Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / La thermoplastie bronchique (BT) est une approche interventionnelle ponctuelle consistant en la libération d'énergie thermique dans les conduits respiratoires et qui est préconisée pour le traitement de l'asthme sévère non-contrôlé. Les améliorations cliniques en lien avec la thermoplastie persistent pour plus de dix ans. Toutefois les données à long terme sur les effets du traitement sont limitées et les mécanismes biologiques permettant d'expliquer l'amélioration du contrôle de l'asthme ne sont que partiellement compris. Les objectifs du présent projet visaient à documenter les effets de la BT sur le remodelage bronchique à très long terme et à identifier de nouvelles voies biologiques modulées au sein de l'épithélium bronchique par la thermoplastie. Les données cliniques et histologiques d'un groupe de patient suivi plus de 10 ans après traitement à la thermoplastie (BT10+) ont été comparées à un groupe de référence (groupe comparatif). La masse musculaire lisse retrouvée dans les biopsies du groupe BT10+ est comparable à ce qui est mesuré dans celles du groupe comparatif après traitement (4,93 ± 1,11% et 4,59 ± 0,88% respectivement) et nettement inférieur à ce qui a été mesuré avant traitement dans la cohorte comparative (13.16 ± 1.12%). L'étude du transcriptome de cellules épithéliales bronchiques (CEB) a révélé la modulation des gènes de la famille des S100A par la BT. Une validation expérimentale a révélé un enrichissement de l'expression de S100A7/A8/A9 à l'échelle du gène et de la protéine dans les CEB d'asthmatiques sévères et une réduction de l'expression induite par la BT dans les CEB et les tissus. L'expression des S100A pourrait être associée à la sévérité de la maladie. L'amélioration du remodelage induite par BT persiste pour plus de 10 ans comme l'amélioration clinique. Les S100A sont de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pertinentes à la physiopathologie de l'asthme sévère et dont l'expression est modulée par la BT. / Bronchial thermoplasty (BT) is a one-time interventional approach consisting in the release of thermal energy into the airways that is advocated for the treatment of severe uncontrolled asthma. Clinical improvements associated with thermoplasty persist for more than a decade. However, long-term data on the effects of treatment are limited and the biological mechanisms explaining the improvements in asthma control are only partially understood. The objectives of the present project were to document the effects of BT on very long-term bronchial remodeling and to identify new biological pathways modulated within the bronchial epithelium by thermoplasty. The clinical and histological data of a group of patients followed more than 10 years after thermoplasty treatment (BT10+) were compared to a reference group (comparative group). The smooth muscle area found in the biopsies of the BT10+ group was similar to that measured in the comparative group after treatment (4.93 ± 1.11% and 4.59 ± 0.88% respectively) and significantly lower than that measured before treatment in the comparative cohort (13.16 ± 1.12%). Transcriptome study of bronchial epithelial cells (BECs) revealed modulation of S100A family genes by BT. Experimental validation showed an enrichment of S100A7/A8/A9 expression at the gene and protein level in BECs of severe asthmatics and a reduction of BT-induced expression in BECs and tissues. S100A expression might be associated with disease severity. BT-induced improvements on remodeling persist for more than 10 years along with the clinical improvement. S100A are potential new therapeutic targets relevant to severe asthma pathophysiology and whose expression is modulated by BT.

Actinobacillus pleuropneumoniae et Streptococcus suis sont des bactéries pathogènes entraînant des maladies porcines mortelles et des pertes économiques importantes dans l’industrie porcine mondiale. Ces bactéries sont notamment reconnues pour leur implication dans certaines maladies pulmonaires porcines, dont la pneumonie, et leurs mécanismes de pathogénicité ne sont pas parfaitement élucidés. De ce fait, nous nous sommes intéressés à l’activité de ces deux bactéries sur la barrière épithéliale de la trachée du porc, soit un modèle représentatif de la première ligne de défense des voies respiratoires supérieures du porc. Plus précisément, nous avons étudié la capacité d’A. pleuropneumoniae et de S. suis à induire une perte d’intégrité de la barrière épithéliale, à la traverser, et à induire une réponse inflammatoire. En considérant les cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules épithéliales en présence de ces bactéries pathogènes, les effets du TNF-α sur la barrière épithéliale ont également été analysés. Nous avons démontré qu’A. pleuropneumoniae, S. suis et le TNF-α sont aptes à induire des dommages importants à la barrière épithéliale et à permettre la translocation de ces bactéries pathogènes à travers cette barrière. Ces résultats suggèrent que la barrière épithéliale puisse représenter une cible thérapeutique contre les infections engendrées par les bactéries pathogènes environnantes afin de limiter leur capacité d’invasion. Pour ce faire, il serait nécessaire d’investiguer davantage les facteurs de virulence de ces bactéries contribuant à la perte d’intégrité de la barrière épithéliale des voies respiratoires supérieures du porc afin d’élaborer de potentiels thérapies ciblées inhibant leur pathogénicité

La polarisation apico-basale des cellules épithéliales est cruciale pour le maintien de l'intégrité des tissus épithéliaux et sa perte contribue à la progression tumorale. Les protéines établissant cette polarité sont divisées en modules apicaux et basolatéraux qui s'excluent mutuellement de leur domaine respectif. La zonula adherens (ZA) forme l'interface entre ces deux domaines. La ZA joue aussi un rôle clé dans la cohésion intercellulaire et la morphogenèse épithéliale. Elle est composée de protéines d'adhésion, d'une ceinture d'actomyosine et de protéines de polarité. L'homéostasie épithéliale est déterminée par une fine collaboration entre les protéines de polarité et celles de la ZA. Le but de mon doctorat a été d'étudier ce lien existant entre les protéines de polarité et celles composant la ZA. Pour cela, au laboratoire nous utilisons un outil in vivo avantageux se nommant Drosophila melanogaster ainsi que des modèles de cellules épithéliales humaines cultivées en 2 ou 3 dimensions. Dans un premier temps, mes travaux de thèse se sont concentrés sur les protéines Girdin. Girdin chez la drosophile et GIRDIN, son orthologue humain, sont des protéines d'échafaudage qui sont impliquées dans de multiples processus cellulaires dont celui qui nous a principalement intéressé au cours de mon doctorat : l'adhésion intercellulaire. Au laboratoire, Dre Élise Houssin a montré que Girdin renforçait l'ancrage des protéines d'adhésion à la ceinture d'actomyosine constituant la ZA (Houssin et al., 2015), une fonction conservée chez son orthologue humain (Wang et al., 2018a). De plus, GIRDIN interagit physiquement avec des protéines de polarité, telles que Par3 et aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015). Nous avons donc émis l'hypothèse que les protéines Girdin jouaient un rôle dans le maintien de la polarité épithéliale. Pour y répondre, nous avons réalisé des interactions génétiques entre girdin et différents gènes de polarité. L'interprétation de l'ensemble de nos résultats indique que Girdin et son orthologue soutiennent les déterminants latéraux de polarité en réprimant l'activité de la kinase apicale aPKC. De plus, nous avons mis en lumière que la sous-expression de GIRDIN est associée à la dissémination de cellules issues de sphères tumorales, un phénomène également observé in vivo pour son orthologue de drosophile (Houssin et al., 2015). La perte de la polarité épithéliale ainsi que la dissémination cellulaire observées dans les sphères tumorales sous-exprimant GIRDIN indiquent qu'elle pourrait contrer la progression tumorale en maintenant la polarité épithéliale et la cohésion cellulaire. Nos observations ont été appuyées par l'analyse de tissus tumoraux de patients qui a établi un lien entre l'altération de l'expression de GIRDIN et une faible espérance de survie de ces patients dans deux sous-types de cancer du sein et du poumon. Dans un deuxième temps, les travaux présentés dans cette thèse ont également contribué à une meilleure compréhension du rôle de la protéine Yurt (Yrt) dans le maintien de l'architecture épithéliale (chapitre 2 et 3). Tout d'abord, nous avons mis en lumière le rôle de cette protéine de polarité dans l'induction de la tension épithéliale. La caractérisation de cette fonction nous a permis d'explorer les régulateurs et effecteurs de Yrt. Ainsi, nous avons constaté que Yrt est recrutée au domaine apical par la protéine apicale Crumbs pour promouvoir la tension épithéliale. De plus, la kinase aPKC et le module Pak1-PP2A ont des effets antagonistes sur son activité. aPKC phosphoryle Yrt pour l'inhiber alors que l'axe Pak1-PP2A la déphosphoryle afin d'induire son activité. J'ai également étudié le rôle d'un partenaire physique de Yrt, la NAD synthetase (Nadsyn) qui m'a conduit à explorer une nouvelle voie de signalisation effectrice de Yrt. En effet, nous avons constaté que Yrt pourrait recruter la Nadsyn aux membranes plasmiques pour produire localement du NAD⁺, le co-substrat de la famille des sirtuines, activant ces déacétylases. Cette activation locale permettrait de désacétyler des protéines clés de la contraction cellulaire et/ou de la polarité épithéliale afin de réguler l'architecture épithéliale. Ces deux études dévoilent les modes de régulation et d'action de la protéine Yrt chez la drosophile. Ses deux orthologues étant fortement surexprimés dans de nombreux cancers agressifs, il sera pertinent de valider la conservation de ces mécanismes chez l'humain, afin de déceler de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes régulant l'homéostasie épithéliale. La perte de l'architecture épithéliale étant étroitement liée à la progression tumorale, ses travaux ouvrent la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / Epithelia form the basis of animal tissue architecture, establishing a barrier against diffusion and providing mechanical structure by their apico-basal asymmetry and adhesive properties. This apico-basal polarity is regulated through various polarity protein complexes characterized by a mutual antagonism between apical and basolateral complexes. Cells adhere to each other with the major cohesive and contractile adhesion of epithelial cells, the zonula adherens (ZA). The ZA machinery contains a strong cohesive complex linked to an actomyosin belt, and forms the interface between the apical and basolateral domains. This actomyosin belt is the main modulator of the epithelial tension. Apico-basal proteins collaborate with the ZA machinery to control tissue architecture homeostasis. Loss of epithelial architecture, such as apico-basal polarity loss or cell-cell cohesion loss, is a hallmark of tumoral progression. My PhD work was aimed at deciphering the molecular mechanisms controlling epithelial polarity and ZA homeostasis using the sophisticated in vivo model Drosophila melanogaster. First, we investigated the role of the scaffold Girdin proteins in epithelial architecture. Previously in the laboratory, the drosophila Girdin protein has been shown to localize at and to reinforce the ZA cohesion (Houssin et al., 2015), a function shared by its human ortholog GIRDIN (Wang et al., 2018a). Furthermore, GIRDIN has been shown to physically interact with polarity proteins such as Par3 and aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015), but its role in cell polarity remained unclear. Using genetic interactions combined with biochemistry technics we demonstrated that Girdin proteins support basolateral determinants by negatively regulating the apical kinase aPKC. In addition, we observed cell detachment and dissemination from GIRDIN knockdown cysts, a phenomenon also reported in girdin null embryos (Houssin et al., 2015). Thus, GIRDIN is required for the cohesion of multicellular epithelial structures that is crucial to prevent various pathological conditions such as cancer progression (Halaoui & McCaffrey, 2015). Indeed, we found a correlation between a low expression of GIRDIN mRNA and a decreased survival in more aggressive breast cancer subtypes and lung adenocarcinoma. The second and third result chapters show that the Drosophila polarity protein Yrt plays a role in epithelial tension and explore the upstream activators and downstream effectors pathways of Yrt. Yrt was previously shown to limit the ability of Crumbs to promote apical membrane growth, thereby defining proper apical/lateral membrane ratio in epithelial cells (Laprise et al., 2006; Laprise et al., 2009). Our results show that Yrt, by interacting with Crumbs, also induces epithelial tension by organizing the apical localization of the non-muscle myosin II, which is needed during embryogenesis. Mechanistically, the apical kinase aPKC phosphorylates Yurt, thereby dislodging Yrt from the apical domain and releasing apical tension. In contrast, the Pak1- PP2A module promotes Yrt dephosphorylation, leading to its apical localization and function. We then investigated how Yrt could reorganize the cytoskeleton to induce epithelial tension. We performed a genetic screen on the Yrt physical interactome. We identified the NAD synthetase (Nadsyn), an enzyme responsible for the de novo NAD⁺ synthesis, as a strong interactor of Yrt. We observed that Yrt recruits Nadsyn to the plasma membrane and that apical constriction induced by Yrt is Nadsyn- and NAD⁺-dependent. Based on these novel findings, we proposed that Yrt may recruit Nadsyn to locally produce a NAD⁺ pool that activates the deacetylases Sirtuin1 or 2, thereby deacetylating proteins involved in cell contractility and cell polarity. This model remains to be clarified by further work. Since Yrt's human orthologs are overexpressed in many epitheliaderived tumors and are associated with a poor survival outcome, deciphering whether the signaling pathways uncovered in our work are preserved in humans could help uncovering novel therapeutic approaches. In conclusion, my PhD work dissected the role of new proteins and pathways involved in the maintenance of epithelial cell architecture. Since the maintenance of an epithelial structure counteracts tumor progression, it also highlights new therapeutic possibilities.

GATA-4 est un facteur de transcription essentiel dans la formation du tube cardiaque primitif. Dans l'intestin, GATA-4 joue un rôle dans le développement et dans le maintien de l'identité jujéno-iléale. L'analyse par micropuce à ADN effectuée sur des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 suggère un rôle de GATA-4 dans la réponse inflammatoire et des études antérieures réalisées au laboratoire ont permis de confirmer l'implication de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire C/EBPdépendante. L'objectif de mon projet était de déterminer si GATA-4 module la réponse inflammatoire par d'autres mécanismes que ceux déjà découverts au laboratoire et de générer des mutants de GATA-4 pour caractériser l'implication de certains domaines et sites spécifiques de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire intestinale. Des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 ou des mutants de GATA-4 de façon stable, induites ou non à l'IL-1[béta] ont été utilisées comme modèle. L'activation des voies MAPK et Akt a été vérifiée par immunobuvardage de type Western. La liaison à l'ADN des facteurs de transcription AP-1, C/EBPs et NF-[kappa]B a été vérifiée par gel de rétention. L'expression de certains gènes de réponse inflammatoire a été vérifiée par RT-PCR. Finalement, des lignées cellulaires exprimant des mutants de GATA-4 ont été partiellement caractérisées. Mes résultats montrent qu'une surexpression de GATA-4 dans les IEC-6 traitées à l'IL-1[béta] réduit la phosphorylation de p42/p44 et d'Akt. Les facteurs de transcription AP-1, C/EBP et NF-[kappa]B sont davantage recrutés à l'ADN. La nature de leurs complexes semble être également affectée. Cette induction de liaison coïncide avec une baisse d'expression des gènes pro-inflammatoires CCL5 et iNOS. La caractérisation des mutants de GATA-4 suggère que le premier doigt de zinc (216-240) pourrait moduler la morphologie cellulaire et que la région basique (294-336) pourrait contribuer à la vitesse de prolifération augmentée des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4. En somme, mes résultats suggèrent que GATA-4 pourrait participer à l'instauration d'une tolérance immunitaire prenant place lors de la différenciation entérocytaire.

Le tégument est formé de deux tissus, un épithélium et un mésenchyme. Il comprend la peau et la cornée. Au niveau de la face, ces derniers ont une origine embryonnaire commune: ectoderme et cellules des crêtes neurales. J'ai tout d'abord contribué à la mise en évidence de l'acquisition par le derme embryonnaire de ses capacités inductrices sur l'épiderme, et de l'indépendance de la différenciation de l'épithélium cornéen vis-à-vis de son mésenchyme, le stroma. Mes travaux principaux ont été d'établir quelle était la signature moléculaire du programme cornéen, et à quel moment et comment ce programme est mis en place chez l'embryon. La comparaison des transcriptomes des cellules souches de la cornée à celui des cellules souches épidermiques chez la souris montre 3621 gènes communs et 1768 gènes cornéens propres, en plus de Pax6, le gène clé de l'oeil, et de K12, la kératine type de la différenciation terminale de l'épithélium cornéen. La cornée résultant, selon un dogme ancien, d'une induction par le cristallin, j'ai effectué des expériences chez l'embryon de poulet de 2 jours afin de le vérifier. L'ablation chirurgicale de la placode cristallinienne ayant mis en évidence sa régénération, j'ai prévenu sa formation en électroporant Gremlin, un inhibiteur de BMP4, requis lors la spécification du cristallin par la vésicule optique. L'obtention d'oeil sans cristallin mais avec un épithélium cornéen exprimant K12 montre que le programme cornéen s'effectue par défaut lorsque le programme cristallinien est interrompu. Cet arrêt se produit normalement à la périphérie de la placode cristallinienne qui s'invagine, lors de la migration des cellules des crêtes neurales, productrices de Gremlin. Les précurseurs de l'épithélium cornéen sont donc communs avec ceux du cristallin, qui sont connus pour se ségréger chez l'embryon lors de la formation du domaine préplacodal au stade neurula.

Les tumeurs sont caractérisées par une croissance exacerbée ainsi qu’une capacité à pouvoir se disséminer dans l’organisme. Ces deux aspects sont assurés en partie par une expression et une sécrétion soutenues de protéases. Plus particulièrement, une expression importante et une délocalisation de la protéase à cystéine cathepsine B corrèle avec les pouvoirs métastatiques de plusieurs types de tumeurs. La cathepsine B est une protéase lysosomale dont le rôle majeur est de dégrader les protéines en fin de vie. Dans les cancers colorectaux, l’épithélium colique possède une importante activité cathepsine B dès l’apparition d’adénomes précoces, mais aussi dans des tumeurs avancées et métastatiques. Par ailleurs, une expression et une activité importante de cette enzyme sont des indices de mauvais pronostics de survie chez les patients atteints de cancers colorectaux. Le but de ce travail a été d’évaluer l’importance de la cathepsine B dans les processus tumorigéniques de lignées cancéreuses colorectales. Pour cela, nous avons analysé les statuts d’expression, de sécrétion et d’activité de la cathepsine B dans les cellules normales HIEC comparativement à sept lignées cancéreuses colorectales humaines. La cathepsine B est sécrétée par les lignées cancéreuses et par les cellules HIEC qui expriment néanmoins de hauts niveaux de cathepsine B intracellulaire et sécrètent la forme non-active de la cathepsine B. Par ailleurs, nous avons employé la technique d’interférence à ARN ciblant spécifiquement les transcrits de la cathepsine B dans deux lignées cancéreuses colorectales afin d’en évaluer l’impact sur leurs capacités de croissance et d’invasion. Le ciblage de la cathepsine B réduit de manière modeste la croissance sur plastique de ces deux lignées cancéreuses ; cependant, leur potentiel à former des colonies en indépendance d’ancrage ainsi que leur capacité à migrer et envahir la matrice extracellulaire sont drastiquement affectés par la baisse de cathepsine B. En parallèle, le ciblage pharmacologique des formes actives et sécrétées de la cathepsine B réduit les pouvoirs d’invasion des cellules cancéreuses sans interférer avec leur capacité à former des colonies en indépendance d’ancrage. De plus, nous avons pu montrer que le ciblage moléculaire de la cathepsine B dans les deux lignées cancéreuses réduit de manière importante leurs capacités tumorigéniques chez la souris. L’analyse biochimique des tumeurs sous-exprimant la cathepsine B révèle des niveaux plus importants de l’inhibiteur du cycle cellulaire p27[indice supérieur Kip1] ainsi qu’une réduction de la cycline B. Enfin, nous avons montré que la cathepsine B a la capacité de cliver directement l’inhibiteur p27[indice supérieur Kip1], contribuant ainsi à sa dérégulation dans le cancer colorectal. De plus, la génération d’un mutant de p27[indice supérieur kip1] non clivable par cette enzyme permet d’augmenter de manière significative la stabilité de l’inhibiteur. En résumé, l’ensemble de ces travaux montre que la cathepsine B est un acteur important dans les caractères tumoraux des cellules cancéreuses colorectales et que son ciblage moléculaire et/ou pharmacologique pourrait être une approche valide pour réduire l’expansion de ces tumeurs chez l’humain.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Des pathologies lourdes, telles que les dystrophies de la rétine et certains cancers, impliquent une désorganisation de l'épithélium et la famille Crb, dont la protéine apicale Crumbs3 (isoformes Crb3A et Crb3B) fait partie. Les protéines transmembranaires Crb possèdent un domaine intracellulaire fortement conservé et des partenaires communs. Il est donc essentiel de comprendre comment ces protéines Crb sont régulées afin de mieux appréhender ces pathologies. Pour cela, j'ai étudié le complexe de polarité apical Crb3A (Crb3A, Pals1, PATJ) impliqué dans l'établissement et le maintien de la polarité apico-basale. Je me suis, tout d'abord, intéressée à la régulation des isoformes de Crb3 par leurs partenaires (Pals1 et PATJ), puis, à la régulation des protéines de la membrane apicale, dont Crb3A, par la Drebrine E2, un nouveau partenaire de Crb3A impliqué dans l'organisation du cytosquelette d'actine et la morphogenèse apicale. Mon travail a permis de mettre en évidence: 1) la régulation de la dynamique membranaire des isoformes de Crb3 par PATJ dans les cellules Caco-2/TC7, une lignée épithéliale intestinale humaine, mais aussi, 2) d'identifier une nouvelle fonction de la Drebrine E2 dans la régulation du trafic de plusieurs protéines de la membrane apicale dans ces cellules, dont, par exemple, la DPPIV (DiPeptidyl Peptidase IV). Dans les cellules déplétées en Drebrine E2, l'expression des protéines apicales est diminuée et leur endocytose est augmentée, puis, elles sont relocalisées dans le compartiment majeur de dégradation, le lysosome. / Some serious diseases like retinal dystrophies and some cancers involve epithelial cells disorganization and the Crumbs (Crb) proteins family. The apical Crb3 (Crb3A and Cr3B isoforms) protein belongs to Crb family. The transmembrane proteins Crb have a conserved intracellular domain with common partners. It is unclear how Crb proteins are regulated by their partners and this information is required to better understand these pathologies. Here, we decided to study the apical polarity Crb3A complex (Crb3A, Pals1, PATJ) which is involved in apico-basal polarity establishment and maintenance. First, I investigated Crb3 isoforms regulation by their partners (Pals1 and PATJ). Then, I studied the regulation of apical membrane proteins, such as Crb3A, by Drebrin E2, a new partner of Crb3A which is involved in actin cytoskeleton remodeling and apical morphogenesis. During my thesis, I demonstrated: 1) the regulation of Crb3 isoforms dynamics by PATJ in Caco-2/TC7 human intestinal epithelial cells, but also, 2) a new function for Drebrin E2 in regulating the trafficking of apical membrane proteins, like DPPIV (DiPeptidyl Peptidase IV). In Drebrin E2 KD cells, apical membrane proteins expression is decreased and we observe an increased endocytosis. This leads to relocalization of the apical membrane proteins to the main degradative compartment, the lysosome. These new datas suggest a role for Drebrin E2 in the regulation of apical membrane proteins recycling pathway. The Drebrin E2 KD cells phenotype is reminiscent of the microvillar inclusions disease (MVID). Now, I am trying to investigate the link between theses pathways.

La polarité apico-basale des cellules épithéliales est requise pour le développement de l’épithélium, le maintien de son intégrité et sa fonction. Elle est définie par les relations dynamiques d’un réseau de protéines de polarité qui se localisent asymétriquement et s’excluent mutuellement pour déterminer les différents domaines corticaux. Le complexe Crumbs (Crb) est un déterminant clé du domaine apical, essentiel et suffisant pour sa définition. Patj, une protéine contenant un domaine L27 et 4 domaines PDZ, a été identifiée comme faisant partie biochimiquement du complexe Crb (via Stardust), mais sa fonction reste à préciser. Au cours de ma thèse j’ai analysé la fonction Patj chez la drosophile. La mutation Patj est létale et induit une perte de Crb de la membrane apicale dans l’épithélium folliculaire, mais pas dans l’embryon. La fonction de Patj est donc tissu spécifique. J’ai pu mettre en évidence que Patj régule positivement Crb et que les domaines PDZ1 ou PDZ4 associés au domaine L27 sont suffisants pour la fonction de Patj. J’ai de plus tenté de déterminer comment Patj régule Crb à l’échelle moléculaire. Tout d’abord, l’analyse fonctionnelle in vivo suggère que Patj régulerait la stabilité de Crb indirectement en favorisant le recrutement d’autres déterminants du domaine apical au sein du complexe. Ensuite, des approches biochimiques et génétiques ont permis de montrer qu’en plus d’interagir indirectement avec Crb, Patj interagit aussi directement via ces domaines PDZ1 et PDZ4. Ces données permettent de proposer un modèle mécanistique dans lequel Patj en liant à la fois Sdt et Crb formerait des dimères de Crb, qui en association avec sa dimèrisation extracellulaire déjà connue permettrait la formation d’oligomères de Crb à la membrane apicale. L’oligomérisation de Crb favoriserait son activité de déterminant apical. De plus, j’ai observé une redondance entre Patj et Lin-7, un autre membre du complexe Crb, dans la polarité apico-basale, une telle fonction pour Lin-7 n’ayant pas encore été reportée. Ainsi, mes travaux apportent de nouveaux éléments pour la compréhension de la polarité épithéliale. / Apico-basal polarity is required for epithelium development, function and integrity. Polarization is defined by a network of polarity proteins that are localized asymmetrically and the dynamic interplay between them. Crb is a key determinant of the apical domain, necessary and sufficient for its identity. Patj, a protein containing a L27 domain and four PDZs domains, has been identified as a core component of the Crb complex, as it interacts with Crb through Sdt. But its function remains elusive. During my thesis I investigated Patj function in Drosophila. Patj mutation is lethal and induces a decrease of Crb from the apical domain in the follicular epithelium, but not in embryonic epithelium. Thus, Patj function is tissue-specific. Patj positively regulates Crb, and the PDZ1 or PDZ4 together with the L27 domain of Patj are sufficient for its function. Then, I focused on the molecular mechanism underlying Crb regulation. In vivo analysis suggests that Patj regulates Crb stability indirectly by modulating its ability to recruit apical proteins. Biochemical and genetics analyses allow showing that in addition of its indirect interaction through Sdt, Patj interacts directly with Crb through its PDZ1 and PDZ4. Extra-cellular dimerisation of Crb is involved in a feedback promoting its apical localization. Patj with Crb direct interaction could participate to this feedback via an intra- cellular dimerisation, allowing Crumbs oligomerisation at the apical membrane. In addition, I have seen that Patj is redundant with Lin-7, another core component of Crb complex, for apico- basal polarity. In conclusion my thesis work provides new clues for the understanding of epithelial polarity regulation.

Les particules de dioxyde de titane (TiO2) sont utilisées dans de nombreux secteurs industriels du fait de leurs propriétés physiques et chimiques intéressantes. Depuis une dizaine d’années, elles sont également utilisées sous forme nanoparticulaire car la taille nanométrique leur apporte de nouvelles propriétés, recherchées dans certaines applications industrielles. Elles sont par exemple utilisées comme colorant blanc dans le secteur de la cosmétologie, de la pharmacologie et dans les industries agroalimentaires. Dans ces dernières, l’utilisation de ces particules est autorisée car le TiO2 est un composé insoluble et relativement inerte. Le colorant alimentaire E171, autorisé depuis 1966, est ainsi constitué de particules de TiO2, initialement sous forme micrométrique, mais il s’avère que selon les procédés de fabrication, entre 10 et 43 % (selon les études) de ces particules présentent un diamètre inférieur à 100 nm, i.e. sont sous forme nanométrique. Ce n’est pas un nanomatériau du point de vue de la définition européenne, il n’est donc pas soumis à l’obligation d’étiquetage dans les produits alimentaires. Le E171 est présent dans de nombreux aliments sans que son impact sur la santé humaine, après ingestion, n’ait été clairement documenté. De plus en plus d’études s’intéressent à la toxicité des nanoparticules (NPs) après leur ingestion, mais peu d’entre elles ont été menées avec le E171 à proprement parler. Les études in vivo et in vitro publiées à ce jour démontrent que les NPs de TiO2 sont peu toxiques. Leur absorption intestinale et leur translocation vers le système sanguin puis des organes secondaires est faible. Les principaux effets décrits sont une augmentation des espèces réactives de l’oxygène associées à un stress oxydant, l’induction de marqueurs de l’inflammation, et plus récemment l’induction du stress du réticulum endoplasmique. Des effets sont également rapportés sur différents paramètres de la barrière intestinale, i.e. le microbiote, le mucus, les transporteurs membranaires, les jonctions cellulaires et l’immunité intestinale. Chez certaines personnes, cette barrière est compromise, elles sont donc potentiellement plus sensibles aux micros et nanos-particules contenues dans l’alimentation. Leur épithélium intestinal est enflammé, et à long terme, ces personnes peuvent développer des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et dans les cas les plus graves, des cancers.L’objectif de cette thèse est d’étudier la toxicité du colorant alimentaire E171 et d’approfondir les connaissances relatives à l’impact des NPs de TiO2 sur le système gastro-intestinal. Pour cela, nous avons travaillé avec différents modèles cellulaires d’épithélia intestinaux humain, un modèle d’épithélium jointif composé d’entérocytes Caco-2, un modèle d’épithélium sécrétant une couche de mucus, composé de cellules Caco-2 et HT29-MTX et enfin un modèle d’épithélium bordant les plaques de Peyer, composé des cellules Caco-2(C1) et RajiB. Ces modèles cellulaires ont été exposés de façon aigüe (6 h, 24 h et 48 h) ou chronique (21 jours), au colorant E171 ainsi qu’à deux NPs de TiO2 : A12, qui a la même structure cristalline que le E171 et P25, une NP très documentée dans la littérature. Nos résultats montrent que le E171 et les NPs de TiO2 sont modérément toxiques, ils n’engendrent pas de mortalité cellulaire ni de dommages à L’ADN. Néanmoins, ils provoquent une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène intracellulaires et modulent certains marqueurs impliqués dans le stress oxydant, le stress du réticulum endoplasmique et l’inflammation. Ils impactent également la sécrétion et la composition de la couche de mucus, l’expression des transporteurs ABC, qui sont des paramètres impliqués dans la fonction de barrière de l’épithélium intestinal, le rendant possiblement plus vulnérable aux agressions extérieures. / Micro-sized titanium dioxide (TiO2) particles are used for years by industrials for their attractive physical and chemical properties. The use of TiO2 nanoparticles (NPs) is also constantly increasing, because the nanometric size gives new interesting properties to particles which industrials are looking for. In some daily-life products including paints, plastics, paper, medicines and food, micro-sized TiO2 particles are used as a pigment for their opacifying and whitening capacities. The use of TiO2 as a food additive, i.e. E171 in the EU, has been authorized in most countries since the 60ies, without any established acceptable daily intake, because of their low toxicity and intestinal absorption. However, it was recently shown that E171 can contain up to 43% of particles with diameter ranging from 1 to 100 nm, i.e. NPs. Still, E171 is not a nanomaterial as described in the European recommendation of definition because it contains less than 50% of NPs (in number). Food grade TiO2 is present in a wide range of food products while little is known about its toxicological impact to human health. The toxicity of ingested TiO2, either nano- or micro-sized, is increasingly documented, still E171 itself is rarely used in these studies.According to in vivo and in vitro studies, TiO2 particles were proven relatively safe for intestinal cells, no cytotoxicity neither genotoxicity were reported. Nevertheless, particles were often reported to increase reactive oxygen species (ROS) cell content, to impair autophagic processes and modulate gene expression and the content of proteins involved in oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and inflammatory response regulation. Interestingly, their reported impact on intestinal cells suggests alteration of almost all the components of the intestinal barrier function, i.e. microbiota, mucus, cell junctions and transporters. This intestinal barrier function is altered in patients suffering from intestinal bowel diseases, these persons are thus possibly more sensitive to mineral particulate in food.The present study aimed at improving knowledge on the toxicity of food-grade TiO2. To this purpose, the impact of E171 was evaluated on in vitro cell models representative of the human intestinal epithelium, i.e. a model of differentiated Caco-2 enterocytes, a model of mucus-secreting epithelium obtained by coculture of Caco-2 and HT29-MTX mucus-secreting cells and a model of the follicle-associated epithelium, which lines Peyer patches, obtained by coculture of Caco-2(C1) and RajiB cells. These cell models were either acutely exposed for 6 h, 24 h and 48 h or chronically exposed for 21 days to E171. In parallel, they were exposed to two model TiO2-NPs, A12 which has the same crystalline structure as E171 and P25, a well-documented TiO2-NPs. Our results show that E171 and TiO2-NPs induced no overt cell mortality but significant oxidative stress, and that they oxidatively damage DNA. They modulate the expression of genes involved in oxidative stress and endoplasmic reticulum stress regulation. They also modulate the expression of genes, as well as the content of proteins from mucus, ABC transporters and inflammatory markers, which are the main players of the intestinal barrier function and presumably increase epithelium sensitivity to xenobiotics. These data suggest that they may be implicated in the development or aggravation of inflammatory bowel diseases.