L'épissage alternatif des ARNs pré-messagers est le mécanisme majeur de diversification de l'information génétique chez les eucaryotes supérieurs. Près de 70% des gènes sont concernés par ce mécanisme. Il arrive malgré tout que l'épissage alternatif soit dérégulé ce qui conduit à des défauts d'épissage qui provoquent des maladies telles que le syndrome progérique de Hutchinson-Gilford (HGPS). Cette maladie se caractérise notamment par une apparition précoce des signes distinctifs de la vieillesse ainsi que de défauts métaboliques majeurs. Mon travail de thèse a consisté à sélectionner et à caractériser des composés chimiques modulateurs de l'épissage alternatif en se basant sur le mécanisme moléculaire conduisant à la progeria. Par la suite, l'efficacité de ces molécules a été testée dans des modèles de souris obèses. Parmi une chimiothèque de plus de 700 molécules chimiques, j'ai pu sélectionner sur différents critères une vingtaine de molécules modulatrices de l'épissage de l'exon 11 du gène LMNA. Une seule molécule a été capable de diminuer la prise de poids de souris mises sous régime hyperlipidique en favorisant la mise à disposition des lipides et en diminuant la différenciation adipocytaire grâce à son action sur les micros ARN. / Alternative splicing of pre-messenger RNA is the major mechanism to increase genetic variability in superior eukaryotes. Almost 70 % of genes are concerned by the mechanism. In some case this tightly regulated process is deregulated leading to splicing defects and diseases like Hutchinson-Gilford Progeroid Syndrome (HGPS). HGPS is characterized by a premature ageing and important metabolism defects.My thesis work was to select and characterized chemical compounds modulating alternative splicing based on molecular mechanism leading to HGPS. We further tested efficiency of these molecules in diet-induced obesity mice.Among a library of 700 compounds, I was able to select twenty molecules modulating splicing event of LMNA gene exon 11. One unique molecule was found to decrease weight gain in a mouse model under high-fat diet condition trough increasing lipolysis and lipids mobilization, and decreasing adipocyte differentiation.

Chez l'homme, l'épissage alternatif (EA) affecte presque tous les gènes permettant de générer de vastes répertoires d'ARN et de protéines. L'épissage est un processus hautement régulé qui s'effectue principalement lorsque l'ARN est en cours de synthèse sur la chromatine. Beaucoup d'études suggèrent que la chromatine et ses marques épigénétiques influencent les décisions d'épissage au locus correspondant. A l'inverse, d'autres données laissent penser que l'épissage peut moduler les marques épigénétiques. Au cours de ma thèse, j'ai étudié différentes voies de couplage entre l'épissage et la chromatine. D'une part, j'ai exploré l'impact de la méthylation de l'ADN sur la régulation de l'épissage. J'ai montré que les enzymes qui méthylent l'ADN ont un effet global sur l'épissage d'exons enrichis en méthylation. Mes données suggèrent que les protéines qui lient la méthylation de l'ADN sont impliquées dans cette régulation. D'autre part, j'ai exploré les conséquences de l'EA sur la régulation de la chromatine en étudiant son impact de deux histones-methyltransferases (HMTase) : G9A et SUV39H2 dont les gènes génèrent des transcrits alternatifs. Tous les transcrits variants codent pour des protéines. La conservation des variants d'épissage de G9A dans des espèces et l'absence de différences dans leur activité HMTase, nous amènent à proposer que l'EA est associé à une fonction non liée aux histones. A l'inverse, les isoformes de SUV39H2 exhibent des activités HMTases différentes et régulent l'expression de gènes cibles différents. Ensemble, nos résultats apportent de nouvelles connexions dans le couplage épissage-chromatine et supporte un modèle où ces derniers s'auto-influencent. / In humans, alternative splicing affects almost all genes in the genome and generates extensive repertoires of RNAs and proteins. Splicing is a highly regulated process which occurs primarily when the RNA is being synthesized on chromatin. Many studies suggest that chromatin and epigenetic marks influence splicing choices to the corresponding locus. Conversely, other data suggest that splicing can modulate epigenetic marks. During my thesis, I studied different ways of crosstalk between splicing and chromatin. First, I investigated the effect of DNA methylation on splicing regulation. I have shown that the enzymes that methylate DNA have an overall effect on the splicing of exons with enriched methylation. My data suggest that proteins which bind to methylated DNA are involved in this regulation. On the other hand, I explored the impact of alternative splicing on chromatin regulation studying its impact on the expression and activity of both histone methyltransferases (HMTase): SUV39H2 and G9A. G9A and SUV39H2 generate variants transcripts whose expression is regulated according to tissues. All variants transcripts encode proteins. Conservation of G9A splice variants in species and no differences in their HMTase activity, lead us to propose that G9A alternative splicing is associated with a non-histone function. Conversely, SUV39H2 isoforms exhibit different HMTases activities, and regulate the expression of different target genes. All our results provide new connections in chromatin - splicing coupling and support a model in which they harbor self-influence.

L'inactivation du chromosome X correspond au silence transcriptionnel de l'un des deux chromosomes X dans les cellules des mammifères femelles. Il s'agit d'un mécanisme de compensation du dosage du chromosome X qui assure un taux d'expression des gènes liés aux chromosomes X équivalent entre organismes mâles (XY) et femelles (XX). Elle débute par une accumulation de l'ARN Xist (X inactive specific transcript) sur le chromosome X qui sera inactivé (Xi). Elle est suivie très rapidement par des modifications des histones qui assurent l'établissement, le maintien et la transmission de l'état transcriptionnel inactif de la chromatine. L'ARN Xist comprend plusieurs régions d'éléments répétés et notamment la région des A-repeats, essentielle pour la mise en place de l'inactivation. Mes recherches se sont portées sur l'étude de cette région singulière : sa structure et ses interactions protéiques. La technique de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) appliquée à l'ARN nous a permis de confirmer la structure de cette région parmi 3 modèles possibles. Elle se structure en deux tiges-boucles formée par l'appariement 2 à 2 de 4 répétitions successives. Dans une seconde partie, j'ai caractérisé l'interaction de cette région avec certains de ses partenaires protéiques in vitro. La région des A-repeats interagit notamment de manière directe avec les protéines PTB, KSRP et ASF/SF2. Les 2 premières protéines pourraient avoir un rôle dans la stabilité de l'ARN tandis qu'ASF/SF2 serait impliquée dans la maturation de l'ARN X / X-chromosome inactivation is the transcriptional silencing of one of the two X chromosomes in female mammal cells. This mechanism of dosage compensation ensures an equal level of the X-linked genes expression between males (XY) and females (XX). It initiates with the accumulation of the Xist RNA (X inactive specific transcript) on the futur inactive X chromosome (Xi). It is followed by the apposition of epigenetic marks such as histone modifications, that ensure establishment, maintenance and transmission of the inactive state of the chromatin. Xist RNA comprises a number of repeated regions and, in particular to its 5' end the A region, absolutely necessary for the establishment of the X-inactivation. My research was focused on the study of this singular region: its structure and its protein interactions. The FRET method (Fluorescence Resonance Energy Transfer) applied to RNA allowed us to ascertain that the RNA is structured in two long stem-loop structures each including four repeats. In a second part, I characterized the in vitro interaction of this region with some of its protein partners. The A region interacts directly with PTB, KSRP and ASF/SF2 proteins. The first two proteins may have a role in RNA stability whereas ASF/SF2 could be involved in the splicing process

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité / Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors

Il a été démontré au sein du laboratoire du Pr Tazi que les isoformes du gène LMNA issu d’un épissage alternatif jouent des rôles opposés sur le métabolisme lipidique et énergétique (Lopez-Mejia et al., 2014). Ces travaux suggèrent que la modulation pharmacologique de cet épissage pourrait représenter une approche nouvelle et originale dans le traitement de l’obésité. Cette hypothèse a été testée dans les travaux ici présentés en utilisant 2 systèmes de criblage complémentaires, et ceci afin d’identifier un potentiel modulateur de l’épissage présentant un impact sur le métabolisme énergétique. Un composé appelé ABX300 a ainsi été sélectionné pour être testé sur deux modèles murins d’obésité, un modèle de souris génétiquement modifié et un modèle nutritionnel. Son administration journalière a conduit à une perte de poids chez ces animaux. La modulation spécifique de l’épissage du gène LMNA par ABX300 a quant à elle été confirmée à l’aide d’un système rapporteur d’épissage. Les données générées montrent qu’ABX300 interagit directement avec SRSF1 avec pour conséquence son effet sur l’épissage de LMNA. Le travail de thèse ici présenté a consisté à déterminer le mécanisme d’action de la molécule ABX300, ainsi que son impact sur le métabolisme. Les résultats ont montré qu’ABX300 n’a pas d’effet ni sur la différenciation adipocytaire, ni sur le contenu en triglycérides au sein de lignées cellulaires (cellules 3T3-L1 et préadipocytes de tissu adipeux brun). Cependant, des analyses in vivo de « pair-feeding », des analyses PET-scan, et des études en cages métaboliques, ont montré une différence entre les groupes traités et non-traités au niveau de leur prise alimentaire, la consommation d'oxygène et la source énergétique utilisée. Parallèlement une série d'approches transcriptomiques ont permis de mettre en évidence une importante modulation par ABX300 de microRNA dont les cibles sont mitochondriales, et ceci en absence d’une restructuration globale du profil d'épissage.Ces travaux montrent que l’identification de modulateurs de l'épissage alternatif du gène LMNA est une stratégie innovante et prometteuse pour la découverte de molécules bioactives dans le traitement de l’obésité. / The discovery within our laboratory that the different LMNA isoforms play opposite roles on metabolism (Lopez-Mejia et al., 2014), led to the proposal that pharmacologically modulating this splicing could be a novel and original approach for the treatment of obesity. In this thesis I have challenged this proposal by performing two complementary screens in order to identify potential modulators of splicing with impact on energy metabolism. Following this initial screen, a compound termed ABX300 was selected and tested on animal models of obesity. Specific modulation of the LMNA splicing by ABX300 was confirmed using splicing reporters. Our data show that ABX300 interacts directly with SRSF1 to mediate its effect on LMNA splicing.The daily treatment with ABX300 lead to a weight loss in both, genetically modified mouse models and diet induced obesity mouse models. During my PhD I have established the mode of action of ABX300, along with its impacts on metabolism. Results demonstrated that ABX300 did not have an effect on adipocytes differentiation, nor in triglycerides content on in vitro cell lines (3T3-L1 and BAT preadipocytes). However, in vivo analysis, by means of pair-feeding experiments, PET-scan analysis, and metabolic chambers, among others, exhibited differences in between treated and untreated groups regarding food intake, oxygen consumption and fuel source. Concurrently, a series of transcriptomic approaches showed that ABX300 modulates the expression of miR whose targets encode proteins involved in mitochondrial functioning, but did not have an effect on global pre mRNA splicing. This work validates the screening for modulators of the LMNA alternative splicing as a promising strategy for the identification of bio-active small molecules and therefore promotes a complementary approach in the treatment of obesity.

Le syndrome de Usher (USH) est une maladie transmise selon le mode autosomique récessif caractérisée par l’association d’une surdité congénitale (HL) et d’une rétinite pigmentaire (RP), et dans certains cas, d’une aréflexie vestibulaire. Une hétérogénéité clinique et génétique est reconnue. Environ 10 % des cas USH restent non résolus après analyse moléculaire exhaustive des différents gènes. Ces cas incluent les patients qui ne portent aucune mutation dans un des gènes USH connus ainsi que les patients porteurs d’une seule mutation dans un gène USH. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’étude des patients porteurs d’une seule mutation dans les gènes USH2A et PCDH15.Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé une cohorte de patients avec un phénotype USH2A bien défini : 5 patients pour lesquels une seule mutation à l’état hétérozygote avait été identifiée dans le gène USH2A et un patient porteur d’un variant silencieux en trans d’une mutation non-sens.Pour les 5 patients, nous avons émis l’hypothèse que la seconde mutation, restant à être identifiée, pourrait se trouver dans des régions introniques profondes. Pour cela, nous avons développé une approche de séquençage à haut débit (NGS) de l’ADN pour identifier les variants introniques profonds dans le gène USH2A et évaluer leurs conséquences sur l’épissage. Comme preuve de concept et pour valider l’approche, y compris le pipeline bio-informatique et l’évaluation des outils de prédiction de l’épissage, nous avons analysé un patient porteur d’un pseudoexon (PE) connu dans le gène USH2A. Ensuite, les 5 patients ont été étudiés en utilisant le pipeline défini, ce qui a conduit à l’identification de 3 nouveaux variants introniques profonds chez 4 d’entre eux. Tous les variants ont été prédits comme pouvant avoir un impact sur l’épissage et aboutir à l’insertion de PE. Ces prédictions ont été validées par les essais minigènes. Grâce à cette étude, nous présentons une stratégie innovante pour identifier les mutations introniques profondes, lorsque l’analyse des transcrits n’est pas possible. Par ailleurs, le pipeline bio-informatique développé fonctionne indépendamment de la taille du gène analysé, ce qui permet l’application possible de cette approche à n’importe quel gène. Par ailleurs, un oligonucléotide antisens de type morpholino (AMO) a été évalué in vitro afin de rétablir l’altération d’épissage induite par une des mutations identifiées. Les résultats ont montré un taux d’exclusion élevé du transcrit aberrant et suggèrent une application possible en thérapie moléculaire. Nous avons ensuite effectué des études sur le variant USH2A c.1377T>A, un variant silencieux afin d’évaluer son effet sur l’épissage. L’analyse de l’ARN issu de cellules nasales du patient a montré que ce variant conduit au saut de l’exon 8 dans les transcrits USH2A. Ceci a été confirmé par un essai minigène. En outre, des études préliminaires ont été réalisées en utilisant des outils de prédictions et des essais minigènes pour évaluer l’implication des éléments cis-régulateurs dans le défaut d’épissage observé chez le patient. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons analysé une patiente USH1, pour laquelle une seule mutation avait été identifiée dans le gène PCDH15. Dans ce cas, nous avons combiné la culture des cellules épithéliales nasales avec l’analyse des transcrits PCDH15. Celle-ci a été réalisée par séquençage de cinq RT-PCR chevauchantes. Grâce à cette analyse, nous avons réussi à délimiter une région d’intérêt dans le transcrit, dont l’amplification a échoué exclusivement pour l’allèle porteur de la mutation non identifiée. D’autres analyses ont été effectuées dans la région génomique correspondante par capture ciblée couplée au séquençage NGS et LongRange PCR suivi de séquençage Sanger. Cependant, aucun variant candidat n’a été identifié à ce jour. Nous suggérons l’implication de mécanismes moléculaires complexes qui restent à être caractérisés. / Usher syndrome (USH) is an autosomal recessive disorder characterized by the association of sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP), and in some cases, vestibular areflexia. Clinical and genetic heterogeneity are recognised. Indeed, three clinical types can be caused by mutations in one of the 10 known genes and USH2A represents the most frequently involved gene.Approximately 10 % of the USH cases remain genetically unsolved after extensive molecular analysis of the different genes, which includes sequencing of the exons and their intronic boundaries, combined to large rearrangements screening by array CGH. These unsolved cases include patients who do not carry any mutation in any of the known USH genes and patients who carry a single USH mutation. During this thesis we focalised on the study of patients carrying a single mutation in USH2A and PCDH15 gene.First, we have analysed a cohort of well-defined USH2A patients: five patients, for whom a single USH2A heterozygous mutation had been identified and one patient carrying a silent variant in trans to a nonsense mutation. For the 5 patients, we supposed that the second mutation remaining to be found could be localised deep in the introns. Indeed, a deep intronic mutation resulting in the inclusion of a pseudoexon (PE 40) in USH2A transcripts had been identified, following RNA analysis from nasal cells. Unfortunately, analysing USH2A transcripts still represent a challenging approach in a diagnostic settings and it is not always possible. To circumvent this issue, we have developed a DNA-Next Generation Sequencing (NGS) approach to identify deep intronic variants in USH2A and evaluate their consequences on splicing. As a proof of concept and to validate this approach, including the bioinformatics pipeline and the assessment of splicing predictor tools, the patient carrying the PE 40 was analysed at first. Then, the 5 patients were studied using the defined pipeline, which led to the identification of 3 distinct novel deep intronic variants in 4 of them. All were predicted to affect splicing and resulted in the insertion of PEs, as shown by minigene assays. Through this study, we present a new and attractive strategy to identify deep intronic mutations, when RNA analyses are not possible. In addition, the bioinformatics pipeline developed is independent of the gene size, implying the possible application of this approach to any disease-linked gene. Moreover, an antisense morpholino oligonucleotide (AMO) tested in vitro for its ability to restore the splicing alterations caused by one of the identified mutation provided high inhibition rates. These results are indicative of a potential application for molecular therapy.In the second case, we have performed studies on the USH2A c.1377T>A silent variant to investigate its effect on splicing. Analysis of RNA from nasal cells of patients showed that this variant led to the skipping of exon 8 in USH2A transcripts. This was confirmed by minigene assay. Moreover, preliminary studies have been performed using prediction tools and minigene assays to assess the involvement of cis-acting elements in causing the aberrant splicing.In the second part of the thesis, we have analysed an USH1 patient, for whom only one mutation had been identified in the PCDH15 gene. In this case, we combined nasal epithelial cells culture with the analysis of the PCDH15 transcripts. This was performed by sequencing five overlapping RT-PCRs. Through this analysis, we were able to delimit a region within the transcript, which failed to be amplified exclusively in the allele carrying the unidentified mutation. Further analyses have been performed in the corresponding genomic region by NGS-target capture and LongRange PCR associated with Sanger sequencing. However, no evident mutation has been identified so far. Therefore, we suggest the involvement of complex molecular mechanisms that remain to be characterised.

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative dont la physiopathologie fait intervenir des causes génétiques qui contribuent non seulement aux formes familiales mais aussi au développement des formes sporadiques, les plus fréquentes, en interagissant sans doute alors avec des facteurs environnementaux. La découverte des déterminants génétiques a permis d’identifier plusieurs mécanismes moléculaires contribuant au développement de la maladie. Ils en ont démontré le caractère complexe. Pour mieux comprendre l’étendue des perturbations moléculaires liées à la maladie, nous avons entrepris des analyses globales du transcriptome par le biais de puces ou de séquençage des ARNs (RNAseq) à partir de cellules mononuclées périphériques sanguines de patients présentant des formes génétiques et sporadiques de la maladie ainsi que de sujets sains.Nous avons identifiés la dérégulation de nombreux gènes dans les cellules mononuclées périphériques sanguines de sujets porteurs de la mutation G2019S de LRRK2 et de sujets sporadiques par rapport à des sujets sains appariés. L’analyse des voies et des processus cellulaires associés à ces gènes met en exergue une altération de la voie de signalisation EIF2 commune aux sujets porteurs de la mutation G2019S de LRRK2 et aux sujets sporadiques. Cette voie fait écho à la régulation de la traduction et de l’épissage, deux processus faisant partie du métabolisme des ARNs. Ces altérations sont retrouvées dans les cellules mononuclées périphériques sanguines de sujets parkinsoniens porteurs de mutations du gène ATXN2, essentiellement connu pour son rôle dans la stabilité, l’épissage et la traduction des ARNm. Cette perturbation des ARNs semble être une altération commune à l’ensemble des formes de maladie de Parkinson étudiées et pourrait donc être un mécanisme sous-tendant la maladie.Les résultats du séquençage des ARNs obtenus chez des parkinsoniens présentant une forme sporadique ou porteurs de mutations délétères ainsi que chez des sujets sains corroborent cette hypothèse en montrant d’une part des différences quantitatives et qualitatives de variants d’épissage au sein d’ARNm eux-mêmes impliqués dans le métabolisme des ARNs et d’autres part des variations de l’épissage de gènes impliqués dans des mécanismes moléculaires connus de la maladie.Ainsi, nos données s’inscrivent dans la dynamique physiopathologique actuelle qui fait état de nombreuses perturbations du métabolisme des ARNs dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie de Parkinson, ces défauts impliqueraient des variations quantitatives et qualitatives de variants d’épissage au sein de gènes liés à l’épissage mais aussi dans des mécanismes connus pour contribuer à la maladie. Une analyse approfondie de ces dérèglements devraient permettre de déterminer leur spécificité et d’évaluer leur potentiel en tant que marqueurs de la maladie et cibles thérapeutiques. / Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder with genetic determinants not only contributing to rare familial forms of the disease but also involved in prevalent sporadic forms by interacting with environmental factors. Thanks to the identification of these determinants, several molecular mechanisms contributing to the disease have been found highlighting also its complexity. In order to better understand the molecular perturbations underlying the disease, we performed whole transcriptome analyses using microarrays and RNA sequencing (RNAseq) from peripheral blood mononuclear cells of Parkinson’s disease patients with genetic and sporadic forms of the disease as well as healthy controls.We identified several dysregulated genes in the cells of Parkinson’s disease patients with a G2019S LRRK2 mutation and sporadic patients compared to healthy controls. Pathways and cellular processes related to those genes mainly display disturbances of EIF2 signaling common to G2019S LRRK2 mutation carriers and sporadic patients. These data pinpoint potential perturbations of translation and RNA splicing both related to RNA metabolism. Involvement of RNA metabolism is also observed in peripheral blood mononuclear cells of Parkinson’s disease patients carrying mutations of ATXN2 gene encoding for ataxin-2 protein. It is mainly known as a regulator of the stability, the splicing and the translation of mRNA. Such RNA-mediated perturbations seem to be a common to all forms of Parkinson’s disease and might be a physiological mechanism of the disease. RNAseq data from Parkinson’s disease patients having or not deleterious mutations are in agreement with this hypothesis showing quantitative and qualitative discrepancies of splicing variants inside genes involved in RNA metabolism but also in known molecular pathways of the disease.As a conclusion, our results support the current view of RNA metabolism association with neurodegenerative disorders. In Parkinson’s disease, those alterations could involve quantitative and qualitative variations of splicing variants inside genes involved in RNA metabolism but also in known perturbed molecular pathways of the disease. Further analyses of these dysregulations should be helpful to determine their specificity and evaluate their potential as biomarkers and therapeutic targets.

La protéine E2F-1 est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la prolifération cellulaire en stimulant le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire et est aussi capable d'induire l'apoptose. Ayant préalablement décrit son profil d'expression différentielle dans les tumeurs bronchiques, nous avons étudié son rôle potentiel dans ces tumeurs.<br>L'épissage alternatif des pré-ARNm joue un rôle important dans la régulation de l'apoptose et les protéines de la famille SR sont des régulateurs principaux des événements de l'épissage alternatif et constitutif. Actuellement très peu de données existent concernant leurs activateurs en amont ainsi que leurs gènes cibles impliqués au cours du processus apoptotique. Dans ce travail, nous avons identifié la protéine SC35, un membre de la famille des protéines SR, comme une cible transcriptionnelle directe de E2F1. Nous avons montré que les deux protéines interagissent et coopèrent pour induire l'apoptose, notamment en réponse aux agents génotoxiques, en modifiant les patrons d'épissage de certains gènes apoptotiques dont Bcl-x, ou caspase-9, en faveur des transcrits codant pour les isoformes pro-apoptotiques. Ces résultats démontrent la capacité de E2F1 à réguler les profils d'épissage de transcrits contrôlant l'apoptose via la protéine SC35. Finalement, nous avons obtenu des résultats impliquant SC35 dans le contrôle des fonctions transactivatrices de E2F1 au niveau de gènes contrôlant la division cellulaire, et notamment la synthèse d'ADN. La protéine VEGF-A existe sous la forme de multiples isoformes protéiques résultant de l'épissage alternatif de son ARNm pré-messager et dénommées de façon générique VEGFxxx (formes pro-angiogéniques) et VEGFxxxb (formes anti-angiogéniques). L'expression des différentes isoformes de VEGF-A est fortement dérégulée dans les tumeurs. Dans un deuxième axe de ce travail, nous avons montré que E2F1 réprime l'activité du promoteur du VEGF-A dans nos lignées dépourvues de p53 fonctionnelle et dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons montré que E2F1 n'affecte pas négativement le niveau d'expression des isoformes VEGFxxxb suggérant que E2F1 stimule l'inclusion de l'exon 8b du VEGF-A par un mécanisme restant à identifier. Nos résultats montrent qu'E2F1 affecte la balance des isoformes du VEGFA en faveur de ses formes anti-angiogeniques et suggèrent que le facteur d'épissage SC35 contribue à ces effets. Nos travaux ouvrent des perspectives quand aux conséquences biologiques de la dérégulation de l'expression de E2F1 dans les cancers bronchiques via une modification des facteurs d'épissage et un rôle de E2F1 dans le processus de néoangiogénèse.

L'épissage alternatif des ARNs pré-messagers est le mécanisme majeur de diversification de l'information génétique chez les eucaryotes supérieurs. Près de 70% des gènes sont concernés par ce mécanisme. Au cours de la différenciation érythroïde, l'inclusion de l'exon 16 du pré-messager 4.1R représente un événement majeur pour la fonction érythrocytaire normale de la protéine 4.1R. Cet événement d'épissage est bloqué dans les cellules MEL surexprimant l'oncoprotéine Spi.1/PU.1. Mon travail de thèse avait pour but de comprendre ce mécanisme de blocage en étudiant le rôle de la voie de signalisation de la PI3K en relation avec la phosphorylation de Spi.1/PU.1 d'une part, et celle des facteurs d'épissage de la famille des protéines SR d'autre part. J'ai montré que l'inhibition de la PI3K active la production d'hémoglobine ainsi que l'épissage de l'exon 16 4.1R. Ensuite j'ai montré que la phosphorylation de Spi-1/PU.1 par la PI3K est nécessaire pour son activité d'inhibition de la différenciation et de l'épissage de l'exon 16 4.1R. Enfin, j'ai montré que le facteur d'épissage Srp40 de la famille des protéines SR est un activateur stade spécifique de l'inclusion de l'exon 16. La surexpression de Srp40 dans les cellules MEL active l'inclusion de l'exon 16 indépendamment de la différenciation.

Le facteur de transcription Microphthalmia (Mitf) et la voie de signalisation des " Mitotic Activated Protein Kinase " (MAPK) sont des éléments déterminants pour la différentiation, la prolifération et la survie des melanocytes. L'altération des fonctions de l'un ou l'autre se manifeste par une perte totale ou partielle de ce type cellulaire. A l'inverse, le mélanome est associé très majoritairement à une activation constitutive des MAPK, et parfois, à un gain d'activité de MITF. Afin d'étudier les interaction entre les MAPK et l'activité de MITF, nous nous sommes intéressés aux modifications post transcriptionnelles qui permettent la génération d'isoformes multiples dotées d'activité différentes. MITF contient un site de phosphorylation, la serine 73 (S73), qui a été démontré par le passé comme jouant un rôle à la fois dans l'augmentation de l'activité et dans la réduction de la stabilité de MITF in vitro. Pour comprendre le rôle de cette serine in vivo, une tentative de mutation S73A de Mitf a été réalisée. Ce codon fait parti d'un " Exon splicing Enhencer " et sa mutation réduit l'affinité de fixation de la protéine SRp40 et l'exclusion de l'exon 2B dans lequel est situé ce site de phosphorylation. Pour dissocier l'exclusion de l'exon 2B et de sa phosphorylation, nous avons donc altéré la jonction de l'exon 2A-2B afin qu'elle ne soit plus reconnue par le spliceosome. En conséquence, l'exon 2B ne peut plus être exclu des transcrits Mitf quelque soit le statut du codon 73. La comparaison de 3 nouveaux allèles Mitf S-S73A S-S73D et S-S73S, où l'inclusion de l'exon 2B est forcée, nous a permis d'associer l'absence de phosphorylation à un gain d'activité de MITF.