Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-10-26Bitstream added on 2014-06-13T21:05:13Z : No. of bitstreams: 1 wellbaum_c_dr_rcla.pdf: 1434990 bytes, checksum: 675e636851cc599591f7297d59472801 (MD5) / Na área de cerrado, município de Corumbatai, SP, foram isoladas 267 linhagens de fungos filamentosos em amostras de solo, coletadas no inverno (2002) e no verão (2003), pelos métodos da Técnica da placa-de-solo e Técnica da diluição em série. Destas, 12 linhagens foram consideradas potenciais produtoras de ácidos Á-linolenico (AGL) e araquidônico (AA) por pertencerem a ordem Mucorales. Foram realizados ensaios preliminares para avaliar a eficiência de diversos protocolos de extração de ácidos graxos dos fungos. Foram testadas modificações de metodologias tradicionais, adicionando uma ou duas vezes a solução extratora de metanol-cloroformio-água (2,0:1,0:0,8 v/v) a biomassa úmida, congelada, liofilizada, seca e/ou macerada. De acordo com os resultados obtidos, optou-se por utilizar a biomassa liofilizada, tratada duas vezes com a solução extratora. Os extratos resultantes foram transesterificados e analisados por cromatografia gasosa. Algumas linhagens foram cultivadas em erlenmeyeres de 125mL e 250mL, contendo respectivamente 50mL e 100mL de meio de cultura líquido de extrato de malte a 2%, durante 6 dias sob agitação, a 25C. Foi observado que a linhagem MX produziu maior quantidade de AGL, apresentando médias de 61,9mg.L-1e 55,7mgEL-1, respectivamente, em frascos de 250mL e 125mL. Maior produção de AA foi verificada na linhagem M132, cuja média foi de 0,3mgEL-1. As linhagens MX, M131 e M132 foram também cultivadas em frascos de 125mL contendo 50mL de meio líquido de extrato-de-malte suplementado com óleo de girassol a 2% e 1% de extrato de levedura. Nestes, as maiores quantidades médias de AGL, 201,62mgEL-1, e de AA, 3,12mgEL-1, foram observadas no cultivo da linhagem M131, sendo estes valores 1.311,15% e 1011,37% maiores em relação aqueles verificados em meio de extrato de malte. / In the savannah area, municipal district of Corumbatai, state of Sao Paulo, 267 fungi strains were isolated in soil samples collected, in the winter (2002) and in the summer (2003), with the gsoil plate methodh and serial dilution method. Twelve strains were considered potential producers of Á-linolenic acid (GLA) and arachidonic acid (AA) for belonging to the order Mucorales. Preliminary experiments were accomplished to evaluate the efficiency of several protocols of extraction of fatty acids from fungi. Modifications of traditional methodologies were tested, adding one or twice the solvent solution of methanol-chloroform-water (2.0:1.0:0.8 v/v) to the wet, frozen, freeze-dried, dried and/or disrupted biomass. In agreement with the obtained results, the biomass was freeze-dried and treated twice with the solvent solution. The resulting extracts were transesterified and analized by gas cromatography Some strains were cultivated in shake flasks of 125mL and 250mL, containing respectively 50mL and 100mL of liquid malt extract culture media (2%), for 6 days under agitation, at 25C. It was observed that the strain MX produced larger amounts of GLA, mean of 61.9mgEL-1 and 55.7mgEL-1, respectively, in shake flasks of 250mL and 125mL. Higher production of AA was verified in the strain M132, mean of 0.3mgEL-1. The srains MX, M131 and M132 were also cultivated in shake flasks of 125mL containing 50mL of liquid malt extract media enhanced with sunflower oil (2%) and yeast extract (1%). In these the largest amounts of GLA, mean of 201.62mgEL-1, and of AA, mean of 3.12mgEL-1, were observed in the cultivation of the strain M131, these values being 1,311.15% and 1,011.37% larger in relation to those verified in same strain cultivated in malt extract media. The three strains were grown in Bioreactor with capacity of 2L containing 1L of malt extract media (2%) added or not with sunflower oil (2%).

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

Prostaglandina Endoperóxido Sintases (PGHSs) são enzimas homodiméricas integrais de membrana, N-glicosiladas, localizadas no lúmen do retículo endoplasmático, onde catalisam o primeiro passo na síntese de prostanóides, produzindo prostaglandina H2 a partir do ácido araquidônico (AA). Constituem-se, assim, em um dos principais alvos terapêuticos no tratamento de doenças inflamatórias. PGHSs apresentam duas isoformas: PGHS-1, expressa constitutivamente em diversos tipos celulares, e PGHS-2, usualmente expressa por indução. Ambas isoformas são glicosiladas nos resíduos Asn68, Asn144 e Asn410, modificações necessárias para a atividade e função adequadas destas enzimas. A reação ciclooxigenase necessita que o AA esteja numa orientação catalítica. Adicionalmente a esta orientação, o banco de dados Protein Data Bank contém estruturas cristalográficas que apresentam uma orientação alternativa para o AA, proposta como não-catalítica. Considerando a importância da glicosilação para a função da enzima, o presente trabalho tem como objetivo a caracterização estrutural e conformacional de PGHSs em suas formas glicosiladas, bem como analisar as diferentes orientações adotadas pelo AA em dados cristalográficos prévios. Assim, modelos de PGHS-1 e PGHS-2 glicosiladas foram construídos combinando diferentes fontes de dados experimentais (bioquímicos, cristalográficos e espectrométricos) e foram submetidos a simulações de dinâmica molecular (DM) usando o pacote de simulação do GROMACS e campo de força GROMOS9643a1. Parâmetros desenvolvidos pelo grupo foram empregados para descrever a porção sacarídica dos sistemas. Os dados obtidos indicam uma diminuição na flexibilidade da proteína na presença de glicosilação no domínio EGF em ambas as isoformas. Além disso, PGHS-1 e PGHS-2 ligadas às duas diferentes orientações do AA foram submetidas a estudos de DM, indicando que a orientação alternativa não é estável, possivelmente sendo uma conformação minoritária em solução. Tal orientação alternativa, contudo, pode sugerir novas abordagens para o planejamento de novos agentes anti-inflamatórios baseado na complementaridade à enzima-alvo. / Prostaglandin Endoperoxide Synthases (PGHSs) are homodimeric integral membrane enzymes, N-glycosylated, located in the endoplasmic reticulum lumen, where they catalyze the first step in the prostanoids synthesis, generating prostaglandin H2 from arachidonic acid (AA), so constituting one of the main therapeutic targets for treating inflammatory diseases. PGHSs present two isoforms: PGHS-1, constitutively expressed in several cell types, and PGHS-2, usually expressed by induction. Both isoforms are glycosylated at residues Asn68, Asn144 and Asn410, modifications necessary for adequate PGHSs enzymatic activities and function. The cyclooxygenase reaction requires AA to be in a catalytic orientation. Additionally to this orientation, the Protein Data Bank contains crystallographic structures presenting an alternative orientation for AA, proposed as non-catalytic. Considering the importance of glycosylation for the enzyme`s function, the current work intents to structurally and conformationally characterize the role of the sacharidic moiety of PGHSs, as well as to analyze the different orientations adopted by AA found in previous crystallographic data. Thus, glycosylated models for PGHS-1 and PGHS-2 were built combining different sources of experimental data (biochemical, crystallographic and spectrometric) and submitted to molecular dynamics (MD) using the GROMACS simulation suite and GROMOS9643a1 force field. Parameters developed by the group were employed in order to describe the carbohydrate moiety. The obtained data indicate a decrease in protein flexibility in the presence of glycosylation on the EGF domain of both isoforms. Also, PGHS-1 and PGHS-2 bound to the two different orientations of AA were submitted to MD studies indicating that the alternative orientation is not stable, possibly being a minority orientation in solution. This orientation, however, may suggest new approaches for structure-based design of new anti-inflammatory agents.

Os esteroides ovarianos modulam a expressão de importantes moléculas no endométrio de fêmeas bovinas, incluindo os eicosanoides. Os eicosanoides sintetizados pelo endométrio controlam uma gama de eventos reprodutivos. A hipótese do presente estudo é que a síntese de eicosanoides pelo endométrio no sétimo dia pós-estro é regulada pelo ambiente endócrino periovulatório. Objetivou-se mensurar a expressão gênica de 23 proteínas envolvidas na síntese, transporte e sinalização de eicosanoides e quantificar uma série de eicosanoides no útero de vacas de corte com diferentes perfis hormonais peri-ovulatórios no início do diestro. O crescimento folicular foi farmacologicamente manipulado para que resultassem grupos apresentando folículo pré-ovulatório e corpo lúteo grande (F/CLG; n=11) ou pequeno (F/CLP; n=11). Vacas Nelores multíparas, não lactantes, pré-sincronizadas, receberam (F/CLG) ou não (F/CLP) uma dose de PGF2&#945; e um dispositivo de progesterona, juntamente com benzoato de estradiol. A remoção dos dispositivos de liberação de progesterona e aplicação de PGF2&#945; foi realizada 60 a 42 horas antes da indução da ovulação no grupo F/CLG e entre 48 a 30 horas no grupo F/CLP. A ovulação foi induzida (GnRH; 10g) no D0. Amostras de sangue foram obtidas entre os dias D-2 a D0 e D0 a D7 para mensuração das concentrações de estradiol os dias progesterona, respectivamente. No dia 7, tecidos e lavados uterinos foram coletados. Em comparação ao grupo F/CLG, os animais do grupo F/CLP apresentaram folículos pré-ovulatórios e CL menores que resultaram em menores concentrações de estradiol e progesterona, respectivamente (P<0,5). A quantificação dos transcritos foi feita por qPCR. A abundância dos genes PTGES, AKR1C3, AKR1C4, CBR1, PTGIS e ALOX12, foi maior para os animais do grupo F/GLG, e PLA2G10 foi menor no mesmo grupo quando comparado com o grupo F/CLP (P<0,10). A concentração de metabólitos foi mensurada no tecido endometrial (pg/g) e lavado uterino (ng/mL) por espectrometria de massas. Maiores concentrações do metabolito 9-HETE foram encontradas no tecido endometrial do grupo F/CLP (P<0,05). Comparações entre médias foram determinadas pelo teste t de Student. Conclui-se que diferentes concentrações de estradiol (proestro) e progesterona (início do diestro) foram capazes de modular a expressão de genes relativos à síntese de eicosanoides, sem influenciar as concentrações dos eicosanoides no endométrio e lavado uterino de fêmeas bovinas no sétimo dia do ciclo. / Ovarian steroids modulate the expression of important molecules on bovine endometrium, including eicosanoids. The eicosanoids synthetized by the endometrium control many reproductive processes. The hypothesis of this study is that the eicosanoids synthesis by the endometrium on day seven after the estrous is regulated by the periovulatory endocrine milieu. The aims of this study were (1) to measure the expression of 23 genes that encode proteins involved in eicosanoids synthesis, transport and signaling and (2) to quantify eicosanoids on beef cows uterus exposed to different periovulatory hormonal profiles. Follicular growth was pharmacologically manipulated to generate two groups presenting large or small preovulatory follicle and corpus luteum (LF/CL and SF/CL respectively; n=11/group). Cyclic, non-lactating Nelore cows received two injections of cloprostenol (PGF2&alpha; 0.5mg; i.m.) 14 days apart. Ten days later (D-10), cows received a P4-releasing device along with estradiol benzoate (2mg; i.m.). To modulate the growth of the preovulatory follicles, on D-10, animals received PGF2&alpha; (LF/CL) or not (SF/CL). The P4-releasing devices were removed and PGF2&alpha; injected 60 to 42 hours before the ovulation induction in the LF/CL group and 48 to 30 hours before the ovulation induction in the SF/CL group. Ovulation was induced with buserelin (GnRH; 10&#181;g; i.m.) on D0. Plasma was obtained for measurement of estradiol concentrations from D-2 to D0 and from D0 to D7 for progesterone measurements. On D7, the animals that ovulated in response to GnRH were slaughtered and uterus flushing and endometrium were collected. Differences between group means were determined by students t test. Animals from LF/CL group presented larger preovulatory follicles, corpus luteum, estradiol and progesterone levels when compared to animals from SF/CL group (P<0.1). The quantification of the transcripts was performed by qPCR. PTGES, AKR1C3, AKR1C4, CBR1, PTGIS and ALOX12 were more abundant and PLA2G10 was less expressed in the endometrium from animals from LF/CL when compared to SF/CL (P<0.10). Metabolites concentration was measured by mass spectrometry in endometrial tissue (pg/g) and uterine flushings (ng/mL). The metabolite 9-HETE was more abundant on uterine flushings from animals with SF/CL (P<0.05). Different concentrations of estradiol (proestrous) and progesterone (beginning of diestrous) modulated the expression of genes related to eicosanoids synthesis, but it did not affect eicosanoids levels in the endometrium and uterine flushing in beef cattle on day 7 of the estrous cycle.

Os esteroides ovarianos modulam a expressão de importantes moléculas no endométrio de fêmeas bovinas, incluindo os eicosanoides. Os eicosanoides sintetizados pelo endométrio controlam uma gama de eventos reprodutivos. A hipótese do presente estudo é que a síntese de eicosanoides pelo endométrio no sétimo dia pós-estro é regulada pelo ambiente endócrino periovulatório. Objetivou-se mensurar a expressão gênica de 23 proteínas envolvidas na síntese, transporte e sinalização de eicosanoides e quantificar uma série de eicosanoides no útero de vacas de corte com diferentes perfis hormonais peri-ovulatórios no início do diestro. O crescimento folicular foi farmacologicamente manipulado para que resultassem grupos apresentando folículo pré-ovulatório e corpo lúteo grande (F/CLG; n=11) ou pequeno (F/CLP; n=11). Vacas Nelores multíparas, não lactantes, pré-sincronizadas, receberam (F/CLG) ou não (F/CLP) uma dose de PGF2&#945; e um dispositivo de progesterona, juntamente com benzoato de estradiol. A remoção dos dispositivos de liberação de progesterona e aplicação de PGF2&#945; foi realizada 60 a 42 horas antes da indução da ovulação no grupo F/CLG e entre 48 a 30 horas no grupo F/CLP. A ovulação foi induzida (GnRH; 10g) no D0. Amostras de sangue foram obtidas entre os dias D-2 a D0 e D0 a D7 para mensuração das concentrações de estradiol os dias progesterona, respectivamente. No dia 7, tecidos e lavados uterinos foram coletados. Em comparação ao grupo F/CLG, os animais do grupo F/CLP apresentaram folículos pré-ovulatórios e CL menores que resultaram em menores concentrações de estradiol e progesterona, respectivamente (P<0,5). A quantificação dos transcritos foi feita por qPCR. A abundância dos genes PTGES, AKR1C3, AKR1C4, CBR1, PTGIS e ALOX12, foi maior para os animais do grupo F/GLG, e PLA2G10 foi menor no mesmo grupo quando comparado com o grupo F/CLP (P<0,10). A concentração de metabólitos foi mensurada no tecido endometrial (pg/g) e lavado uterino (ng/mL) por espectrometria de massas. Maiores concentrações do metabolito 9-HETE foram encontradas no tecido endometrial do grupo F/CLP (P<0,05). Comparações entre médias foram determinadas pelo teste t de Student. Conclui-se que diferentes concentrações de estradiol (proestro) e progesterona (início do diestro) foram capazes de modular a expressão de genes relativos à síntese de eicosanoides, sem influenciar as concentrações dos eicosanoides no endométrio e lavado uterino de fêmeas bovinas no sétimo dia do ciclo. / Ovarian steroids modulate the expression of important molecules on bovine endometrium, including eicosanoids. The eicosanoids synthetized by the endometrium control many reproductive processes. The hypothesis of this study is that the eicosanoids synthesis by the endometrium on day seven after the estrous is regulated by the periovulatory endocrine milieu. The aims of this study were (1) to measure the expression of 23 genes that encode proteins involved in eicosanoids synthesis, transport and signaling and (2) to quantify eicosanoids on beef cows uterus exposed to different periovulatory hormonal profiles. Follicular growth was pharmacologically manipulated to generate two groups presenting large or small preovulatory follicle and corpus luteum (LF/CL and SF/CL respectively; n=11/group). Cyclic, non-lactating Nelore cows received two injections of cloprostenol (PGF2&alpha; 0.5mg; i.m.) 14 days apart. Ten days later (D-10), cows received a P4-releasing device along with estradiol benzoate (2mg; i.m.). To modulate the growth of the preovulatory follicles, on D-10, animals received PGF2&alpha; (LF/CL) or not (SF/CL). The P4-releasing devices were removed and PGF2&alpha; injected 60 to 42 hours before the ovulation induction in the LF/CL group and 48 to 30 hours before the ovulation induction in the SF/CL group. Ovulation was induced with buserelin (GnRH; 10&#181;g; i.m.) on D0. Plasma was obtained for measurement of estradiol concentrations from D-2 to D0 and from D0 to D7 for progesterone measurements. On D7, the animals that ovulated in response to GnRH were slaughtered and uterus flushing and endometrium were collected. Differences between group means were determined by students t test. Animals from LF/CL group presented larger preovulatory follicles, corpus luteum, estradiol and progesterone levels when compared to animals from SF/CL group (P<0.1). The quantification of the transcripts was performed by qPCR. PTGES, AKR1C3, AKR1C4, CBR1, PTGIS and ALOX12 were more abundant and PLA2G10 was less expressed in the endometrium from animals from LF/CL when compared to SF/CL (P<0.10). Metabolites concentration was measured by mass spectrometry in endometrial tissue (pg/g) and uterine flushings (ng/mL). The metabolite 9-HETE was more abundant on uterine flushings from animals with SF/CL (P<0.05). Different concentrations of estradiol (proestrous) and progesterone (beginning of diestrous) modulated the expression of genes related to eicosanoids synthesis, but it did not affect eicosanoids levels in the endometrium and uterine flushing in beef cattle on day 7 of the estrous cycle.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) luciana_moreira_ioc_mest_2007.pdf: 9179691 bytes, checksum: 2c7d90ce2854f60c131128c9ab783c1e (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Corpúsculos lipídicos são inclusões preenchidas principalmente por triglicerídeos e ésteres de colesterol, sendo também depósitos intracelulares de ácido araquidônico (AA). A participação de corpúsculos lipídicos na geração eicosanóides por células hematopoiéticas é suportada pela localização de proteínas envolvidas na cascata metabólica do AA e co-localização do produto final desta via, a prostaglandina E2 (PGE2). A PGE2 é o principal metabólito do AA produzido por células epiteliais, sendo um potente mediador capaz de modular a motilidade, sobrevivência celular, proliferação celular e angiogênese, que são processos importantes na restauração da homeostase do tecido epitelial após injúria. O nosso objetivo central é investigar a modulação de corpúsculos lipídicos em células epiteliais. Analisando a indução de corpúsculos lipídicos por mediadores inflamatórios, as vias de sinalização intracelular envolvidas, e a modulação de corpúsculos lipídicos durante a proliferação e migração celular. Utilizamos como modelo experimental uma linhagem celular derivada de epitélio intestinal normal de rato (IEC-6) A avaliação de corpúsculos lipídicos é realizada através da marcação com tetróxido de ósmio e contagem por microscopia de campo claro. Análise da expressão de proteínas é realizada por SDS-PAGE e a produção de PGE2 por ELISA. Células confluentes não apresentam corpúsculos lipídicos, enquanto células não-confluentes possuem em média de 15 a 20 corpúsculos/célula. A deprivação de soro fetal bovino leva a uma redução no número de corpúsculos lipídicos. Estímulos inflamatórios em células confluente, como IL-1?, PAF e PMA não provocam alterações no número de corpúsculos lipídicos. Enquanto a adição de AA induz a formação de corpúsculos lipídicos de maneira dose-dependente. A adição de PGE2, ou o tratamento com inibidores de COXs NS398 e Salicilato de Valeril não alteram o número de corpúsculos lipídicos. Inibidores seletivos de MEK 1 e 2 e de JNK 1,2 e 3 não interferem na indução de corpúsculos lipídicos por AA, enquanto o inibidor de p38 reduz em 80% a formação dessas estruturas. Nossos resultados indicam uma forte relação entre a biogênese de corpúsculos lipídicos e proliferação celular, e que essas organelas são induzidas de forma estímulo-específica em células epiteliais / Lipid Bodies (LBs) are cytoplasmic inclusions manly formed by triglycerides and cholesterol esters, being also intracellular deposits of arachidonic acid (AA), which can be metabolized for generation of eicosanoids. PGE2 is the major AA metabolite produced by epithelial cells. It is a potent mediator of cell motility, survival, proliferation and angiogenesis, all central processes to restoration of epithelial tissue homeostasis after injury. Our aim was to investigate LBs biogenesis and their role in AA metabolic pathway in epithelial cells. Specifically we evaluated: i) induction of LBs by inflammatory mediators; ii) intracellular signaling pathways involved in such induction; iii) and modulation of LBs during cell proliferation and migration. We used IEC-6 as experimental model, a cell line derived from rat normal intestinal epithelium. LBs were evaluated under light microscopy after staining by osmium tetroxide. Protein expression level was assessed by western blotting, and PGE2 generation determined by EIA in cell culture supernatants. IEC-6 cells cultured subconfluently in DMEM supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS) presented 15-20 LBs/cell. FBS withdraw or reaching confluency eliminated LBs. FBS-induced LB biogenesis in sub-confluent cells was blocked by ERK1/2 and p38 inhibitors. Stimulation of confluent IEC-6 by IL-1b, PAF and PMA was unable to induce LBs. In contrast, addition of AA dosedependently- induced LB formation, independent of its metabolism to PGE2, and proliferation foci in confluent cells. LBs formation induced by AA was dependent on signaling through p38, PKC and PI3K, but not on ERK 1/2 or JNK. LB biogenesis by epithelial cells facilitates AA release after activation without changes in cytosolic phospholipase A2-a (cPLA2-a) expression. Altogether, our results suggest a strong relationship between LB biogenesis and cell proliferation, and indicate that such organelles are induced in a stimulus-specific manner and facilitate AA mobilization in epithelial cells.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-graduação em Aquicultura, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:33:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O objetivo desta tese foi gerar conhecimento sobre as exigências dietéticas em ácidos graxos para o jundiá. Para isto foram realizados três estudos. O primeiro objetivou avaliar o crescimento de juvenis com diferentes fontes lipídicas. Cinco dietas, cuja variação na concentração de ácidos graxos essenciais foi obtida com a adição de diferentes fontes de lipídios na dieta, foram oferecidas a juvenis (1,5 g) durante 70 dias. Observou-se um crescimento adequado do jundiá com concentrações de 4 g kg-1 de 18:3 n-3 e de 10 g kg-1 de 18:2 n-6. A relação ideal entre os ácidos graxos essenciais da série n-3 e n-6 na dieta foi de 0,7. Portanto, dietas para o jundiá podem conter somente óleos vegetais como fonte lipídica, sem que haja prejuízo ao seu crescimento. O segundo estudo objetivou avaliar o efeito da inclusão de diferentes fontes de lipídios na dieta sobre a sobrevivência e a fagocitose dos leucócitos de juvenis de jundiá, após desafio com Aeromonas hydrophila hydrophila. Cinco dietas, contendo 8% de óleo de peixe, óleo de girassol, óleo de linhaça, óleo de canola ou gordura de coco foram oferecidas a juvenis (2,1 g) durante 150 dias, antes do desafio. A mortalidade foi menor nos peixes alimentados com as dietas que continham óleo de peixe e gordura de coco e superior nos alimentados com a dieta contendo óleo de linhaça. Os resultados evidenciam a relevância de utilizar uma fonte lipídica balanceada na dieta para promover a resposta imune da espécie. O terceiro estudo objetivou determinar a composição de ácidos graxos dos ovários de jundiás selvagens nos diferentes estádios de maturação gonadal. Fêmeas (n = 36) foram capturadas e classificadas segundo o estado de maturação da sua gônada. Constatou-se que a concentração de ácido araquidônico (20:4 n-6) é maior no início da maturação gonadal, enquanto que os ácidos graxos altamente insaturados da série n-3 (20:5 e 22:6) o são no final da maturação. Portanto, dietas para reprodutores da espécie devem incluir fontes lipídicas que contenham estes ácidos graxos altamente insaturados.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-13T14:42:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação completa(David).pdf: 16509548 bytes, checksum: 44c6bbf3d82089ebc82817764572ff34 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:42:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação completa(David).pdf: 16509548 bytes, checksum: 44c6bbf3d82089ebc82817764572ff34 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo a Ciências e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) / Os ácidos graxos essenciais exercem um papel crucial para o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Estudos recentes do nosso laboratório têm demonstrado que a restrição dietética crônica destes macronutrientes é capaz de induzir sinais de degeneração e perda de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra (SN) de ratos. O presente estudo visa testar a hipótese de que esta restrição dietética é capaz de alterar a distribuição de neurônios GABAérgicos nigrais bem como aumentar a funcionalidade e reatividade de astrócitos na SN e corpo estriado (CE). Ratos Wistar foram divididos em dois grupos de acordo com a dieta materna, a qual foi fornecida a partir do acasalamento e mantida por duas gerações. O grupo controle recebeu dieta balanceada contendo óleo de soja como fonte lipídica; grupo deficiente em ácidos graxos essenciais (DAGEs) recebeu dieta semelhante, mas tendo o óleo de coco como fonte lipídica. A capacidade funcional da glia foi analisada em homogenados do CE e SN a partir da atividade da enzima Glutamina Sintetase (GS). A distribuição dos astrócitos e neurônios GABAérgicos foi analisada a partir de imunohistoquímica utilizando-se anticorpos monoclonais para a Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP) e parvalbumina, respectivamente. Os níveis protéicos de GFAP foram analisados por Western blot. O perfil de ácidos graxos essenciais em fosfolipídios da SN ou CE foi analisado por cromatografia gasosa. Análise do padrão de complexidade morfológica dos astrócitos foi realizada avaliando-se índices como dimensão fractal, área de arborização e lacunaridade. Os resultados obtidos evidenciaram um aumento significativo (p < 0.01) na atividade da GS no CE de animais jovens (30-40 dias) e adultos (90-110 dias) do grupo DAGES, comparado ao controle. Na SN, um aumento na atividade da GS do grupo DAGES (p<0.001) só foi observado aos 90 dias. Um aumento na dimensão fractal dos astrócitos (p=0.009) foi observado apenas nos animais jovens do grupo DAGES, comparado ao controle. No entanto um aumento da área de arborização dos astrócitos foi detectado no grupo DAGES tanto em animais jovens (p=0.004) como nos adultos (p=0.005). Não houve diferença na lacunaridade tanto nos animais jovens quanto nos animais adultos. Modificações na expressão das isoformas da proteína GFAP foram também induzidas pela dieta experimental nos animais jovens, observando-se um aumento na isoforma de 42 KDa no CE, SN assim como no córtex cerebral. Análise dos astrócitos marcados para GFAP sugere ausência de astrogliose na SN do grupo DAGEs tanto em animais jovens como adultos. Quantificação preliminar realizada em 4 animais adultos do grupo DAGES e 3 animais do grupo controle sugere que o número de neurônios imunorreativos a parvalbumina da SN não difere entre os grupos. Os resultados obtidos sugerem que a restrição dietética em ácidos graxos essenciais por duas gerações induz efeitos adversos sobre a diferenciação e atividade funcional dos astrócitos, evidenciando também uma reatividade diferenciada entre as células da glia da SN e CE. Contudo, a restrição dietética por duas gerações não é capaz de causar astrogliose na SN dos animais jovens e adultos.

INTRODUÇÃO: A esteato-hepatite não alcóolica (NASH) é considerada problema de saúde pública, dada sua crescente incidência e seu possível papel na carcinogênese hepato-celular. Terapias atuais envolvem alterações de dieta e estilo de vida, mas têm seu resultado prejudicado pela baixa aderência dos pacientes. Abordagens farmacológicas ainda são precárias. Uma grande dificuldade no manejo de NASH reside no limitado entendimento de sua fisiopatologia, que parece envolver complexas alterações metabólicas e inflamatórias. Ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) são reconhecidos por suas propriedades moduladoras do metabolismo lipídico e da inflamação, e estão diminuídos em pacientes com NASH. O uso clínico de AGPIs n-3 tem mostrado benefício no controle da esteatose e na produção de marcadores da resposta metabólica e inflamatória em NASH, embora com algumas observações contraditórias. A compreensão de mecanismos moleculares modulados por AGPIs n-3 em NASH podem ser úteis para identificar alvos moleculares que auxiliem no desenho de intervenção farmacológica efetiva. Nesse sentido, ciências ômicas são particularmente úteis para a compreensão de mecanismos moleculares com alto valor translacional para a prática clínica e podem contribuir para a identificação desses alvos. OBJETIVO: O presente estudo avaliou a resposta proteômica hepática e lipidômica plasmática de pacientes com NASH perante o tratamento com AGPIs n-3. MÉTODO: As avaliações proteômicas e lipidômicas foram desenvolvidas por espectometria de massas e/ou cromatografia gasosa em amostras de biópsias hepáticas e plasma coletadas de pacientes envolvidos em estudo preliminar, realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O referido estudo envolveu pacientes adultos, de ambos os sexos e com diagnóstico de NASH tratados diariamente, durante 6 meses, com 3 cápsulas contendo mistura de óleo de linhaça e óleo de peixe [0,315 g AGPIs: sendo 0,065 g de ácido eicosapentaenoico (EPA), 0,050 g de docosahexaenoico (DHA) e 0,2 g alfa linolênico (ALA) por cápsula]. Pacientes, após o tratamento com AGPIs n-3, que apresentaram altas concentrações plasmáticas de ALA e/ou DHA e/ou baixas de ácido araquidônico (AA) mostraram melhora parcial das alterações de histologia hepática. No presente estudo, avaliamos as vias proteômicas e marcadores lipidômicos resultantes do tratamento com AGPIs n-3. Isto foi feito por meio da comparação, antes (grupo AT) e depois do tratamento (grupo DT), de pools de tecido hepático (análise por interactoma) e amostras de plasma (OPLS-DA). RESULTADOS: Foram identificadas proteínas hepáticas, exclusivamente e/ou alteradamente expressas, no grupo DT, relacionadas com vias de matriz celular, metabolismo lipídico, de estresse oxidativo, e de retículo endoplasmático e respiração celular. Com excessão da via de matriz celular, a análise do interactoma revelou alteração funcional significativa das vias moduladas por essas proteínas. Em conjunto, essas alterações foram sugestivas de diminuição de lipotoxicidade, estresse oxidativo e respiração anaeróbia, e aumento de respiração aeróbia após tratamento com AGPIs n-3. Estas modificações são marcadores potenciais de melhora de função de retículo endoplasmático e mitocondrial. Em adição, após o tratamento com AGPIs n-3, o perfil lipidômico plasmático mostrou-se alterado com significativo aumento de glicerofosfolípides, ALA e EPA, e diminuição de ácido araquidônico (n-6) e da razão AGPIs n-6/n-3. Estes dados são concordantes com potencial melhora das funções de retículo endoplasmático e mitocondriais. CONCLUSÃO: O tratamento com AGPIs n-3 em pacientes com NASH influenciou favoravelmente o perfil proteômico hepático e lipidômico sistêmico. Em conjunto, essas alterações sugerem melhora da função de retículo endoplasmático e mitocondrial, com potencial impacto na homeostase celular, por meio da modulação de diferentes vias biológicas / INTRODUCTION: Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is considered a public health problem, given its increasing incidence and its possible role in hepatocellular carcinogenesis. Current therapies involve diet and lifestyle changes, but its applicability suffers from low patients adherence. Pharmacological approaches are still missing. A main difficulty in the NASH management lies in the limited understanding of its pathophysiology, which seems to involve complex metabolic and inflammatory disturbances. Omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) are recognized for its modulatory properties on lipid metabolism and inflammation and are decreased in patients with NASH. The clinical use of these PUFAs has shown benefit in controlling steatosis and the production of metabolic and inflammatory response markers in NASH, despite some conflicting reports. Understanding mechanisms modulated by n-3 PUFAs in NASH may be useful for identifying molecular targets that could assist in the design of effective pharmacologic interventions. In this sense, omics sciences are particularly useful for understanding molecular mechanisms with high translational value to clinical practice and may contribute to the identification of these targets. AIM: This study evaluated the liver proteomic and plasma lipidomics responses of patients with NASH towards treatment with n-3 PUFAs. METHODS: The proteomic and lipidomic evaluations were studied by mass spectrometry and / or gas chromatography in samples from liver biopsies and plasma collected from patients enrolled in a preliminary clinical trial of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. This study involved adult patients of both sexes diagnosed with NASH treated daily for 6 months, with 3 capsules containing a mixture of linseed and fish oils [0.315 g PUFAs: 0.065 g eicosapentaenoic acid (EPA) , 0.050 g docosahexaenoic (DHA) and 0.2 g alpha linolenic acid (ALA) per capsule]. Patients, after treatment with n-3 PUFAs, with higher concentrations of ALA and DHA and lower arachidonic acid (AA) showed improvement of liver histology alterations. In the present study we evaluated the proteomics pathways and lipidomics markers resulted from treatment with PUFAs n-3. This was performed by comparing, before (BT group) and after (AT group) treatment, liver tissue pools (analysis interactome) and plasma samples (OPLS-DA). RESULTS: It was identified, in a way exclusive and altered, the expressed liver proteins in AT group, related to pathways of cellular matrix, lipid metabolism, oxidative and endoplasmic reticulum stress and cellular respiration. With the exception of cell matrix, the analysis of the interactome revealed substantial functional alterations of the pathways modulated by these proteins. Together, these changes were suggestive of decreased lipotoxicity, oxidative stress and anaerobic respiration and increased aerobic respiration following treatment with PUFAs n-3. These modifications are potential markers of endoplasmic reticulum and mitochondrial functions improvement. In addition, after treatment with n-3 PUFAs, the lipidomics profile was modified, with significant increase in glycerophospholipids, ALA and EPA and decrease of arachidonic acid (AA) and n-6/n-3 AGPIs ratio. These findings are concordant with potential improvement of reticulum endoplasmic and mitochondrial functions. CONCLUSION: In patients with NASH the treatment with n-3 PUFAs favorably influenced hepatic proteomic and systemic lipidomics profiles. Together, these changes suggest improved endoplasmic reticulum and mitochondrial functions, with potential impact on cellular homeostasis through the modulation of different biological pathways