En la actualidad, la enfermedad cerebro vascular (ECV) o accidente cerebro vascular (ACV) es considerada una epidemia que afecta a las personas de la tercera edad. Algunos estudios afirman que la elevación del ácido úrico es un factor protector en la evolución, así como, en la recuperación neurológica del ECV agudo. Sin embargo, existen otros donde no se establece una clara relación entre su concentración y la mejoría clínica en el ECV. Objetivo: determinar si existe correlación entre el nivel de ácido úrico sérico y la recuperación neurológica con el resultado de la escala de National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) en pacientes con enfermedad cerebro vascular isquémico en un hospital de Lambayeque, Enero - Mayo, 2016. Pacientes y Métodos: la población estuvo conformada por todos los pacientes del servicio de neurología ingresados por emergencia entre los meses de Enero a Mayo del 2016. Se empleó un muestreo no probabilístico consecutivo; la muestra fue de 85 pacientes con enfermedad cerebrovascular isquémico. Se aplicó la escala NIHSS y la toma de ácido úrico sérico al ingreso del paciente y al alta (día 10 de hospitalización). Resultados: a menor nivel de ácido úrico al ingreso, se presenta menor déficit neurológico al egreso, y a mayor nivel de ácido úrico al ingreso, la condición neurológica es más desfavorable al egreso. En los pacientes con disminución del nivel de ácido úrico, la posibilidad de mejoría se incrementó 2.87 veces en relación a los que presentaron un aumento del ácido úrico.

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

A nefropatia diabética (ND) é uma das complicações microvasculares do diabetes e consiste no dano ao parênquima renal por consequência de uma série de fatores hemodinâmicos e moleculares. A ocorrência de ND e de outras complicações mesmo em indivíduos sob adequado controle glicêmico tem sido associada a um fenômeno conhecido como memória metabólica. Neste trabalho foram investigadas vias bioquímicas e moleculares persistentemente alteradas no rim de animais diabéticos tratados após um período inicial de hiperglicemia, com o propósito de entender os mecanismos envolvidos na memória metabólica. Para tanto, ratos com diabetes induzida por estreptozotocina foram mantidos hiperglicêmicos durante 4 semanas (período curto) ou 12 semanas (período longo) e posteriormente tratados com insulina isoladamente ou combinada com metformina (100mg/kg/dia) durante as 4 (período curto) ou 12 (período longo) semanas seguintes. Todos os animais tratados tiveram os seus níveis glicêmicos e função renal normalizados. Os tratamentos também foram capazes de normalizar os níveis elevados de malonaldeído no rim, bem como a excreção aumentada dos adutos de DNA 8-oxo-2\'-desoxiguanosina (8-oxodG) e N2-carboxietil-2\'- desoxiguanosina (CEdG) na urina observados nos animais diabéticos. Níveis aumentados de 8-oxodG foram detectados em DNA mitocondrial (mtDNA), mas não em DNA nuclear, de animais diabéticos apenas no período curto de estudo e também foram normalizados após o controle glicêmico. Nós identificamos uma via gradualmente alterada durante o curso do diabetes que permanece persistentemente alterada após o controle glicêmico tardio. Essa via compreende um declínio precoce do clearance de ácido úrico e expressão da pAMPK, seguida pelo acúmulo de fumarato, expressão aumentada de TGF-β, expressão reduzida de PGC-1α e redução da metilação e hidroximetilação do mtDNA. A redução persistente do clearance de ácido úrico em animais diabéticos tratados pode sustentar as alterações bioquímicas renais prolongadas observadas após o controle glicêmico, e essa regulação é provavelmente mediada pela redução sustentada da expressão de pAMPK e pela indução de inflamação. Este trabalho propõe a primeira consideração do possível papel da hiperuricemia e das alterações bioquímicas subjacentes como parte da memória metabólica na nefropatia diabética. / Diabetic nephropathy is one of the diabetes microvascular complications, and it consists on the damage to the renal parenchyma due to several hemodynamic and molecular factors. The occurrence of diabetic nephropathy and other complications even in those individuals under tight glycemic control has been associated to a phenomenon known as metabolic memory. Here we investigated biochemical and molecular pathways persistently altered in the kidney of diabetic animals treated after a previous period of hyperglycemia, aiming to understand underlying mechanisms in metabolic memory. Streptozotocin-induced diabetic rats were maintained hyperglycemic during 4 (short period) or 12 weeks (long period), and then they were treated with insulin alone or combined with metformin (100 mg/kg/day) for the following 4 or 12 weeks, respectively. All the treated animals had them glycemic levels and renal function normalized. The treatments were also able to control enhanced kidney malondialdehyde levels, as well as the increased urine excretion of the DNA adducts 8-oxo-2\'- deoxyguanosine (8-oxodG) and N2-carboxyethyl-2\'-deoxyguanosine seen in diabetic animals. Increased levels of 8-oxodG were detected in mitochondrial DNA, but not in nuclear DNA of diabetic animals in the short period, and were also recovered after glycemic control. We have identified a kidney pathway that is gradually altered during the course of diabetes and remains persistently changed after late glycemic control. This pathway comprises an early decline of uric acid clearance and pAMPK expression followed by fumarate accumulation, increased TGF-β expression, reduced PGC-1α expression, and downregulation of methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA. The sustained decrease of uric acid clearance in treated diabetes may support the prolonged kidney biochemical alterations observed after tight glycemic control, and this regulation is likely mediated by the sustained decrease of AMPK activity and the induction of inflammation. This work proposes the first consideration of the possible role of hyperuricemia and the underlying biochemical changes as part of metabolic memory in diabetic nephropathy.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

A nefropatia diabética (ND) é uma das complicações microvasculares do diabetes e consiste no dano ao parênquima renal por consequência de uma série de fatores hemodinâmicos e moleculares. A ocorrência de ND e de outras complicações mesmo em indivíduos sob adequado controle glicêmico tem sido associada a um fenômeno conhecido como memória metabólica. Neste trabalho foram investigadas vias bioquímicas e moleculares persistentemente alteradas no rim de animais diabéticos tratados após um período inicial de hiperglicemia, com o propósito de entender os mecanismos envolvidos na memória metabólica. Para tanto, ratos com diabetes induzida por estreptozotocina foram mantidos hiperglicêmicos durante 4 semanas (período curto) ou 12 semanas (período longo) e posteriormente tratados com insulina isoladamente ou combinada com metformina (100mg/kg/dia) durante as 4 (período curto) ou 12 (período longo) semanas seguintes. Todos os animais tratados tiveram os seus níveis glicêmicos e função renal normalizados. Os tratamentos também foram capazes de normalizar os níveis elevados de malonaldeído no rim, bem como a excreção aumentada dos adutos de DNA 8-oxo-2\'-desoxiguanosina (8-oxodG) e N2-carboxietil-2\'- desoxiguanosina (CEdG) na urina observados nos animais diabéticos. Níveis aumentados de 8-oxodG foram detectados em DNA mitocondrial (mtDNA), mas não em DNA nuclear, de animais diabéticos apenas no período curto de estudo e também foram normalizados após o controle glicêmico. Nós identificamos uma via gradualmente alterada durante o curso do diabetes que permanece persistentemente alterada após o controle glicêmico tardio. Essa via compreende um declínio precoce do clearance de ácido úrico e expressão da pAMPK, seguida pelo acúmulo de fumarato, expressão aumentada de TGF-β, expressão reduzida de PGC-1α e redução da metilação e hidroximetilação do mtDNA. A redução persistente do clearance de ácido úrico em animais diabéticos tratados pode sustentar as alterações bioquímicas renais prolongadas observadas após o controle glicêmico, e essa regulação é provavelmente mediada pela redução sustentada da expressão de pAMPK e pela indução de inflamação. Este trabalho propõe a primeira consideração do possível papel da hiperuricemia e das alterações bioquímicas subjacentes como parte da memória metabólica na nefropatia diabética. / Diabetic nephropathy is one of the diabetes microvascular complications, and it consists on the damage to the renal parenchyma due to several hemodynamic and molecular factors. The occurrence of diabetic nephropathy and other complications even in those individuals under tight glycemic control has been associated to a phenomenon known as metabolic memory. Here we investigated biochemical and molecular pathways persistently altered in the kidney of diabetic animals treated after a previous period of hyperglycemia, aiming to understand underlying mechanisms in metabolic memory. Streptozotocin-induced diabetic rats were maintained hyperglycemic during 4 (short period) or 12 weeks (long period), and then they were treated with insulin alone or combined with metformin (100 mg/kg/day) for the following 4 or 12 weeks, respectively. All the treated animals had them glycemic levels and renal function normalized. The treatments were also able to control enhanced kidney malondialdehyde levels, as well as the increased urine excretion of the DNA adducts 8-oxo-2\'- deoxyguanosine (8-oxodG) and N2-carboxyethyl-2\'-deoxyguanosine seen in diabetic animals. Increased levels of 8-oxodG were detected in mitochondrial DNA, but not in nuclear DNA of diabetic animals in the short period, and were also recovered after glycemic control. We have identified a kidney pathway that is gradually altered during the course of diabetes and remains persistently changed after late glycemic control. This pathway comprises an early decline of uric acid clearance and pAMPK expression followed by fumarate accumulation, increased TGF-β expression, reduced PGC-1α expression, and downregulation of methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA. The sustained decrease of uric acid clearance in treated diabetes may support the prolonged kidney biochemical alterations observed after tight glycemic control, and this regulation is likely mediated by the sustained decrease of AMPK activity and the induction of inflammation. This work proposes the first consideration of the possible role of hyperuricemia and the underlying biochemical changes as part of metabolic memory in diabetic nephropathy.

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The concentration of serum uric acid in the human body considered normal is between 0.24 - 0.52 mmol.L-1 . High levels of uric acid in the body lead to a condition known as hyperuricemia. Therefore, the monitoring of uric acid in the body is of great importance. In this work we present amperometric biosensors based on the association of the enzyme UOx with platinum nanoparticles to detect uric acid. The technique used to assemble the films that compose the biosensor was the Layer-by-Layer (LbL). Two techniques were used for the synthesis of nanoparticles for the construction of two different film architectures. In the first architecture, the nanoparticles were deposited in situ on a polyethyleneimine (PEI) and sodium polyvinyl sulfate (PVS) film - by reducing hexachloroplatinic acid hexahydrate with sodium borohydride. The bilayers composed of (PEI/UOx)n were deposited on a film containing platinum nanoparticles deposited in situ. In the second architecture, the nanoparticles were synthesized by mixing PEI solution with hexachloroplatinic acid solution and sodium borohydride solution. This solution was deposited alternating with enzymatic solution. The amperometric analyses were performed at +0.347 V potential, with successive additions of 2 mmol.L-1 of uric acid in an electrochemical cell containing phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4. For the first architecture, the limit of detection found by the amperometric method was 5.17 µmol.L-1 with the linear detection range comprised in the range between 3.92 - 11.3 µmol.L-1 . For the second architecture, the limit of detection found by the amperometric method was 4.68 µmol.L-1 with a linear detection range between 14.18 - 55.56 µmol.L-1 . For the same architecture an using the differential pulse voltammetry method the values of limit of detection and linear detection range were 0.11 µmol.L-1 and particles / mL, respectively. The biosensors presented limits of detection close to the values found in the literature for other biosensor proving to be efficient for the detection of uric acid. / O ácido úrico é uma substância endógena produzida a partir do metabolismo das purinas. A concentração de ácido úrico sérico no organismo humano considerado normal é entre 0,24 - 0,52 mmol.L-1 . Altos níveis de ácido úrico no organismo levam a um quadro conhecido como hiperuricemia. Portanto, o monitoramento de ácido úrico no organismo é de grande importância. Neste trabalho apresentamos biossensores amperométricos baseados na associação da enzima UOx com nanopartículas de platina para detecção de ácido úrico. A técnica utilizada para a fabricação dos filmes que compõem o biossensor foi a Layer-by-Layer (LbL). Duas técnicas foram utilizadas para a síntese de nanopartículas para a construção de duas arquiteturas diferentes na construção dos filmes. Na primeira arquitetura, as nanopartículas foram depositadas in situ sobre um colchão de polieletrólitos – polietilenoimina (PEI) e polivinil sulfato de sódio (PVS) – pela redução do ácido hexacloroplatínico hexaidratado com boroidreto de sódio. As bicamadas compostas por (PEI/UOx)n foram depositadas sobre colchão contendo nanopartículas de platina depositadas in situ. Na segunda arquitetura, as nanopartículas foram sintetizadas misturando-se solução de PEI com solução de ácido hexacloroplatínico e solução de borohidreto de sódio. Esta solução foi depositada alternando-se com solução enzimática. As análises amperométricas foram realizadas em potencial +0,347 V, com adições sucessivas de ácido úrico de concentração 2 mmol.L-1 em uma célula eletroquímica contendo tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. Para a primeira arquitetura, o limite de detecção encontrado pelo método amperométrico foi de 5,17 µmol.L-1 com a faixa linear de detecção compreendido no intervalo entre 3,92 - 11,3 µmol.L-1 . Para a segunda arquitetura, o limite de detecção encontrado pelo método amperométrico foi de 4,68 µmol.L-1 com a faixa linear de detecção compreendido no intervalo entre 14,18 – 55,56 µmol.L-1 , e para o método DPV os valores de LD e faixa linear de detecção encontrados foram 0,11 µmol.L-1 e 1,8×10& ± 0,2×10& partículas/mL, respectivamente. Os biossensores apresentaram limites de detecção próximos aos valores encontrados na literatura, mostrando-se eficientes para detecção de ácido úrico.

Submitted by ANDRESSA TRECENTI DAMACENA null (dretrecenti@hotmail.com) on 2016-05-04T11:16:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Andressa - Repositório.pdf: 2946507 bytes, checksum: 9abbfaa6ae7910659e2f50cdfcba9757 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T20:44:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 damacena_at_me_bot.pdf: 2946507 bytes, checksum: 9abbfaa6ae7910659e2f50cdfcba9757 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T20:44:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 damacena_at_me_bot.pdf: 2946507 bytes, checksum: 9abbfaa6ae7910659e2f50cdfcba9757 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Introdução: Pré-eclâmpsia é uma síndrome sistêmica específica da gestação com etiopatogenia ainda não esclarecida, porém acredita -se ser decorrente de alterações no processo de invasão trofoblástica, com consequente inadequado suprimento sanguíneo uterino e estresse oxidativo do tecido placentário. O aumento da concentração de ácido úrico sérico materno (AU) em mulheres com pré-eclâmpsia tem sido associado com a gravidade da hipertensão, proteinúria e prognóstico materno e perinatal na gestação. Objetivos: Identificar a associação entre a concentração sérica de ácido úrico e resultados maternos e perinatais adversos e correlacionar a concentração sérica do ácido úrico materno com recémnascidos pequenos para idade gestacional e proteinúria materna. Sujeitos e Métodos: Foi realizado estudo retrospectivo, em gestantes com pré-eclâmpsia, as quais foram estratificadas de acordo com a dosagem de ácido úrico sérico em dois grupos: I (inferior a 6 mg/dL) e II (igual ou superior a 6 mg/dL) e avaliados resultados adversos maternos e perinatais. Resultados: No grupo II houve maior frequência de crise hipertensiva(25%), eclampsia(6,9%), síndrome HELPP parcial (7,8%) e síndrome HELLP(6,9%), maior número de recém-nascidos pequenos para idade gestacional(47%), menor peso do recém-nascido, maior porcentagem de óbito fetal(1,8%), de prematuridade(68%) e de índice de Apgar no 1º minuto(38%). Conclusões: Os resultados demonstram que as paciente com ácido úrico elevado apresentam piores resultados adversos tanto maternos quanto perinatais, sendo assim a dosagem de ácido úrico sérico materna associadas a outros exames clínicos e laboratoriais, pode auxiliar nos processos de decisão na prática obstétrica. / Introduction: Preeclampsia is a specific systemic disease of pregnancy with unknown etiology, but it is believed to be due to changes in the process of trophoblastic invasion, leading to an inadequate uterine blood supply and oxidative stress of the placental tissue. Increasing of maternal uric acid serum concentration (UA) in women with pre-eclampsia has been associated with the severity of hypertension, proteinuria and maternal and perinatal outcome on pregnancy. Objectives: Identify the association between serum uric acid and adverse maternal and perinatal outcomes. More specifically, the correlation of maternal UA serum concentration with newborn size for gestational age and maternal proteinuria. Subjects and Methods: Cross observational study in pregnant women with preeclampsia, which were stratified according to dose of serum uric acid into two groups, as follow: I (below 6 mg/dL) and II (greater or equal to 6 mg/dL). Maternal and perinatal adverse outcomes were examined. Results were analyzed by T - Student and chi-square tests and correlations were evaluated by Pearson test. The level of significance used was 5%. Results: In group II there were a greater frequency of hypertensive crisis, eclampsia, partial HELPP syndrome and HELLP syndrome. Also it were observed an increased number of small newborns for gestational age, lower weight of the newborn, the higher percentage of fetal death, prematurity and index Apgar at 1 minute. Conclusions: The results suggest that patients with higher uric acid have worse adverse outcomes both for maternal and perinatal. In conclusion, the dosage of maternal serum uric acid associated with other clinical and laboratory tests can help in the decision on obstetrical practice.

Submitted by Tony Rogerio de Lima Dadamos null (tonyrlrl@yahoo.com.br) on 2018-02-20T16:25:35Z No. of bitstreams: 1 Tese_AU_TRLD_2018.pdf: 2071412 bytes, checksum: ba59227c90cba94171f8548d07346f1a (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2018-02-21T19:00:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dadamos_trl_dr_sjrp.pdf: 2071412 bytes, checksum: ba59227c90cba94171f8548d07346f1a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T19:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dadamos_trl_dr_sjrp.pdf: 2071412 bytes, checksum: ba59227c90cba94171f8548d07346f1a (MD5) Previous issue date: 2018-01-24 / Este trabalho apresenta metodologias de desenvolvimento, otimização, e validação de procedimentos de medição eletroquímica de parâmetros bioquímicos em fluidos biológicos. As ferramentas desenvolvidas foram aplicadas à medição voltamétrica, simples e de baixo custo de ácido úrico (AU) em soro humano que se apresenta como uma alternativa confiável às medições realizadas pelo método de referência espectrofométrico. Foi estudada a medição de AU no soro visto a ser utilizada no diagnóstico de várias doenças, tais como gota, doenças cardiovasculares e neoplasias. O eletrodo de trabalho modificado desenvolvido e otimizado é composto por 25 % de lignina, 60 % de nanografite, 15 % de óleo mineral e cobre metálico eletrodepositado. As medições foram realizadas por um método de adição cumulativa de padrão (MAP-C), recorrendo a um novo tratamento estatístico dos dados de calibração, que permite a calibração da instrumentação num pequeno volume de soro. A incerteza da medição foi estimada recorrendo a diversas abordagens bottom-up desenvolvidas e usando abordagens pragmáticas top-down apresentadas na bibliografia. As componentes de incerteza foram combinadas usando a Lei de Propagação de Incertezas ou os métodos numéricos de Kragten e Monte Carlo. Procedeu-se igualmente a uma avaliação bayesiana da incerteza da medição que envolve a atualização de dados da prevalência de ácido úrico na população com o resultado da medição do soro específico analisado. Os modelos metrológicos desenvolvidos foram implementados em folhas de cálculo MSExcel de fácil utilização pelo analista. As avaliações bottom-up da incerteza da medição recorreram a estimativas da incerteza de extrapolação produzidas pelo modelo de regressão ou usando simulações de Monte Carlo aplicáveis quando os pressupostos do modelo de regressão não são cumpridos. O método de adição cumulativa de padrão foi aplicado com sucesso à análise de soro humano pela adição de 1,0, 3,0, 5,0, 7,0 e 9,0 mg dL-1 de AU a 5 mL de soro. A adequação da qualidade das medições eletroquímicas foi avaliada comparando sua incerteza com um valor alvo de 0,56 mg dL-1 (uma oitava parte das faixas de AU de indivíduos saudáveis) e avaliado a compatibilidades das medições com determinações realizadas pelo procedimento de referência. As medições realizadas revelaram-se válidas e com menor custo do que as produzidas pelo método de referência. As ferramentas desenvolvidas para a construção e otimização de eletrodos de trabalho são aplicáveis à medição de outras espécies de análise e em outras matrizes. O método de adição cumulativa de padrão desenvolvido, bem como os modelos de medição respectivos desenvolvidos, são aplicáveis a qualquer tipo de medição instrumental não destrutiva de soluções. / This work presents methodologies for the development, optimization and validation of procedures for the electrochemical measurement of biochemical parameters in biological fluids. The developed tools were applied to voltammetric, simple and low-cost measurements of uric acid (AU) in human serum, which proved to be a reliable alternative to the spectrophotometric reference method. It was studied the measurement of AU in serum since it is used in the diagnosis of various diseases, such as gout, cardiovascular diseases and neoplasms. The developed and optimized modified working electrode is composed of 25 % lignin, 60 % nanocarbon, 15 % mineral oil and electrodeposited copper. The measurements were performed using a cumulative standard addition method (MAP-C), using a new statistical treatment of the calibration data, which allows the calibration of the instrumentation in a small volume of serum. The measurement uncertainty was estimated using developed bottom-up approaches and using pragmatic top-down approaches presented in the literature. The uncertainty components were combined using the Uncertainty Propagation Law or the numerical Kragten and Monte Carlo methods. A bayesian evaluation of the measurement uncertainty was performed, involving the updating of uric acid prevalence in the population with the result of the measurement of AU in the specific serum sample. The developed metrological models were implemented in user-friendly MS-Excel spreadsheets. The bottom-up assessments of measurements uncertainty involve the estimation of the extrapolation uncertainty from the regression model or using Monte Carlo simulations applicable to when the assumptions of the regression model are not valid. The cumulative standard addition method was successfully applied to the analysis of human serum by adding 1.0, 3.0, 5.0, 7.0 and 9.0 mg dL-1 of AU to 5 mL of serum. The adequacy of the electrochemical measurements was assessed by comparing their uncertainty with a target value of 0.56 mg dL-1 (one-eighth of the range of AU in healthy individuals) and by evaluating the compatibility of measurements with determinations performed by the reference procedure. The performed measurements are valid and significantly cheaper than those produced by the reference method. The tools developed for the construction and optimization of working electrodes are applicable to the measurement of other analytes and matrices. The developed cumulative standard addition method and respective measurement models, are applicable to any kind of non-destructive chemical measurement of a solution.

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Mariza Pires de Melo / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Resumo: Em pacientes com doença renal crônica é observado à presença de estresse oxidativo e a exacerbação desse estresse com o tratamento hemodialítico, bem como tem se postulado a ação antioxidante de alguns solutos urêmicos. Esse contexto instigou-nos explorar, a ação antioxidante dos solutos urêmicos: L-arginina, Ácido Úrico, Ácido Hipúrico, Creatinina, Fenol, Metilguanidina, p-Cresol, L-tirosina e Uréia, utilizando sistemas-modelo in vitro. Quatro desses solutos mostraram eficiência (expressa via o IC50 em µmol/L) para os sistemas-modelo: Capacidade de captura sobre o ABTS + , p-Cresol (3,99 ± 0,01), L-tirosina (5,23 ± 0,02), Fenol (12,98 ± 0,09) e o Ácido Úrico (16,75 ± 0,14); Capacidade de captura sobre o HOCl / OCl -, L-tirosina (2,83 ± 0,04), Ácido Úrico (5,75 ± 0,13), Fenol (8,95 ± 0,10) e p- Cresol (15,75 ± 0,12), e o bleaching da crocina (lipoperoxidação), Ácido Úrico (6,90), Fenol (1125,81) e p-Cresol (1162,31). Em relação à capacidade de captura sobre o Ânion Radical Superóxido e o Peróxido de Hidrogênio nenhum dos solutos apresentou atividade significativa. Em todos os ensaios onde não foi observada atividade antioxidante, investigou-se desde concentrações fisiológicas, urêmicas e até 10 vezes maior que as concentrações urêmicas médias. Como os solutos urêmicos, Ácido Úrico, p-Cresol, Fenol e L-tirosina capturaram significativamente as espécies reativas, ABTS + , HOCl / OCl - e ROO  , estudou-se o comportamento da mistura desses solutos, tendo como referência o IC50 de cada soluto. Obteve-se nos ensaios de captura do ABTS + e do HOCl / OCl - os IC50, como uma fração de concentração de 26 e 27%, respectivamente, para cada soluto na mistura, o que demonstrou um efeito aditivo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Patients with chronic kidney disease suffer from oxidative stress and this stress is exacerbated by hemodialysis. It has been postulated that some uremic solutes have antioxidant effects. This context prompted us to explore the antioxidant action of the uremic solutes: L-arginine, uric acid, hippuric acid, creatinine, phenol, methylguanidine, p-cresol, L-tyrosine and urea, by means of 5 in vitro model systems. Only four of these solutes were effective antioxidants (assessed by their IC50 in µmol/L) in 3 model systems: ABTS + scavenging: p-cresol (3.99±0.01), L-tyrosine (5.23±0.02), phenol (12.98±0.09) and uric acid (16.75±0.14); hypochlorous acid scavenging: L-tyrosine (2.83±0.04), uric acid (5.75±0.13), phenol (8.95±0.10) and p-cresol (15.75±0.12); and crocin bleaching (lipoperoxidation): uric acid (6.90), phenol (1,125.81) and p-cresol (1,162.31). In tests with the superoxide radical anion and hydrogen peroxide, none of the solutes showed antioxidant activity. In each of the assays in which no activity was detected, tests were carried out over a range of solute concentrations, from normal physiological levels, through typical uremic up to ten times higher than mean uremic concentrations. As the 4 uremic solutes, uric acid, p-cresol, phenol and L-tyrosine showed significant scavenging activity for 3 reactive species, ABTS + , HOCl / OCl - and ROO  , the behavior of mixture of these solutes was investigated, with reference to the IC50 of each solute. In the ABTS + and HOCl / OCl - scavenging assays, the IC50 involved a concentration of 26% and 27%, respectively, of each solute in the mixture, demonstrating... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre