit bereits klinische Studien mit Statinen zur MS-Therapie durchgeführt. Weitere Untersuchungen zu den detaillierten Mechanismen antiproliferativer Substanzen mit potenziellem therapeutischen Effekt in der MS ermöglichen die Entwicklung von selektiveren immunomodulatorischen Therapien mit höherem therapeutischen Nutzen für MS-Patienten. / Multiple sclerosis (MS) is a heterogeneous disease of the central nervous system whose pathological mechanisms are far from completely understood. The current hypothesis is that pro-inflammatory T cells are orchestrating the pathogenesis of this condition. It is considered that a dysregulation in T cell control to be involved, with an imbalance in apoptosis-regulating molecules possibly playing a role. In fact, therapeutic strategies aim to reduce T cell activation, proliferation and cytokine production or to promote T cell elimination. The focus of this thesis was to identify the role of regulatory molecules for T cell survival in the immune pathogenesis of MS, and to investigate antiproliferative or apoptosis-promoting effects on T cells by potential therapeutic molecules. A limitation in the apoptotic regulation of autoreactive T cells in the periphery and in the CNS may contribute to the pathophysiology of MS. As key regulators of apoptosis, members of the Bcl-2 family were investigated in both MS patients and controls. These factors were examined in relation to the susceptibility of T cells, from both groups, towards activation-induced cell death (AICD). To mimic the in vivo elimination of antigen-reactive T cells, an in vitro model of AICD involving repetitive T cell receptor mediated stimulation was utilized. In fact, polyclonal T cells from MS patients showed a decreased susceptibility to undergo AICD as shown by both caspase activity (p=0.013) and DNA fragmentation (p=0.0071) assays. Furthermore, Bcl-XL protein levels, as measured by immunoblotting, were increased in the peripheral immune cells of MS patients (p=0.014). An inverse correlation observed between Bcl-XL levels and susceptibility of T cells to undergo AICD is in line with previous data on the significance of this anti-apoptotic protein in T cell resistance. Since this molecule has already been shown to aggravate the outcome of experimental autoimmune encephalitis, the animal model for MS, the observation of elevated Bcl-XL levels in patients offers perspectives towards therapeutic manipulation in MS. Apart from promoting apoptotic elimination, current therapeutic strategies aim at inhibiting activation and further proliferation of potentially harmful T cells. Based on clinical experience with rather non-selective therapies that promote T cell elimination, a therapeutic goal is to identify newer immunomodulatory substances with better selectivity in order to maximize the therapy's benefit to risk ratio. Thus, two different substances, both interfering with cell cycle regulation, were investigated. The first candidate was the recently discovered member of the TNF/NGF family of death ligands, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) since it has been reported to have immunoregulatory functions and since human antigen-specific T cells were shown to be resistant towards apoptosis induction by this ligand. The second candidate drug with potential in MS therapy is atorvastatin, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme (HMG-CoA) reductase inhibitor and lipid-lowering drug, already indicated for anomalies in lipid metabolism. In order to prove the hypothesis that these substances interfere with T cell receptor signaling, human antigen-specific T cell lines from both MS patients and controls, characterized with regards to T helper differentiation and peptide specificity, were employed. Exogenous treatment of TRAIL resulted in an inhibition in proliferation, albeit to varying degrees (6.2% - 63.8% inhibition). Atorvastatin also inhibited proliferation of antigen-specific T cell lines in a dose-dependent manner. Both compounds induced hypoproliferation independently of antigen presentation, as shown by their ability to block T cell proliferation in response to direct T cell receptor engagement, thus indicating a direct influence on T cell function. The growth inhibition by TRAIL was associated with a downregulation of the cell cycle regulator CDK4, indicative of an inhibition of cell cycle progression at the G1/S transition. Incubating T cells with atorvastatin also induced a downregulation of CDK4 expression, which was accompanied by an upregulation of p27Kip1 expression. The atorvastatin-mediated inhibition in proliferation and cell cycle progression could be reversed by mevalonate, an intermediate product of the HMG-CoA reductase pathway, suggesting a direct involvement of atorvastatin in this pathway, necessary for the isoprenylation of small GTPase proteins of the Rho family. Utilizing a thapsigargin model of calcium influx to activate the same calcium-release activated calcium (CRAC) channels as T cell receptor-stimulation by antigen, an inhibition in calcium influx could be observed on pre-incubating T cells with TRAIL. Co-incubating with human recombinant TRAIL receptor 2 fusion protein, a competitive antagonist for TRAIL, reversed this inhibition. A direct influence on calcium influx is indicative of an influence of TRAIL on the activation status of human T cells. Therefore, TRAIL directly inhibits activation of these cells via blockade of calcium influx. However, no impact of atorvastatin on early T cell activation was observed, since calcium influx was unaffected. While TRAIL-mediated interference with T cell activation and further cell cycle progression is still in the pre-clinical phase, statins, which have also been shown here to interfere with the T cell cycle, are already employed in the clinic for other ailments. In fact, clinical trials are currently being undertaken with this group of drugs for MS. Further studies on detailed mechanisms of antiproliferative substances effective in MS will allow the development of highly selective immunomodulatory agents with increased beneficial profile as MS therapy.

The trigeminal ganglion (TG) is a complex sensory structure and multiple lines of evidence suggest that significant differences exist in anatomical, neurochemical and physiological properties between it and its equivalent structure in the somatosensory system, the dorsal root ganglion (DRG). This is likely to be a reflection, first on the unique areas of tissue innervation of the TG and second, on the unusual responses to injury which give rise to distinct pain symptoms such as toothache, migraine and temporomandibular joint disorders. In an attempt to address this disparity in knowledge, we have carried out an in-depth in vivo study investigating neurochemical populations and cell size distributions of sensory neurons within the rat TG. We have performed a detailed analysis of expression patterns for receptor components of important inflammatory mediators, NGF (TrkA), TNFα (p55) and IL-6 (gp130), along with the thermo-transducers TRPV1 and TRPM8. For each analysis we have compared our findings with those of the rat DRG. We have shown a significantly larger population of NF200+ neurons within the TG (51%) compared to the DRG (40%), and most interestingly, the majority of NF200+ neurons in the TG were within the small to medium cell size range, conferring a nociceptive phenotype. We have for the first time, determined expression of p55 and gp130 protein levels within neurochemically defined subpopulations of the TG. We show that a large proportion (33%) of TG neurons, in particular 27% of NF200+ neurons co-express p55, and thereby have the potential to respond directly to TNFα. Furthermore, we have observed gp130 protein expression to be ubiquitous within the TG, suggesting all neurons, including non-nociceptors, could respond to IL-6. In addition, we have utilised biochemical and electrophysiological techniques in vitro to measure the functional outcome of exposure of TG neurons to IL-6. We have demonstrated that IL-6 activates the JAK/STAT signalling pathway, preferentially within NF200+ neurons. Furthermore, we have shown that IL-6 sensitises the response of TG neurons to the TRPV1 agonist capsaicin, altering the gating properties and prolonging the opening time of the channel. Taken together, our findings support the emerging picture of a complex combinatorial pattern of co-expression of sensory neurochemicals, transducers and receptor components that help to define TG neuronal modality and function. We would advocate caution in making generalisations across sensory ganglia in particular in extrapolating data from the DRG to the trigeminal ganglion.

Fragestellung: Es wird untersucht, ob die isolierte hypertherme Extremitätenperfusion (ILP) mit TNF-alpha und Melphalan eine akute systemische inflammatorische Reaktion (SIRS) auslöst. Weiterhin soll der Einfluß von zwei verschiedenen total intravenösen Narkoseverfahren sowie der Zusammenhang der unabhängig voneinander bestimmten Meßgrößen Herzindex/Sauerstoffverbrauchsindex (HI/VO2I) und Sauerstoffverbrauchsindex/Sauerstoffangebotsindex (VO2I/DO2I) beim Entstehen eines SIRS analysiert werden. Methodik: 73 Patienten, die sich einer ILP mit TNF-alpha und Melphalan in Allgemeinanästhesie unterzogen, wurden in diese klinische, retrospektive Untersuchung eingeschlossen. Ein erweitertes kardiopulmonales Monitoring, bestehend aus kontinuierlicher Thermodilution, kontinuierlicher indirekter Kalorimetrie, invasiver Blutdruckmessung sowie arterieller und gemischtvenöser Blutgasanalysen ermöglichte die Analyse von hämodynamischen, metabolischen und gasanalytischen Parametern an 8 definierten Zeitpunkten im Verlauf der ILP mit TNF-alpha und Melphalan. 21 Patienten erhielten eine Narkose mit Etomidate/Midazolam/Sufentanil/Pancuroniumbromid (N1), und bei 52 Patienten wurde die Narkose mit Propofol/Remifentanil/Cis-Atracurium (N2) durchgeführt. Ergebnisse: Während der ILP mit TNF-alpha und Melphalan kam es bei folgenden Parametern zu signifikanten Veränderungen in der systemischen Reperfusionsphase gegenüber den Ausgangswerten vor der extrakorporalen Zirkulation: Herzfrequenz, Herzindex, Temperatur, Gesamtsauerstoffaufnahme, pulmonale Sauerstoffaufnahme, Sauerstoffangebot, systemischer Gefäßwiderstand, pulmonalarterieller Mitteldruck, kardiale Füllungsdrücke, gemischtvenöser Kohlendioxid- und Sauerstoffpartialdruck, arterieller Kohlendioxid- und Sauerstoffpartialdruck, gemischtvenöse Sauerstoffsättigung, arterieller und gemischtvenöser Sauerstoffgehalt sowie arterieller pH- und Laktatwert. Bezüglich der Narkoseverfahren zeigte die Narkose N2 versus N1 signifikant geringere Herzfrequenzen und Herzindices, sowie signifikant erhöhte pulmonalarterielle Mitteldrücke, pulmonale und systemische Gefäßwiderstände. Die Korrelationen von HI/VO2I und VO2I/DO2I sind in der prä-Bypass-Phase gering, nehmen im Verlauf der ILP zu und erreichen zum Zeitpunkt der systemischen Reperfusion jeweils ihren Maximalwert. Schlußfolgerungen: Die ILP mit TNF-alpha und Melphalan kann als dynamisches in-vivo Modell für das Entstehen einer SIRS-Reaktion aufgefaßt werden. Die inflammatorische Antwort ist in ihrem Ausmaß eher gering und erreicht nach Aufhebung der extrakorporalen Zirkulation mit systemischer Reperfusion der behandelten Extremität ihr Maximum. Die Überwachung der Teilkreisläufe, ein erweitertes hämodynamisches Monitoring sowie forcierte intravenöse Volumentherapie in der Reperfusionsphase lassen dieses Behandlungsverfahren für die Patienten in Allgemeinanästhesie sicher erscheinen. Beide beschriebenen Narkoseverfahren sind für diese operative Therapie geeignet. Der Zusammenhang von HI/VO2I sowie VO2I/DO2I ist im Verlauf der ILP gering, kann sich aber mit Zunahme der inflammatorischen Reaktion verstärken. / objective: To determine whether the isolated hyperthermic limb perfusion (ILP) with tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and melphalan causes an acute systemic inflammatory response syndrome (SIRS)? Also analysed will be the influence of two total intravenous anaesthesias and the correlation of independent measured values cardiac index/oxygen consumption index (HI/VO2I) and oxygen consumption index/oxygen delivery index (VO2I/DO2I). design: Retrospective review of hemodynamic, metabolic and blood gas values from 73 patients, undervented isolated hyperthermic limb perfusion of leg with TNF-alpha and Melphalan in general anaesthesia. methods: Cardiopulmonary monitoring consisted of continuous thermodilution, continuous calorimetry, arterial pressure and arterial as well as admixed blood-gas analyses. Values were measured on 8 time points in the course of ILP. In 21 patients anaesthesia was carried out with drug-combination of Etomidate/Midazolam/Sufentanil/Pancuroniumbromid (N1), and 52 patients were given anaesthesia with Propofol/Remifentanil/Cis-atracurium (N2). results: The following values changed significantly after limb-reperfusion compared with the baseline: heart rate, cardiac index, temperature, oxygen consumption, pulmonary oxygen consumption, oxygen delivery, systemic vascular resistance, mean pulmonary arterial pressure, precardial pressures, admixed carbon dioxide pressure, admixed oxygen pressure, arterial carbon dioxide pressure, arterial oxygen pressure, admixed oxygen saturation, arterial and admixed oxygen content as well as arterial pH- and lactat. conclusions: The isolated hyperthermic limb perfusion with TNF-alpha and melphalan may be used as a dynamic in-vivo model for the development of an SIRS. The inflammatory response is slight and reached the maximum after reperfusion of treated limb. Monitoring of the two circulations, extended cardiopulmonary monitoring and intravenous volumetherapie in the reperfusion time makes this cancer treatment in general anaesthesia safe. Both anaesthesia are suitable. The correlations of HI/VO2I as well as VO2I/DO2I are low in the beginning and rise with the increase of the inflammatory response.

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Doctor of Philosophy (PhD) / Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways. Corticosteroid medication is the most effective currently available treatment. Complications of corticosteroid therapy are dose-dependent, however, the clinical efficacy of varying doses of inhaled corticosteroids has been studied with mixed results. A randomized, double-blind, parallel group study was used to evaluate the inhaled corticosteroid dose-response relationship for clinical endpoints and in vitro parameters of underlying airway inflammation and remodelling. The mannitol provocation test with Forced Oscillation Technique (FOT) was used to derive potential dose-differentiating endpoints. In vitro inflammatory markers were measured in alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage. Basement membrane thickness was measured from bronchial biopsies. Eleven nonasthmatic subjects were enrolled for comparison. This thesis addresses the null hypothesis that there is no significant difference in clinical and biological effects between low dose (200mcg/day, n=11) and high dose (1000mcg/day, n=11) treatment (for 6-7 weeks) with inhaled fluticasone propionate (FP) for a range of clinical outcomes and in vitro markers of airway inflammation and remodelling. Significant changes after FP included increased FEV1, reduced airway hyperresponsiveness (AHR) (by FOT and FEV1), exhaled nitric oxide and Juniper symptom score. In addition, significant reductions occurred in expression of GM-CSF, TNF-alpha and IL-1ra in macrophages. A lower baseline FOT-derived respiratory system conductance was predictive of a greater degree of improvement in symptoms. No statistically significant differences in the changes after treatment between low and high dose FP were found in spirometry, exhaled nitric oxide, symptom scores, AHR, alveolar macrophage cytokine levels (GM-CSF, TNF-alpha, IL-1ra, IL-10) and basement membrane thickness, although there were trends towards greater improvements in many of the parameters after high dose FP. Basement membrane thickness appeared to be reduced by high dose FP, although this reduction was not statistically significant. There was a weak, but statistically significant, negative correlation between basement membrane thickness and FOT-derived conductance (r2=0.135, p=0.042). With the recognition of the limitations in the interpretation of these data, the results suggest that, in previously steroid naïve mild to moderate asthmatics, there may be only minimal benefit derived from an additional 800µg/day of inhaled fluticasone above the low dose of 200µg/day.

Abstract Glucocorticoids are the most important and widely used treatment modality in dermatology. A large variety of topical as well as systemic preparations is available. Most patients treated with glucocorticoids respond quickly to the treatment, but some are considered insensitive or even resistant to glucocorticoid therapy. Currently, there is no known measurable variable, through which the response can be predicted. Glucocorticoids mediate their actions through glucocorticoid receptors (GR). Several isoforms of GR exist, but the α (GRα) and β (GRβ) isoforms are clinically the most important. Based on previous studies, it has been proposed that the abundance of GR isoforms or the GRβ: GRα –ratio could affect individual responsiveness to corticosteroid treatment. In particular, up-regulation of GRβ expression has been shown to be linked to resistance to corticosteroid treatment. This thesis comprises three sub-studies. Firstly, we wanted to determine whether GRα and GRβ are expressed in inflammatory skin diseases. Secondly, we examined if the expression is altered by corticosteroid treatment in eczema atopicum, bullous pemphigoid and psoriasis. Finally, we measured the effects of a topical vitamin D3 analogue (calcipotriol) combined with betamethasone compared with betamethasone monotherapy on inflammatory biomarkers of psoriasis. Our studies provide detailed novel data about the expression of GRα and GRβ. GRα and GRβ were shown to be expressed in the blood lymphocytes and lesional skin of patients with eczema atopicum, bullous pemphigoid and psoriasis, as well as in the skin of patients with eczema nummulare, lichen simplex chronicus and lichen ruber planus. Systemic corticosteroid treatment was shown to affect the expression of GRα and GRβ in eczema atopicum and bullous pemphigoid, but the inconsistent variation in their expression between patients prevented us from drawing firm conclusions. Neither GRα nor GRβ as a single marker were found to be a suitable predictor of corticosteroid responsiveness. Clinical and laboratory analyses showed that topical treatment of psoriasis with calcipotriol/betamethasone combination ointment is more beneficial measured by both than betamethasone monotherapy. / Tiivistelmä Glukokortikoideja (”kortisoni”) käytetään tulehduksellisten ihotautien hoidossa paikallisesti tai systeemisenä lääkkeenä. Suurin osa potilaista reagoi hoitoon nopeasti, mutta osalla hoitovaste on heikompi tai ilmenee hitaasti. Tällä hetkellä ei tunneta keinoja ennustaa luotettavasti kortisonihoidon vastetta. Glukokortikoidit vaikuttavat elimistössä glukokortikoidireseptorien (GR) kautta. Glukokortikoidireseptorista tunnetaan useita alatyyppejä, joista tärkeimmät ovat α (GRα) ja β (GRβ). Aiemman tiedon pohjalta on pidetty mahdollisena, että GR-alatyyppien suhteella tai määrällä on merkitystä kortisonivasteen syntymisessä. Erityisesti on arveltu, että ylimäärä GRβ:aa voisi estää kortisonihoidon vaikutusta. Tässä väitöskirjassa tavoitteena on ollut selvittää, tapahtuuko GR-alatyyppien ilmenemisessä muutoksia tulehduksellisia ihosairauksia sairastavilla potilailla sekä tutkia, miten kortisonihoito vaikuttaa GR-tasoihin atooppista ihottumaa, pemfigoidia ja psoriaasia sairastavilla potilailla. Lisäksi olemme verranneet paikallishoitoa pelkällä kortisonivoiteella D-vitamiinijohdos kalsipotriolin ja kortisonin yhdistelmähoitoon psoriaatikoilla. Tutkimus on antanut uutta yksityiskohtaista tietoa GRα:n ja GRβ:n esiintymisestä ihossa ja tulehdussoluissa ihosairauksia sairastavilla potilailla. Tutkimustulosten perusteella voidaan todeta, että GRα ja GRβ esiintyvät atooppista ihottumaa, pemfigoidia ja psoriaasia sairastavien potilaiden ihossa ja veren tulehdussoluissa sekä nummulaari-ihottumaa, neurodermatiittia ja punajäkälää sairastavien potilaiden ihossa. Suun kautta annettu kortisonihoito vaikuttaa GRα- ja GRβ–lähetti-RNA:n ilmenemiseen, mutta potilaskohtaiset erot ovat suuret, eikä kumpikaan, GRα tai GRβ, sovellu yksinään ennustamaan kortisonihoidon vastetta. Paikallisella kortisonihoidolla D-vitamiinijohdos kalsipotrioliin yhdistettynä on suotuisampi vaikutus psoriaasin tulehduksellisiin välittäjäaineisiin ja tulehdussoluihin kuin pelkällä paikallisella kortisonihoidolla.

Cardiovascular diseases are a broad group of diseases, such as heart attack and heart failureaffecting the cardiovascular system. The primary cause of cardiovascular diseases isatherosclerosis, and its progression is brought about by oxidative stress and a complex chronicinflammation reaction cascade. Of central importance are proinflammatory cytokines, regulatedby multiple factors, including interleukin (IL) 17A. This project aims to investigate the effectof IL-17A on the inflammatory response of human vascular endothelial cells by quantifyingchemokine C-X-C motif ligand-1 (CXCL1) release when exposed or not to otherproinflammatory mediators such as TNF-𝛼, IL-6 and IL-1β. To investigate this, humanumbilical cord endothelial cells were cultured and then stimulated with IL-17A alone or incombination with other cytokines, namely IL-6/sIL6R, IL-1β, or TNF-𝛼. After an appropriateincubation time following the stimulations, the supernatants of the cells were collected, and theamount of CXCL1 was analysed with ELISA or qPCR, respectively. At a lower concentration(10ng/ml), IL-17A failed to induce a significant level of CXCL1 release from endothelial cells.However, IL-17A + TNF-𝛼 (5ng/ml) greatly enhanced, higher than inductions from individualtreatments combined, level of CXCL1 release from endothelial cells. Furthermore, combiningIL-17A with IL-1β or IL-6 induced non-abundant and abundant upregulation in CXCL1 release,respectively. On transcription level, the amount of CXCL1 mRNA induced by IL-17A alonewas non-significant, but stimulation with TNF-𝛼 and IL-17A + TNF-𝛼 induced significantlyupregulated expression of CXCL1. In conclusion, we found that IL-17A induced synergeticrelease of CXCL1 in human vascular endothelial cells with TNF-𝛼. In addition, the synergisticimpact of IL-17A and TNF-𝛼 in terms of CXCL1 induction in vascular endothelial cells wasevident on a transcriptional level. Our data imply that combined blockage of IL-17A and TNF-𝛼 could have an enhanced therapeutic effect on vascular inflammation.

Apoptosis-induced proliferation (AiP) is a compensatory mechanism to maintain tissue size and morphology following unexpected cell loss during normal development, and may also be a contributing factor to cancer growth and drug resistance. In apoptotic cells, caspase-initiated signaling cascades lead to the downstream production of mitogenic factors and the proliferation of neighboring surviving cells. In epithelial Drosophila tissues, the Caspase-9 homolog Dronc drives AiP via activation of Jun N-terminal kinase (JNK); however, the specific mechanisms of JNK activation remain unknown. Using a model of sustained AiP that produces a hyperplastic phenotype in Drosophila eye and head tissue, I have found that caspase-induced activation of JNK during AiP depends on extracellular reactive oxygen species (ROS) generated by the NADPH oxidase Duox. I found these ROS are produced early in the death-regeneration process by undifferentiated epithelial cells that have initiated the apoptotic cascade. I also found that reduction of these ROS by mis-expression of extracellular catalases was sufficient to reduce the frequency of overgrowth associated with our model of AiP. I further observed that extracellular ROS attract and activate Drosophila macrophages (hemocytes), which may in turn trigger JNK activity in epithelial cells by signaling through the TNF receptor Grindelwald. We propose that signaling back and forth between epithelial cells and hemocytes by extracellular ROS and Grindelwald drives compensatory proliferation within the epithelium, and that in cases of persistent signaling, such as in our sustained model of AiP, hemocytes play a tumor promoting role, driving overgrowth.

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