Les mécanismes épigénétiques, tels que la méthylation et les modifications d'histones, sont impliqués dans le contrôle à grande échelle de l'expression du génôme et contribuent à la mise en place des profils d'expression des gènes spécifiques de tissus et de types cellulaires. Dans les cellules en cours ou en fin de différenciation, ces mécanismes sont aussi impliqués dans la mise en place et le maintien de la repression d'un grand nombre de gènes. La transformation oncogénique est presque toujours associée à des anomalies de la signalisation épigénétique cellulaire, dont certaines, comme les méthylations aberrantes de gènes suppresseurs de tumeur, sont considérées comme des événements oncogènes. Un aspect beaucoup moins étudié de ces dérégulations épigénétiques est l'activation aberrante de gènes tissu-spécifiques dans des cellules pré-cancéreuses et transformées. De nombreuses études rapportent l'activation « hors contexte » de gènes spécifiques du testicule dans plusieurs cancers somatiques. Ces gènes sont décrits sous le nom de gènes « cancer testis » ou C/T. Il a été suggéré que ces expressions illégitimes pourraient être de bons indicateurs des cancers, et fournir de nouvelles cibles pour une immunothérapie anticancéreuse. Au cours de cette thèse, nous avons développé une approche basée sur ce concept d'activation ectopique de gènes pour identifier les gènes exprimés de manière aberrante dans les lymphoblastes des patients atteints de leucémies lymphoblastiques aigues (LAL). Nous avons ensuite évalué leur intérêt pour une utilisation comme marqueurs pronostics et de prédiction de la réponse au traitement. Nous avons ainsi identifié une signature de huit gènes spécifiques de la lignée germinale / cellules souches embryonnaires, exprimés de manière aberrante dans les LAL pédiatriques et adultes : 4 gènes prédictifs de mauvais pronostic et 4 gènes associés à une issue favorable. Nous avons par la suite montré qu'une combinaison de l'expression de ces 8 gènes peut identifier les formes agressives de LAL chez les enfants ainsi que chez les adultes. Une étude prospective clinique a mis en évidence que notre système de détection des 8 gènes, basé sur un test RT- qPCR, pourrait aider à prédire la réponse précoce à un traitement (induction) dans un groupe de 31 patients adultes nouvellement recrutés, atteints de LAL. Enfin, en exploitant notre méthode de classification, nous avons découvert des traits biologiques communs entre les formes agressives de LAL chez les enfants et chez les adultes. Nos données montrent que les formes les plus agressives de LAL présentent les caractéristiques de cellules souches hématopoïétiques au repos. Cette information pourrait être utilisée pour adapter les approches thérapeutiques. Enfin, en plus de l'amélioration de la détection et du suivi des patients LAL, ce travail a un fort potentiel dans la définition de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que d'ors et déjà dans les choix thérapeutiques les plus appropriés pour les patients porteurs des formes les plus agressives. / Epigenetic mechanisms such as methylation and histone modifications are involved in large-scale control of the expression of the genome and contribute to the development of specific gene expression profiles of tissues and cell types. In cells, during and after differentiation, these mechanisms are also involved in the establishment and maintenance of the repression of many genes. Oncogenic transformation is almost always associated with abnormalities of cellular epigenetic signalling, some of which, such as aberrant methylation of tumour suppressor genes, are considered as oncogenic events. One much less studied aspect epigenetic deregulations, is the aberrant activation of tissue-specific genes in pre-cancerous and transformed cells. Many studies have reported the “out of context” activation of specific testicular genes in several somatic cancers. These genes are described as the "cancer / testis" genes or C/T. It has been suggested that these illegitimate expressions could be good indicators of cancer and provide new targets for cancer immunotherapy. In this thesis, based on the concept of ectopic activation of genes, we have identified genes aberrantly expressed in lymphoblasts of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). We have then assessed their potential for a use as markers for prognosis and prediction of treatment response. We have identified a signature of eight genes specific of germline/embryonic stem cells, aberrantly expressed in adult and paediatric ALL. The ectopic activation of four genes was predictive of poor prognosis and the expression of four other genes was associated with a favourable outcome. We have subsequently shown that the combination of the expression of these eight genes can identify aggressive forms of ALL in children and adults. A prospective clinical study showed that a test based on the detection of these 8 genes, by RT- qPCR could help predicting an early response to treatment (induction) in a group of 31 newly recruited ALL adult patients. Finally, using our classification method, we discovered common biological traits between aggressive forms of ALL in children and adults. Our data show that the most aggressive forms of ALL have characteristics of dormant hematopoietic stem cells. This information could be used to refine therapeutic approaches. Finally, in addition to improving the detection and monitoring of ALL patients, this work has great potentials in the definition of new therapeutic strategies as well as in the choice of the most appropriate therapeutic approaches for patients with aggressive forms of ALL.

Submitted by DANIELA MOURA DOS SANTOS (danielamouravet@yahoo.com.br) on 2018-06-19T19:03:42Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇAO MESTRADO DANIELA SANTOS.pdf: 2591566 bytes, checksum: a364ce81cfb4254048a30be1ce071232 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-20T16:33:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_dm_me_jabo.pdf: 2591566 bytes, checksum: a364ce81cfb4254048a30be1ce071232 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-20T16:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_dm_me_jabo.pdf: 2591566 bytes, checksum: a364ce81cfb4254048a30be1ce071232 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Alterações na organização estrutural da cromatina estão sendo associadas ao desenvolvimento e à fisiopatologia de diversas afecções oftálmicas. Com o advento da epigenética, emergiu o conceito de que parte dessas alterações pode ser revertida por fármacos. Visando-se avaliar a organização estrutural da cromatina em células da conjuntiva palpebral de cães com ceratoconjuntivite seca (CCS), antes e após tratamento com pomada de ciclosporina A (CsA) 0,2%, a presente pesquisa foi dividida em duas fases. Na fase I estudaram-se núcleos de células epiteliais e de linfócitos colhidos da conjuntiva palpebral de cães com e sem CCS. Foram incluídos na pesquisa 64 olhos de 32 cães domésticos, distribuídos em dois grupos: grupo controle, composto por 16 cães saudáveis (32 olhos, valores de Schirmer ≥ 15 mm/min); grupo CCS, abrangendo 16 cães (32 olhos, valores de Schirmer ≤ 10 mm/min) com CCS bilateral nunca antes tratados com imunomoduladores, sem oftalmopatias concorrentes e livres de alterações sistêmicas. As células foram colhidas por citologia esfoliativa e coradas pela reação de Feulgen. Os seguintes parâmetros foram estudados por vídeo-análise de imagens: área nuclear, perímetro nuclear, fator de circularidade relativa do núcleo (RNRF), densidade óptica integrada (IOD = conteúdo de DNA), densidade óptica (OD = compactação de cromatina); e desvio padrão de valores densitométricos (SDtd = textura de cromatina). Os resultados mostraram que a CCS enseja alterações nos parâmetros nucleares das células epiteliais e dos linfócitos da conjuntiva palpebral. Comparativamente aos controles, as células epiteliais foram mais afetadas pela CCS (alterações em área, perímetro, RNRF, IOD, e OD) do que os linfócitos (alterações em OD, apenas). Tanto as células epiteliais quanto os linfócitos do grupo CCS apresentaram cromatina mais descompactada do que as células do grupo controle. Padrões aberrantes de cromatina, como a "snake-like-chromatin", comumente vistos em pacientes humanos, não foram detectados. Na fase II estudou-se se as alterações nucleares detectadas na fase I regrediriam após tratamento local com pomada de CsA 0,2% a intervalos regulares de 12 horas e lacrimomimético a base de ácido poliacrílico 0,2%, instilado localmente a cada 4 horas. O mesmo grupo controle composto por cães hígidos foi adotado e as células também foram colhidas por citologia esfoliativa aos 30 e 60 dias de tratamento. As preparações citológicas foram coradas pela reação de Feulgen ou submetidas ao bandamento AgNOR. Estudaram-se parâmetros de video-análise de imagens relacionados com a funcionalidade da cromatina, notadamente a fração de área nuclear coberta pela cromatina mais condensada (Sc%), a taxa média de absorbância (AAR), e a entropia. Após bandamento AgNOR, estudaram-se os tamanhos das regiões organizadores de nucléolo e as frações de áreas nucleares ocupadas por elas. Os resultados mostraram que o tratamento com CsA e lacrimomimético (30/60 dias) enseja remodelação cromatínica e desfaz parcialmente as alterações associadas à CCS. / Changes in the structural organization of chromatin are being associated with the development and pathophysiology of various ophthalmic conditions. With the advent of epigenetics, the concept emerged that part of these alterations can be reversed by drugs. To evaluate the structural organization of chromatin in palpebral conjunctival cells of dogs with keratoconjunctivitis sicca (KCS), before and after treatment with 0.2% cyclosporine A (CsA) ophthalmic ointment, the present research was divided into two phases. In stage I, epithelial cells and lymphocyte from the palpebral conjunctiva of dogs with and without KCS were studied. The study included 64 eyes of 32 domestic dogs, distributed into two groups: control group, composed of 16 healthy dogs (32 eyes, Schirmer values ≥ 15 mm / min); KCS group, formed of 16 dogs (32 eyes, Schirmer values ≤ 10 mm / min) with bilateral CCS never previously treated with immunomodulatory drugs, and without concurrent ophthalmic or systemic disorders. Cells were collected by brush cytology and stained by the Feulgen reaction. The following parameters were studied by video image analysis: nuclear area, nuclear perimeter, relative nuclear roundness factor (RNRF), integrated optical density (IOD = DNA content), optical density (OD = chromatin compaction). The results showed that KCS causes alterations in the nuclear parameters of the epithelial cells and the lymphocytes from the palpebral conjunctiva. Compared with the control, the epithelial cells were more affected by the disease (alterations in area, perimeter, RNRF, IOD, and OD) than lymphocytes (changes in OD only.) Both epithelial cells and lymphocytes from the KCS group showed more decompressed chromatin than cells from the control group. "Snakelike-chromatin" commonly seen in human patients was not detected. In phase II it was studied whether the nuclear detected in stage I, regress after treatment with 0.2% CsA at regular intervals of 12 h and 0.2% polyacrylic acid-based artificial tears at regular intervals of 4h. The same control group composed of healthy dogs was adopted and cells were collected by brush cytology after 30 and 60 days of treatment. Cytological preparations were stained by the Feulgen reaction or submitted to the AgNOR banding. We studied video image analysis parameters related to the functionality of chromatin, notably the fraction of nuclear area covered by more condensed chromatin (Sc %), the average absorption ratio (AAR), and entropy. After AgNOR banding, the samples were studied for the sizes of the nucleolar organizer regions and the fractions of nuclear areas occupied by them. Results show that treatment with CsA and lacrimomimetic (30/60 days) leads to chromatin remodeling and partially reverses the chromatin changes elicited by KCS.

Submitted by Carolina Rabal Biasetto null (carolinarabal@yahoo.com.br) on 2016-05-18T19:36:08Z No. of bitstreams: 1 Tese_Doutorado_Carolina_Rabal_Biasetto_2016.pdf: 15348096 bytes, checksum: 59245cf961f6aaf1a999156f53853b5d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-05-20T18:01:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 biasetto_cr_dr_araiq_par.pdf: 1896284 bytes, checksum: 8b4dcb25761fe239f657abc24e10c1e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T18:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 biasetto_cr_dr_araiq_par.pdf: 1896284 bytes, checksum: 8b4dcb25761fe239f657abc24e10c1e7 (MD5) Previous issue date: 2016-04-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A capacidade biossintética dos fungos endofíticos, aliado aos estudos químico e biológicos relatados para Eugenia brasiliensis, motivou a idealização do projeto, a prospecção química, biológica e enzimática em fungos endofíticos associados a folhas, caules e frutos saudáveis de Eugenia brasiliensis e a avaliação do co-cultivo e epigenética em Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp., na obtenção de novas substâncias. O isolamento dos fungos endofíticos, resultou em dezessete linhagens de fungos endofíticos, sendo estes cultivados em escala reduzida em meio líquido de batata e dextrose (PDB) e Czapek, a 25 oC, sob modo estático para obtenção dos respectivos extratos brutos em AcOEt. A avaliação metabólica destes extratos foi realizada por CCDC, HPLC-DAD e RMN de 1H, como também a potencialidade enzimática e biológica pela avaliação das atividades antifúngica, anticolinesterásica e citotóxica, sendo que estes extratos demonstraram ser promissores. A prospecção inicial conduziu a seleção de três fungos endofíticos identificados como Xylaria cubensis (Eb_caH_5), Diaporthe sp. (Eb_caS_4), e Colletotrichum sp. (Eb_frmH_1), os quais foram cultivados (escala ampliada) em PDB para isolamento e determinação/elucidação estrutural dos metabólitos secundários. O estudo de Xylaria cubensis, resultou no isolamento de 8 substâncias, sendo da classe dos nucleosídeos, dicetopirazinas, isocumarinas e citocalasinas. De Diaporthe sp. foi isolado e identificado 8 substâncias: duas dicetopiperazinas, ácido nitropropiônico, uracila, tirosol, zygosporina D, pirrolidona (inédita) e alternariol. Colletotrichum sp. resultou no isolamento de 6 substâncias, sendo três dicetopiperazinas, além das substâncias N-(2-feniletil)acetamida, N-acetiltriptamina e metanoato de 2-hidroxibutila 3-indol (inédita). Todas as classes de substâncias produzidas por estes fungos endofíticos apresentam diversas atividades biológicas relatadas na literatura. Destaca-se a atividade fitotóxica da citocalasina D frente a coleóptilos de trigo superior ao herbicida comercial GOAL®. Para verificar a influência na produção metabólica de Xylaria cubensis, Diaporthe sp. e Colletotrichum sp., utilizou-se estratégias como o co-cultivo em meio sólido (PDA) e líquido (PDB) e a epigenética (escala reduzida), nas quais os endófitos mostraram produção metabólica diferente em relação à produção das monoculturas e na ausência do modulador epigenético ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), respectivamente. As ferramentas estatísticas, como PCA (Análise de componentes principais) e PLS-DA (Análise discriminante com calibração multivariada por mínimos quadrados parciais) permitiram uma rápida identificação e localização dos perfis metabólicos dos co-cultivos comparados às monoculturas. Estes dados contribuem para o conhecimento dos perfis metabólicos, biológicos e enzimáticos dos fungos endofíticos isolados de Eugenia brasiliensis, bem como suas interações com o hospedeiro. / The biosynthetic capacity of endophytic fungi, allied chemical and biological studies reported to Eugenia brasiliensis motivated the idealization of the project, prospection chemical, biological and enzymatic in endophytic fungi associated with healthy leaves, stems and fruits from Eugenia brasiliensis and evaluation co-culture and epigenetic in Xylaria cubensis, Diaporthe sp. and Colletotrichum sp., in obtaining new substances. The isolation of endophytic fungi resulted in seventeen endophytics fungi, these being cultivated in small scale on potato dextrose broth (PDB) and Czapek at 25 °C under static mode to obtain the corresponding crude extracts in AcOEt. The metabolic evaluation of these extracts was performed by CCDC, HPLC-DAD and 1H NMR, also enzymatic and biological potential were performed by antifungal, cytotoxic, and anticholinesterase activities, and these extracts have shown promise. The preliminary prospection led to the selection of three endophytic fungi identified as Xylaria cubensis (Eb_caH_5), Diaporthe sp. (Eb_caS_4) and Colletotrichum sp. (Eb_frmad_1) which were cultivated (larger scale) in PDB for isolation and determination or structural elucidation of secondary metabolites. The study of Xylaria cubensis resulted in the isolation of eight substances, as follows: nucleoside, diketopiperazines, isocoumarins and cytochalasins class. From Diaporthe sp. was isolated and identified eight substances, as follows: two diketopiperazines, nitropropionic acid, uracil, tyrosol, zygosporin D, pyrrolidone (unpublished) and alternariol. Colletotrichum sp. resulted in the isolation of six substances, three diketopiperazines, besides the substances N-(2-phenylethyl) acetamide, Nβ-acetyltryptamine and 3-hydroxybutan-2-yl-1H-indol-3-ylacetate (unpublished). All classes of substances produced by these endophytic fungi present several biological activities reported in the literature. Noteworthy is the phytotoxic activity of cytochalasin D against wheat coleoptile higher than commercial herbicide GOAL®. To verify the influence on the metabolic production of Xylaria cubensis, Diaporthe sp. and Colletotrichum sp., used strategies such as the co-culture on solid (PDA) and liquid medium (PDB) and epigenetic (small scale), in which endophytes showed an interesting and different metabolic production when compared with the production of monocultures and the absence of epigenetic modulator SAHA, respectively. The statistical tools, such as PCA (Principal component analysis) and PLS-DA (discriminant analysis with multivariate calibration partial least squares) allowed quick identification and location of the metabolic profiles of the co-culture compared monocultures. These data will contribute to the knowledge of the metabolic profiles, biological and enzymatic of endophytic fungi isolated from Eugenia brasiliensis and their interactions with host. / CNPq: 140980/2012-1

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-29Bitstream added on 2014-06-13T18:57:30Z : No. of bitstreams: 1 vieira_bs_me_jabo.pdf: 210260 bytes, checksum: d3afaa3f53192340812b4ef7563a72a4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Com o objetivo de avaliar a real eficácia do condicionamento térmico precoce em condições de campo, bem como elucidar as respostas adaptativas relacionadas à maior tolerância ao calor, 600 pintainhos de corte machos, da linhagem Cobb-500® , foram distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2X2, sendo os fatores processo de adaptação ao calor (controle e condicionamento térmico) e programa de luz (contínuo e intermitente). Aves condicionadas ao calor ou expostas à luminosidade intermitente ingeriram maior quantidade de água durante todo período de desafio térmico; no entanto, somente o programa de fornecimento intermitente de luz foi eficiente em reduzir a mortalidade final das aves. De fato, frangos submetidos à luminosidade intermitente apresentaram menor relação heterófilo: linfócito ao final do período de criação e ainda concentração plasmática de T4 e temperatura interna menores no início do período de estresse térmico. Frangos condicionados ao calor não apresentaram alteração na composição química da carcaça; porém, a deposição protéica das aves submetidas ao programa de fornecimento intermitente de luminosidade foi reduzida. Tais resultados evidenciam aparente ineficácia do processo de condicionamento térmico precoce em reverter os efeitos deletérios da exposição crônica e cíclica ao calor na fase final de criação. Entretanto, a adoção de um programa de fornecimento intermitente de luminosidade mostrou-se benéfica à maximização da tolerância das aves ao calor. / In order to evaluate the real efficacy of early age thermal conditioning in field conditions and clarify the physiological responses related to greater heat tolerance, 600 male broiler chicks were distributed in a 2X2 factorial design, with the factors - heat adaptation (control and heat conditioning) and light schedule (continuous and intermittent). Heat-conditioned and intermittent-lightexposed broilers drank more water during the final week of experiment; however, only the intermittent light program reduced flock mortality level significantly. In fact, intermittent-light-exposed broilers showed lower T4 plasmatic concentration and body temperature at the beginning of the heat-stress period and reduced heterophil to linfocyte ratio at the end of thermal challenge. Their carcass protein deposition at 42 days was decreased too. These results allow concluding that early age thermal conditioning seems to be inefficient on reducing the impact of chronic and cyclical heat exposure at marketing age. However, intermittent light program improve broiler heat tolerance.

Orientador: Renato Luis Furlan / Banca: Daniel Emygdio de Faria Filho / Banca: Otto Mack Junqueira / Resumo: Com o objetivo de avaliar a real eficácia do condicionamento térmico precoce em condições de campo, bem como elucidar as respostas adaptativas relacionadas à maior tolerância ao calor, 600 pintainhos de corte machos, da linhagem Cobb-500® , foram distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2X2, sendo os fatores processo de adaptação ao calor (controle e condicionamento térmico) e programa de luz (contínuo e intermitente). Aves condicionadas ao calor ou expostas à luminosidade intermitente ingeriram maior quantidade de água durante todo período de desafio térmico; no entanto, somente o programa de fornecimento intermitente de luz foi eficiente em reduzir a mortalidade final das aves. De fato, frangos submetidos à luminosidade intermitente apresentaram menor relação heterófilo: linfócito ao final do período de criação e ainda concentração plasmática de T4 e temperatura interna menores no início do período de estresse térmico. Frangos condicionados ao calor não apresentaram alteração na composição química da carcaça; porém, a deposição protéica das aves submetidas ao programa de fornecimento intermitente de luminosidade foi reduzida. Tais resultados evidenciam aparente ineficácia do processo de condicionamento térmico precoce em reverter os efeitos deletérios da exposição crônica e cíclica ao calor na fase final de criação. Entretanto, a adoção de um programa de fornecimento intermitente de luminosidade mostrou-se benéfica à maximização da tolerância das aves ao calor. / Abstract: In order to evaluate the real efficacy of early age thermal conditioning in field conditions and clarify the physiological responses related to greater heat tolerance, 600 male broiler chicks were distributed in a 2X2 factorial design, with the factors - heat adaptation (control and heat conditioning) and light schedule (continuous and intermittent). Heat-conditioned and intermittent-lightexposed broilers drank more water during the final week of experiment; however, only the intermittent light program reduced flock mortality level significantly. In fact, intermittent-light-exposed broilers showed lower T4 plasmatic concentration and body temperature at the beginning of the heat-stress period and reduced heterophil to linfocyte ratio at the end of thermal challenge. Their carcass protein deposition at 42 days was decreased too. These results allow concluding that early age thermal conditioning seems to be inefficient on reducing the impact of chronic and cyclical heat exposure at marketing age. However, intermittent light program improve broiler heat tolerance. / Mestre

Introdução: Leiomiomas uterinos ou miomas são tumores benignos que se desenvolvem no miométrio e acometem cerca de 50% da população feminina. Têm como principais sintomas, sangramento excessivo e dor pélvica inespecífica. Convencionalmente o estrogênio é considerado o responsável pelo início da proliferação tumoral, mas recentes evidências clínicas e bioquímicas sugerem que a progesterona apresenta um papel importante no desenvolvimento desses tumores. Além disso, mecanismos epigenéticos parecem estar envolvidos na etiologia dos leiomiomas uterinos, como a metilação de DNA e acetilação de histonas. Somente nos EUA são realizadas 240 mil histerectomias/ano para tratar essa doença sendo considerado um problema de saúde pública. Frente a esses dados é imprescindível o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento desses tumores e a busca de tratamentos menos invasivos. A mifepristona (RU 486), um modulador seletivo dos receptores de progesterona e glicocorticoides, é capaz de diminuir o tamanho dos tumores e amenizar os sintomas associados. Objetivos: verificar se (1) nos tecidos de leiomiomas uterinos e miométrio, os mecanismos epigenéticos como a metilação global do DNA e a acetilação de histonas estão alterados (2) se em cultura primária de leiomioma uterino e miométrio o tratamento com estradiol e progesterona é capaz de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B, assim como a atividade das enzimas histona acetiltransferase e desacetilase, e (3) se a mifepristona (RU 486) é capaz de modular diretamente a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B após tratamento com os hormônios estradiol e progesterona. Métodos: para análise de metilação global do DNA e acetilação de histonas foram utilizadas 25 amostras teciduais para cada grupo de leiomioma uterino e miométrio oriundos de pacientes submetidas à histerectomia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A metilação global do DNA e a atividade da enzima histona acetiltransferase foram dosadas pelo método de ELISA e a enzima histona desacetilase por detecção fluorimétrica. Para verificar o efeito dos hormônios sexuais ovarianos e o efeito da mifepristona (RU 486) sobre a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B foram realizadas 7 culturas primárias de leiomiomas uterinos e miométrio. Resultados: (1) Foram observadas hipermetilação (P = 0,022) e hipoacetilação (P = 0,04) em leiomiomas uterinos quando comparado ao miométrio. Não houve diferença estatística entre estes tecidos em relação à atividade da histona acetiltransferase. (2) Houve aumento da expressão gênica do receptor de progesterona total em cultura primária de leiomioma uterino quando tratado com estradiol (P = 0,028) e o receptor de progesterona B teve sua expressão aumentada quando tratado com estradiol, progesterona e estradiol + progesterona (P = 0,001). (3) O tratamento com mifepristona (RU 486) na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B em células de leiomiomas uterinos e miométrio. A atividade da enzima histona desacetilase foi maior nas células de leiomioma uterino quando tratadas com estradiol (P = 0,034) e estradiol + progesterona + RU 486 (P = 0,001) quando comparado às células de miométrio, já a atividade da enzima histona acetiltransferase não foi detectada, devido a sua baixa quantidade. Conclusão: Nesse estudo foi observado uma hipermetilação e hipoacetilação nos tecidos de leiomiomas uterinos. Esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos podem estar contribuindo para a diminuição transcricional de genes relacionados ao funcionamento normal do miométrio e, com isso, colaborando para o crescimento desses tumores. Além disso, nossos resultados sugerem que estradiol e progesterona são capazes de modular a expressão gênica dos receptores de progesterona total e B e o medicamento RU 486 na dose de 10-6M não foi capaz de diminuir diretamente a expressão desses receptores. / Introduction: Uterine leiomyoma, also known as fibroids, is a smooth muscle cell tumor, and is clinically apparent in up to 50% of reproductive-age women. Clinical symptoms include abnormal uterine bleeding and pelvic pain. Estrogen has been considered a primary growth promoter of uterine leiomyoma, however clinical and biochemical evidence has suggested that progesterone plays a critical role in the development of these tumors. Furthermore, epigenetic modifications may be involved with etiology of theses tumors, through DNA methylation and histone acetylation. In the United States, 240.000 hysterectomies/year are performed to treat uterine leiomyomas which is being considered to be a public public health problem. The understanding of molecular mechanisms involved in the development of uterine leiomyoma may provide not only opportunities for a diagnostic, but also generation of novel therapeutic approaches. The mifepristone (RU 486), a synthetic steroid that has affinity for progesterone and glucocorticoid receptors has been reported to induce regression of uterine leiomyoma and reduce the symptoms. Objective: verify if (1) DNA global methylation and histone acetylation patterns are altered in uterine leiomioma tissue compared with myometrium; (2) the treatment with estradiol and progesterone are able to modulated de gene expression of total and B progesterone receptors and histone acetylation patterns in primary culture of uterine leiomyoma cells and myometrium as well as (3) the mifepristone (RU 486) are able to modulate the gene expression of total and B progesterone receptors after the treatment with ovarian steroids hormones. Methods: DNA global methylation and histone acetylation patterns were analyzed in 25 tissue samples from uterine leiomioma and myometrium. The DNA global methylation and the activity of histone acetyltransferase were performed using ELISA method. In order to evaluate histone deacetylase activity fluorimetric detection was used. To verify the effect of estradiol and progesterone on total and B progesterone receptors gene expression, as well as the influence of RU486 on this parameters, seven cultured cells from uterine leiomyoma and myometrium cells were performed. Results: (1) Hypermethylation (p = 0.022) and hypoacetylation (p = 0.04) in uterine leiomioma tissues compared with myometrium were observed. There was no statistic difference between these tissues in histone acetyltransferase activity. (2) We observed increased gene expression of total progesterone receptor in culture cells of uterine leiomyoma when treated with estradiol (p = 0.028). There was an increase of B progesterone receptor mRNA when treated with hormones, estradiol and progesterone (p = 0.001). The treatment with RU 486 was not able to modulate progesterone receptors. The histone desacetilase activity was elevated in uterine leiomyoma cells when treated with estradiol (p = 0.034) and estradiol + progesterone + RU 486 (p = 0.001). The histone acetyltransferase activity was barely detectable. Conclusion: In our study we found hypermethylation and hypoacetylation in uterine leiomyoma tissues suggesting that this process may lead to a decreased transcriptional activity of important genes associated with normal myometrium function contributing to the development of these tumors. Furthermore, our results suggest that ovarian steroids hormones increase progesterone receptors expression, being mifepristone (RU 486) at dose of 10-6M unable to decrease total and B progesterone receptors in uterine leiomyoma cells.

O desenvolvimento e a progressão do câncer bucal envolvem processos complexos de múltiplas etapas levando a modificações fenotípicas nas células epiteliais, aumento da proliferação e invasão dos tecidos subjacentes. Diversos fatores vem sendo associados à carcinogênese, dentre eles os mecanismos epigenéticos como a acetilação de histonas, que promovem mudanças na expressão de genes independente de mutações. O objetivo do presente estudo observacional transversal foi analisar a relação entre acetilação da histona 3 (acetil Histona H3) com proliferação celular e transição epitélio-mesênquima na mucosa bucal normal (MBN), leucoplasias bucais (LB) e carcinomas espinocelulares (CEC) de boca, bem como correlacioná-los com dados clínico-demográficos, graduação histopatológica e o comportamento das lesões. Foram analisados 10 casos de mucosa bucal normal (MBN), 20 casos de LB e 75 casos de CEC de boca. Todos os casos foram submetidas a análise imunoistoquímica utilizando anticorpos anti-acetil Histona H3, Ki67, vimentina e TGF-β1. A imunomarcação da acetil histona H3 foi significativamente menor nos casos de CEC quando comparados a LB (p=0.03). Não foi encontrado diferença entre os casos de MBN e LB. Paralelamente, foi observado um aumento estatisticamente significativo na proliferação durante o processo de carcinogênese (p<0.00) e o mesmo foi observado quando avaliados os marcadores da transição epitélio-mesênquima, vimentina (p=0.03) e TGF-β1 (p<0.00). A análise da associação dos marcadores com fatores clínicos-demográficos não mostrou diferença significativa. Entretanto, maior média de acetil histona H3 foi associada ao bom prognóstico (p=0.01) e também, foi observado uma tendência de uma melhor taxa de sobrevida (p=0.06). Conclui-se que os CEC de boca são hipoacetilados, exibem maior perfil proliferativo e de transição epitélio-mesênquima. Além disso, a acetil histona H3 pode ser considerada um marcador prognostico nestas lesões. / The development and progression of oral cancer involve multi-step processes leading phenotypic changes in epithelial cells, proliferation increase and invasion of adjacent tissue. Several factors have been associated with carcinogenesis, including epigenetic mechanisms such as histone acetylation, which promote changes in the expression independent of gene mutations. The aim of the present study was to analyze the association of acetylation of histone 3 (acetyl-histone H3) with cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in oral leukoplakia (OL) and oral squamous cell carcinoma (OSCC) and correlate them with data clinic-demographic, histopathological grading and the behavior of these lesions. We analyzed 10 cases of normal oral mucosa (NOM), 20 cases of OL and 75 cases of OSCC. All samples were submitted to immunohistochemical analysis using anti-acetyl histone H3, Ki67, vimentin and TGF-β1. Acetyl-histone H3 labeling was significantly lower in cases of OSCC compared to LB (p=0.03). It was not found difference between NOM and OL. In parallel, the proliferation analysis revealed a gradual increase on Ki67 labeling (p<0.00) during oral carcinogenesis with highest value detected in OSCC Also, an increase on EMT markers, vimentin (p=0.03) and TGF-β1 (p<0.00) were noted. A higher mean acetyl-histone H3 was associated with good prognosis (p= 0.01) and similarly a tendency to improved survival rate was observed (p=0.06). As conclusion, OSCC are hypoacetylated, exhibit higher proliferative profile and epithelial-mesenchymal transition characteristics. Furthermore, acetyl histone H3 can be considered a prognostic marker in OSCC.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) sont évolutivement conservées et sont des régulateurs chromatiniens responsables du maintien de la répression transcriptionnelle des gènes homéotiques (HOX) au cours du développement. Elles assurent ainsi une mémoire cellulaire. Cependant, ces protéines peuvent aussi cibler des gènes contrôlant le cycle cellulaire et la détermination du destin cellulaire. Au laboratoire, il a été montré que dans le disque imaginal d'œil de drosophile, plusieurs gènes de la voie de signalisation Notch sont réprimés par les protéines du PcG. La perte de fonction de ces dernières résulte en l'activation ectopique de Notch et en la formation de tumeurs néoplasiques. De manière intéressante, Notch n'est pas une cible des protéines du PcG dans les embryons. Ceci suggère qu'au cours du développement, les protéines du PcG pourraient être impliquées dans un contrôle dynamique de l'expression génique.L'objectif de ma thèse a été d'étudier le ciblage dynamique des protéines du PcG au cours du développement et de la différentiation tissulaire. Pour cela, j'ai effectué des expériences de ChIP dirigées contre des protéines du complexe PRC1 et pour la marque répressive H3K27me3 (typique du complexe PRC2) à partir de tissus larvaires : les disques imaginaux d'œil et d'aile. En comparant ces données aux données embryonnaires, nous avons découvert un néo-recrutement du système Polycomb spécifique du stade larvaire. Etonnamment, il existe plusieurs catégories de gènes cibles qui se distinguent sur la base de leurs profils de ChIP, ce qui suggère de nouveaux mécanismes de régulation par les protéines du PcG. En effet, certains gènes sont fixés uniquement par les protéines du PRC1 en l'absence de la marque H3K27me3 et inversement. Les 2 complexes PRCs pourraient donc agir indépendamment dans la régulation de l'expression génique. / Polycomb group (PcG) proteins are an evolutionarily conserved set of chromatin regulators implicated in stable long-term homeotic gene silencing. PcG proteins additionally bind and regulate genes implicated in cell cycle control or cellular fate determination, suggesting that PcG proteins can be involved in more dynamic regulation of target genes. Recent studies in Drosophila eye imaginal discs showed that PcG proteins can control cellular proliferation by repression of signalling genes, and that abrogation of this process promotes tumours. Interestingly, one of the regulated genes was not found to be a PcG target in embryonic tissues, suggesting that PcG-mediated gene regulation is dynamic throughout development. To gain a comprehensive view of the targeting of PcG proteins throughout development and to understand its role during tissue differentiation, we performed ChIP experiments in eye and wing imaginal discs for components of the PcG complex, PRC1, and the repressive histone mark H3K27me3 (deposited by the PcG complex, PRC2). Compared to embryo datasets, we find many novel PcG target genes, several with tissue-specific recruitment in eye or wing discs. Furthermore, we report new classes of PcG target genes based on their ChIP profiles, which may have implications for their modes of regulation. For example, some genes are bound only by PRC1 components (Pc, Ph), without the presence of H3K27me3, or vice versa, indicating that these complexes may play more independent roles in gene regulation than previously appreciated.

Au cours du développement, les cellules acquièrent progressivement leur identité en établissant des profils transcriptionnels spécifiques qui seront maintenus à travers les divisions cellulaires successives par des mécanismes dits épigénétiques. En dépit de nombreuses sources de variations de l’environnement, génétiques ou aléatoires, les organismes vivants présentent des phénotypes très stéréotypés. Cela suggère l’existence de processus de régulation assurant l’homéostasie du développement. Chez la drosophile, la protéine Cycline G jouerait un rôle dans la stabilité du développement, processus qui tamponne les variations aléatoires du développement. De plus, cette cycline est un régulateur trancriptionnel et interagit avec deux Enhancers de Trithorax et Polycomb (ETP) : ASX et Corto, impliqués dans l’activation et la répression de nombreux gènes. L’analyse du= transcriptome des disques imaginaux d’ailes de larves de drosophile qui surpexpriment CycG nous a permis d’identifier ses cibles transcriptionnelles. Nous avons montré que le domaine d’interaction avec les ETP (ASX et Corto) de Cycline G pourrait être impliqué dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent qu’une interaction fonctionnelle entre Cycline G et deux complexes Polycomb répresseurs (PR-DUB et PRC1), contrôlerait l’expression de gènes importants pour la stabilité du développement. Par ailleurs, l’interaction fonctionnelle entre des facteurs d’épissage et Cycline G serait également impliquée dans la stabilité du développement. Nos résultats suggèrent que la dérégulation de CycG induirait une augmentation du bruit transcriptionnel, ayant des répercussions sur la stabilité du développement. / During development, cells progressively acquire their identity by establishing specific transcriptional profiles that will be maintained throughout successive cell divisions by epigenetic mechanisms. Despite numerous sources of developmental variability - whether environmental, genetic or stochastic, living organisms exhibit uncannily stereotyped phenotypes, suggesting the existence of regulation processes tending to developmental homeostasis. In Drosophila, Cyclin G could participate in developmental stability, which buffers stochastic developmental variation. Moreover, this cyclin is a transcriptional regulator and interacts with two Enhancers of Trithorax and Polycomb (ETP): ASX and Corto, both involved in transcriptional gene silencing and activation. By studying the transcriptome of Drosophila imaginal wing discs overexpressing Cyclin G, we have identified its transcriptional targets. We determined that the ETP-interacting domain of Cyclin G (which binds ASX and Corto) may be involved in developmental stability. Our results show that a functional interaction between Cyclin G and two Polycomb group complexes involved in transcriptional gene silencing (PR-DUB and PRC1), may control the expression of genes required for developmental stability. Additionally, Cycling G might participate indevelopmental stability through functional interactions with splicing factors. Altogether, our results suggest that Cyclin G deregulation may induce an increase in transcriptional noise, resulting in heightened developmental variation.

O desenvolvimento e a progressão do câncer bucal envolvem processos complexos de múltiplas etapas levando a modificações fenotípicas nas células epiteliais, aumento da proliferação e invasão dos tecidos subjacentes. Diversos fatores vem sendo associados à carcinogênese, dentre eles os mecanismos epigenéticos como a acetilação de histonas, que promovem mudanças na expressão de genes independente de mutações. O objetivo do presente estudo observacional transversal foi analisar a relação entre acetilação da histona 3 (acetil Histona H3) com proliferação celular e transição epitélio-mesênquima na mucosa bucal normal (MBN), leucoplasias bucais (LB) e carcinomas espinocelulares (CEC) de boca, bem como correlacioná-los com dados clínico-demográficos, graduação histopatológica e o comportamento das lesões. Foram analisados 10 casos de mucosa bucal normal (MBN), 20 casos de LB e 75 casos de CEC de boca. Todos os casos foram submetidas a análise imunoistoquímica utilizando anticorpos anti-acetil Histona H3, Ki67, vimentina e TGF-β1. A imunomarcação da acetil histona H3 foi significativamente menor nos casos de CEC quando comparados a LB (p=0.03). Não foi encontrado diferença entre os casos de MBN e LB. Paralelamente, foi observado um aumento estatisticamente significativo na proliferação durante o processo de carcinogênese (p<0.00) e o mesmo foi observado quando avaliados os marcadores da transição epitélio-mesênquima, vimentina (p=0.03) e TGF-β1 (p<0.00). A análise da associação dos marcadores com fatores clínicos-demográficos não mostrou diferença significativa. Entretanto, maior média de acetil histona H3 foi associada ao bom prognóstico (p=0.01) e também, foi observado uma tendência de uma melhor taxa de sobrevida (p=0.06). Conclui-se que os CEC de boca são hipoacetilados, exibem maior perfil proliferativo e de transição epitélio-mesênquima. Além disso, a acetil histona H3 pode ser considerada um marcador prognostico nestas lesões. / The development and progression of oral cancer involve multi-step processes leading phenotypic changes in epithelial cells, proliferation increase and invasion of adjacent tissue. Several factors have been associated with carcinogenesis, including epigenetic mechanisms such as histone acetylation, which promote changes in the expression independent of gene mutations. The aim of the present study was to analyze the association of acetylation of histone 3 (acetyl-histone H3) with cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in oral leukoplakia (OL) and oral squamous cell carcinoma (OSCC) and correlate them with data clinic-demographic, histopathological grading and the behavior of these lesions. We analyzed 10 cases of normal oral mucosa (NOM), 20 cases of OL and 75 cases of OSCC. All samples were submitted to immunohistochemical analysis using anti-acetyl histone H3, Ki67, vimentin and TGF-β1. Acetyl-histone H3 labeling was significantly lower in cases of OSCC compared to LB (p=0.03). It was not found difference between NOM and OL. In parallel, the proliferation analysis revealed a gradual increase on Ki67 labeling (p<0.00) during oral carcinogenesis with highest value detected in OSCC Also, an increase on EMT markers, vimentin (p=0.03) and TGF-β1 (p<0.00) were noted. A higher mean acetyl-histone H3 was associated with good prognosis (p= 0.01) and similarly a tendency to improved survival rate was observed (p=0.06). As conclusion, OSCC are hypoacetylated, exhibit higher proliferative profile and epithelial-mesenchymal transition characteristics. Furthermore, acetyl histone H3 can be considered a prognostic marker in OSCC.