Resumo: O presente trabalho evidencia os esforços realizados na tentativa de se aperfeiçoar a técnica de MIRU ("Mycobacterial Interspersed Repetitive Units"). Esta utiliza como marcadores, diferenças em fragmentos de DNA não codificadores específicos do Mycobacterium tuberculosis e vem sendo empregada para o estudo epidemiológico da tuberculose, pela facilidade de execução. A técnica de MIRU possibilita uma comparação entre linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens individuais. Na otimização os seguintes parâmetros foram determinados: 1. protocolos de purificação de DNA; 2. estratégias de amplificação pela PCR; 3. comparações entre um "kit" de PCR ("PCR Master Mix" - PROMEGA) e a utilização da PCR da maneira convencional; 4. testes de variadas condições de amplificação utilizando o "kit" e os reagentes convencionais de PCR; 5. determinação de protocolos de ciclagem para a amplificação dos fragmentos desejados; 6. teste de amplificação sem a prévia extração de DNA das amostras utilizadas. Após a padronização a metodologia foi utilizada na tipagem de 82 amostras de M. tuberculosis que se encontravam divididas em dois grupos, sendo o primeiro com 49 amostras, provenientes de pacientes do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA - USP, Araraquara) e o segundo, composto de 33 amostras de bactérias com perfil de resistência a pirazinamida e a outras drogas, provenientes de Maringá. Nesta etapa foram realizados: 7. PCR para a confirmação de gênero e espécie para M. tuberculosis nas 82 amostras analisadas. 8. Aplicação da técnica de MIRU e análise manual de todas as amostras provenientes de pacientes; 9. Emprego de ferramentas de bioinformática (programa PAST "Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis") para a análise das amostras... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work shows efforts to improve the MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) assay. This methodology, that has been exploited for fingerprinting the Mycobacterium tuberculosis in molecular epidemiological studies, allows for direct and reliable comparison of results between laboratories and the development of large-scale epidemiological studies. In the optimization of MIRU assay, some parameters were defined: DNA purification protocols and PCR strategies were compared, to select the most practical and economical among them. After the standartization, 82 M. tuberculosis strains, from two different groups were analised. The 49 bacteria strains from the first group were sensible and the 33 from the second one were resistant to pyrazinamide and another drugs as isoniazide and/or rifampicin. To stablish the allelic studies the samples were first confirmed as M. tuberculosis by PCR. Then the MIRU assay was applied and the genetic profile was determined. These results generated dendrograms, obtained by bioinformatic tools. This study showed that any kind of DNA purification and even the use of fresh bacterial culture directly into the PCR tube can be used. When the PCR strategies were compared the utilization of the PCR kit seemed to be more practical and to avoid some mistakes that can happens during the "home-made" PCR mixture preparation. Furthermore, it allows some dilutions higher than those recommended by the manufacturer. In the same way, the "home-made" mixture in amounts smaller than those suggested can be used. These experiments indicated that only two annealing temperatures can be used to the PCR with the twelve primer pairs, always in the same MgCl2 concentration, allowing the amplification of more samples at the same time. To generate dendrograms with the allelic data from clinical samples... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Mario Hiroyuki Hirata / Banca: Fernando Augusto Fiúza de Melo / Banca: Daisy Nakamura Sato / Banca: Rosilene Fressatti Cardoso / Doutor

Orientador: Jane Megid / Resumo: O presente estudo teve por objetivo verificar positividade ao Vaccinia virus em amostras de animais domésticos, selvagens e humanos provenientes de áreas com e sem histórico de surto, na região centro oeste do estado de São Paulo. Foram amostradas aleatoriamente 47 propriedades produtoras de leite, sendo 10 em Torre de Pedra (que já registrou dois surtos prévios ao presente estudo), 15 em Bofete e 22 em Anhembi (com histórico de surtos desconhecido). Avaliou-se a presença de DNA viral em amostras de sangue coletadas de bovinos, outros mamíferos domésticos e selvagens, bem como de humanos e de DNA viral em amostras de fezes e urina de pequenos roedores silvestres capturados nas áreas de mata das 47 propriedades analisadas. O DNA viral foi detectado em amostras de sangue de quatro vacas, um cavalo, três gambas (um Didelphis albiventris e dois Didelphis aurita), bem como em amostras de fezes e urina de pequenos roedores silvestres, sendo seis amostras positivas para DNA viral nas fezes (dois Oligoryzomys flavescens, dois Oligoryzomys nigripes e dois Sooretamys angouya), e uma para DNA viral na urina (Oligoryzomys flavescens). A análise das sequencias do gene vgf mostras nossas amostras agrupadas com amostras de Vaccinia vírus Brasileiras e vacinais, nos permitindo classificar o vírus detectado nas amostras de sangue, fezes e urina, como Vaccinia vírus. Relata-se pela primeira vez a detecção de DNA viral em amostras de sangue, fezes e urina de animais sadios, naturalmente infecta... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study aimed to verify positivity for Vaccinia virus in samples from domestic and wild animals, and humans from areas with and without outbreaks history, in the central west region of São Paulo State. Was randomly sampled 47 milking farms: 10 in Torre de Pedra (which registered two previous outbreak), 15 in Bofete and 22 in Anhembi (both without histories of outbreak). We assessed the presence of viral DNA in blood samples collected from cows, other domestic and wild mammals, as well as from humans and in feces and urine sample from wild rodents captured in forest areas in the 47 sampled farms. The viral DNA was detected in blood samples of four cows, one horse, three opossums (one Didelphis albiventris and two Didelphis aurita), as well as in feces and urine samples of wild rodents: six samples PCR-positive for viral DNA in feces (two Oligoryzomys flavescens, two Oligoryzomys nigripes and two Sooretamys angouya), and one for viral DNA in urine (Oligoryzomys flavescens). The sequences analysis of vgf gene show our samples clustered with Brazilian and vaccine Vaccinia virus, which allowed us to classify our samples as Vaccinia virus. Reports for the first time the detection of viral DNA in blood, feces and urine samples of healthy animals, naturally infected, and suggests that Vaccinia virus is subclinical circulating in the region sampled. Additionally suggests that wild rodents naturally infected and apparently healthy are potential infection source evidenced by e... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ana Lúcia dos Anjos Ferreira / Banca: Jorge Luis dos Santos Valiatti / Banca: Luis Shigueru Matsubara / Resumo: Com o objetivo de estudar os pacientes atendidos pela Unidade de Terapia Intensiva do Pronto-Socorro (UTI-PS) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu analisamos uma amostra de 1104 pacientes que foram admitidos no serviço entre os anos de 2000 e 2002 e definimos os preditores clínicos associados à mortalidade analisando os seguintes dados: gênero, idade, ano de internação, especialidade, tempo de permanência na unidade, diagnósticos principal e secundário, desfecho clínico e gravidade. Para mensurar este último utilizamos o escore de APACHE-II. Com o auxílio do teste estatístico Qui-quadrado caracterizamos esse grupo de pacientes e concluímos que a sua maioria é composta por homens, com idade média de 58 anos e é internada por motivos clínicos. Os diagnósticos que mais motivaram a internação na unidade foram insuficiência coronariana, doenças cerebrais (acidentes vasculares encefálicos, traumatismos cranianos e pós-operatórios de neurocirurgia) e a insuficiência respiratória. Os diagnóstico secundários mais freqüente foram hipertensão arterial e diabetes mellitus tipo 2. A maioria dos pacientes permaneceu internada na unidade em média por 6,5 dias além de apresentar valor médio de APACHE-II de 10,2 pontos. Foi observado o maior número de internações no primeiro ano do estudo (abril/2000 a março/2001), que foi associado ao maior número de internações de pacientes crônicos no segundo ano (abril/2001 a março/2002). Neste segundo ano foi verificado uma maior taxa de mortalidade. A taxa de mortalidade da unidade nos dois anos do estudo foi de 24% acompanhada por uma taxa de mortalidade hospitalar de 4,27% no mesmo período. Por meio dos testes de Goodman, Mann-Whitney e técnica de análise de variância para o modelo com dois fatores comparamos as variáveis com o desfecho clínico e determinamos quais poderiam estar diretamente relacionadas à mortalidade. / Abstract: In order to identify epidemiologic mortality indicators in patients of intensive care unit of emergency room department (ICU-ER) from an academic hospital we analyzed 1104 patients admitted between April 2000 and March 2002. The variables analyzed were: gender, age, year of hospitalization [(period 1, April/2000-March/2001; period 2, April/2001-March 2002)], department source, ICU-ER length of stay, primary and secondary diagnoses, discharge, death and APACHE-II score. Statistical test Qui-square showed that main patient characteristics were: men with average age of 58 years admitted by clinical reasons. Coronary heart disease, cerebral illnesses (stroke, head trauma and postoperative of neurosurgery) and respiratory insufficiency were the main primary diagnoses. On the other hand, arterial hypertension and diabetes mellitus type 2 were the main secondary diagnoses. Average of ICU-ER length of stay and APACHE score were 6.5 days and 10.2, respectively. In comparison to the other period, it was identified higher values of number of admissions in the period 1, chronic patient admissions in the period 2 and mortality rate in the period 2. ICU-ER mortality rate of the two periods was 24%, while hospital mortality rate was 4.27% in the same period. The Goodman, Mann-Whitney and analysis of variance for the model with two factors methods compared each variable with the clinical outcome (discharge or death). The results identified that age, length of stay and APACHE-II were the variables that had been related with death. Regarding qualitative variables, the results showed that death is more often in patients admitted by surgical reasons (urgency or emergency surgeries were the main procedure of those patients). Regarding primary diagnoses, it was identified that shock, cerebral illnesses and Abstract respiratory failure have associated with death. Using linear regression... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Banca: Lúcia Helena O'Dwyer de Oliveira / Banca: Helder Louvandini / Banca: Stevam Guilherme Lux Hoppe / Banca: José Maurício Sforcin / Resumo: A variação sazonal e a intensidade de infestação por larvas de Oestrus ovis em ovinos criados em Botucatu-SP foi avaliada de abril de 2008 a março de 2011. Dois cordeiros traçadores foram colocados, mensalmente, junto com um rebanho ovino, onde permaneceram por 28 dias. Após esse período, os traçadores foram sacrificados e as larvas de O. ovis recuperadas, identificadas e quantificadas de acordo com o estádio de desenvolvimento. Dos 72 cordeiros traçadores, 50% estavam infestados por larvas O. ovis com intensidade média de 16,8 larvas/cabeça com média de 7,8 larvas de primeiro estádio (L1), 5,3 de segundo (L2) e 3,7 de terceiro (L3). Sinais clínicos de oestrose foram mensalmente avaliados em todas as ovelhas do rebanho e a prevalência média de animais com sinais clínicos de oestrose foi de 13,4% (máxima de 31,4% em janeiro de 2009 e mínimo de 1% em setembro de 2010). Além disso, a prevalência do parasitismo por O. ovis e a intensidade de infestação foram avaliados em cabeças de ovinos obtidas de um abatedouro localizado em Itápolis - SP. Das 139 cabeças examinadas, 13,7% estavam parasitadas pelas larvas O. ovis e a intensidade de infestação média mensal variou de 1 até 10,2 larvas/cabeça com intensidade média geral de 4,5 larvas/cabeça. Do total de 85 larvas, 21,2% eram L1, 37,6% L2 e 41,2% L3. Os resultados demonstraram que as condições climáticas do Estado de São Paulo são favoráveis para a atividade da mosca e desenvolvimento dos estágios larvais praticamente durante todo o ano. Em outro estudo, foi avaliada, comparativamente, a resistência de cordeiros de duas raças ovinas, Ile de France (IF) e Santa Inês (SI) contra infestações naturais por O. ovis, bem como a associação entre a ocorrência deste parasita com as infecções naturais por nematódeos gastrintestinais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The seasonal factors which influence Oestrus ovis infestation in sheep in Botucatu-SP were determined from April 2008 until March 2011. Two tracer lambs were exposed monthly to natural infestation by O. ovis larvae for 28 consecutive days, by grazing with a sheep flock. Tracer animals were then euthanized and the larvae of O. ovis recovered from nasal and sinus cavities. Of the 72 tracer lambs, 50% were infested with O. ovis larvae and the mean intensity of infestation per head infested was 16.8 larvae with an average of 7.8 first instar (L1), 5.3 second instar (L2) and 3.7 third instar (L3). Clinic signs of oestrosis were evaluated in all sheep of the flock monthly and the average prevalence of animals with clinical signs of oestrosis was 13.4% (maximum of 31.4% in January 2009 and minimum of 1% in September 2010). Additionally, the O. ovis prevalence and infestation intensity were evaluated in heads from slaughtered sheep from Itápolis-SP. Of the 139 head examined 13.7% were parasitized by O. ovis larvae with monthly mean of intensity of infestation ranging from 1 until 10.2 larvae/infested head with general mean intensity of 4.5 larvae/infested head. Of the total of 85 larvae, 21.2% were L1, 37.6% L2 and 41.2% L3. The results suggest that the climatic conditions in São Paulo State are favorable to fly activity and larval development during the whole year. In other study, were evaluated comparatively, the resistance in lambs of two sheep breeds, Ile de France (IF) and Santa Ines (SI) against O. ovis infestation, well as the association between the occurrence of this parasite with natural infections by gastrointestinal nematodes (GIN). SI (n=12) and IF (n=12) young male lambs weaned at two months of age were kept together in a paddock from September to early December 2009, when were sacrificed. All animals were... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:07:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000409862-Texto+Completo-0.pdf: 4390417 bytes, checksum: 7a3f167d778635b2b58c5287d14f72df (MD5) Previous issue date: 2008 / Background: There is accumulating evidence that helminth infections may be capable of modulating the expression of allergic diseases. Nasal increased eosinophils are one of the major hallmarks of allergic rhinitis. The objective of this report was to evaluate the effect of extracts of different parasites on the upper airway in a murine model of allergic rhinitis. Methods: BALB/c mice were first sensitized intraperitoneally (i. p) to ovalbumin (OVA, days 0 and 14) and were challenged intranasally (i. n) with OVA on 3 consecutive days (days 25, 26, 27). Extracts of adult Angiostrongylus costaricensis (A. costaricensis), Angiostrongylus cantonesis (A. cantonensis) and Ascaris lumbricoides (A. lumbricoides) worms were given by i. p. injection, in three different groups, respectively, on day -7. A fourth group, without extract administration, was used as the control group. Twenty-four hours after the last i. n OVA challenge, the mice were euthanized. Nasal tissues were removed and histology analysis was performed by light microscopic examination. Results: Mean of eosinophils counted in the control group was 25. 74 ± 3. 06. Eosinophil counts (cells/mm2) in A. costaricensis, A. lumbricoides and A. cantonensis groups were significantly lower than the control group (1. 88 ± 0. 60, 2. 37 ± 0. 66 and 2. 31 ± 0. 56, respectively; p=0. 001). ). The mean eosinophils counted in the treatment groups were not significantly different among the groups (p > 0,05). Conclusions: Our results suggest that systemic exposure to different adult parasite worm extracts suppress the eosinophilic inflammation in a murine model of allergic rhinitis. / Introdução: diversos estudos têm demonstrado que infecções helmínticas são capazes exercer um efeito modulador na expressão de doenças alérgicas. O aumento do número de eosinófilos no epitélio nasal é uma das principais características da rinite alérgica (RA). O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de extratos de diferentes parasitos adultos na resposta alérgica de vias aéreas superiores, utilizando-se um modelo murino. Métodos: camundongos BALB/c foram sensibilizados intraperitonealmente (i. p) com ovalbumina (OVA, nos dias 0 e 14). Após a sensibilização, nos dias 25, 26 e 27 do protocolo, os animais foram submetidos a instilações intranasais (i. n) de OVA. Extratos de vermes adultos de Angiostrongylus costaricensis (A. costaricensis), Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis) e Ascaris lumbricoides (A. lumbricoides) foram administrados através de injeção i. p em três diferentes grupos, respectivamente, no dia – 7. Um quarto grupo, no qual não foi administrado extrato parasitário, foi usado como controle. Vinte quatro horas após o último desafio com OVA i. n, os camundongos foram eutanaziados. O epitélio nasal foi removido e a análise histológica foi realizada em microscopia óptica. Resultados: a média do número de eosinófilos por mm2 (células/ mm2) no grupo controle foi de 25,74 ± 3,06. Enquanto a média de eosinófilos nos grupos A. costaricensis, A. lumbricoide e A. cantonensis foi significativamente menor que no grupo controle (1,88 ± 0,60; 2,37 ± 0,66 e 2,31 ± 0,56, respectivamente, p = 0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos de tratamento com extrato parasitário (p > 0,05). Conclusão: os resultados sugerem que a exposição sistêmica a extratos de diferentes vermes adultos pode suprimir a inflamação eosinofílica em um modelo murino de rinite alérgica.

Made available in DSpace on 2014-05-06T02:02:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000457566-Texto+Completo-0.pdf: 828433 bytes, checksum: dfa634f0f7cbe00efd4bdfccad709ee0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Introduction: A significant increase in the prevalence of asthma and atopy was observed in epidemiological studies conducted in 1980, 1989 and 1998, with school of Porto Alegre. The continuity of this phenomenon in recent decades needed to be evaluated. Objective: Verify the changes in prevalence of symptoms of active and cumulative asthma and atopy in schoolchildren from a region of Porto Alegre. Methodology: In a cross-sectional study in which schoolchildren from 5th to 8th grade (10-18 years), four schools located in the same geographic area were interviewed. The first questionnaire covered symptoms suggestive of asthma (at some point in life or in the last twelve months) and the second was the ACT (test asthma control). In addition, skin tests were performed in 241 schoolchildren. Results: 964 students were interviewed a total of 1195 registered. The age of participants ranged from 10 to 18 years with a mean of 13. 3 years. The cumulative prevalence of asthma symptoms was found to be 41,7%, symptoms of active asthma 19,9% and atopy 52,7%. Compared to previous studies, a stabilization in the cumulative prevalence of asthma and atopy occurred while decreased the prevalence of symptoms of active asthma from 22% to 14. 9%. (P <0. 001)Conclusions: In the last decade the prevalence of symptoms of asthma and atopy cumulative stabilized, with a reduction in the prevalence of symptoms of active asthma in the last year. This finding may help guide the search for environmental factors that are responsible for the manifestation of asthma in genetically susceptible individuals. / Introdução: Um importante aumento na prevalência de asma e de atopia foi observado nos estudos epidemiológicos realizados em 1980, 1989 e 1998, com escolares de Porto Alegre. A continuidade deste fenômeno nas últimas décadas precisava ser avaliada. Objetivo: Verificar as modificações na prevalência de sintomas de asma ativa e cumulativa e de atopia em escolares de uma região de Porto Alegre. Metodologia: Trata-se de um estudo transversal, em que escolares de 5º a 8º séries (10 a 18 anos), de quatro escolas situadas em uma mesma área geográfica foram entrevistados. O primeiro questionário utilizado abrangia sintomas sugestivos de asma (em algum momento da vida ou nos últimos doze meses) e o segundo foi o ACT (teste de controle da asma). Além disso, foram realizados testes cutâneos em 241 alunos. Resultados: Foram entrevistados 964 escolares de um total de 1195 matriculados. A faixa etária dos participantes variou de 10 à 18 anos com média de 13,3 anos. A prevalência de sintomas de asma cumulativa encontrada foi de 41,7%, de sintomas de asma ativa 14,9% e de atopia 52,7%. Em relação aos estudos anteriores, ocorreu uma estabilização na prevalência de asma cumulativa e de atopia, enquanto diminuiu a prevalência de sintomas de asma ativa de 22% para 14,9%. (P<0,001)Conclusões: Na última década a prevalência de sintomas de asma cumulativa e de atopia estabilizou, havendo uma redução na prevalência de sintomas de asma ativa no último ano. Essa constatação pode ajudar a orientar a busca de fatores ambientais que sejam responsáveis pela manifestação da asma em indivíduos geneticamente suscetíveis.

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca: Rodrigo Martins Soares / Resumo: Devido à carência de informações relacionadas à epidemiologia da infecção por Cryptosporidium spp. em passeriformes, neste trabalho objetivou-se determinar a periodicidade da eliminação fecal de oocistos de Cryptosporidium, os sinais clínicos, a presença de mortalidade, e a caracterização molecular desse coccídio. Foram colhidas 480 amostras de fezes, provenientes de 40 aves, sendo 372 amostras de 31 aves adultas e 108 amostras de nove filhotes até 12 semanas de vida, com periodicidade mensal, no período de setembro de 2007 a setembro de 2008, com exceção do mês de abril. As aves estavam alojadas em cinco criatórios, com criação de bicudo (Oryzoborus maximiliani), curió (Oryzoborus angolensis), azulão (Passerina brissonii) e coleira do brejo (Sporophila collaris). As amostras foram conservadas em bicromato de potássio 2,5%, a 4ºC, até o processamento. Os oocistos foram purificados por centrífugo-flutuação em solução de Sheather, seguindo-se a extração do DNA genômico dos oocistos e a classificação molecular, por meio da reação em cadeia de polimerase-nested, para amplificação de fragmentos da subunidade 18S do gene do RNA ribossômico. Eliminação fecal intermitente de Cryptosporidium spp. foi observada em 91 (24,5%) amostras de aves adultas, com maior ocorrência nos períodos que se aproximam dos períodos de muda de penas e de reprodução das aves e em 14 amostras (13%) de aves jovens. O sequenciamento dos fragmentos de DNA amplificados possibilitou a identificação de somente Cryptosporidium galli. Embora em todos os criatórios houvesse aves positivas para C. galli, a presença de morbidade ou mortalidade foi observada em aves de somente um criatório, e estava associada à infecção concomitante com Escherichia coli e Isospora spp..Este é o primeiro relato de infecção por C. galli em P. brissonii, O. maximiliani e S. collaris / Abstract: Due to the lack of information related to the epidemiology of Cryptosporidium infection in passerine birds, this study aimed to determine the frequency of fecal shedding of Cryptosporidium spp. oocysts, after natural infection, the clinical signs and the presence of mortality, and accomplish its molecular characterization. Four hundred and eighty fecal samples were collected from 40 birds, 372 samples from 31 adult birds and 108 samples from young birds (up to 12 months old), housed in five herds, monthly, from September 2007 to September 2008, with the exception of the April. The birds were originated from flocks were the following species were herd: great-billed seed-finch (Oryzoborus maximiliani), lesser seed-finch (Oryzoborus angolensis), ultramarine grosbeak (Passerina brissonii) and rusty-collared seedeater (Sporophila collaris). The samples were preserved in 2.5% potassium dichromate 2.5% at 4°C, until processing. The oocysts were purified by centrifugal flotation in Sheather solution, followed by genomic DNA extraction from oocysts and molecular characterization using the nested polymerase chain reaction for amplification of fragments of the 18S subunit ribosomal RNA gene. Intermittent fecal shedding of Cryptosporidium spp. was observed in 91 (24.5%) samples from adult birds, with more frequent in periods approaching the periods of moulting and reproduction of birds and 14 samples (13%) of young birds.The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of Cryptosporidium galli. Although all the aviaries had birds positive for C. galli, morbidity or mortality was observed in birds from only one aviary, and was associated to concomitant infection with Escherichia coli and Isospora sp. This is the first report of infection by C. galli in Oryzoborus maximiliani, Passerina brissonii, and Sporophila collaris / Mestre

Dentre todas as doenças infecciosas que têm afligido a raça humana, a tuberculose (TB) continua sendo uma das mais letais, resistindo às tentativas da história da humanidade em derrotar a consumição. Atualmente, epidemiologistas estimam que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo da TB, com uma taxa anual de 8 a 10 milhões de novos casos e 3 milhões de mortes. O aumento na prevalência da TB, a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas, e o efeito devastador da co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anti-TB. Estas podem ser desenhadas baseadas em vias metabólicas essenciais ao patógeno e ausentes em seu hospedeiro; este é o caso da via de biossíntese de histidina, que está ausente em mamíferos e é comprovadamente essencial em micobactérias. Mais especificamente, demonstrou-se experimentalmente que o nocauteamento por recombinação homóloga do gene hisD de Mycobacterium tuberculosis, codificante da enzima L-histidinol desidrogenase (HisD), gerou mutantes auxotróficos para histidina completamente inviáveis, comprovando sua essencialidade para sobrevivência. Visto que as enzimas codificantes desta via podem representar alvos atrativos para o desenvolvimento de agentes anti-TB, o gene hisD de M. tuberculosis H37Rv foi amplificado, clonado e seqüenciado, e a proteína recombinante foi superexpressa na forma solúvel em Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados aqui apresentados validam hisD como o gene estrutural codificante da enzima HisD em M. tuberculosis, sendo um passo crucial em direção à purificação da proteína recombinante de forma a prover material para estudos estruturais e cinéticos, visando o desenho racional de novos agentes anti-TB. / Among all infectious diseases that have afflicted the human race, tuberculosis (TB) remains one of the deadliest, resisting through the historic attempts of humanity on defeating consumption. At present, epidemiologist estimate that one-third of the world population is infected by the tubercle bacilli, with an annual rate of 8 to 10 million new cases and 3 million deaths. The increasing prevalence of TB, the emergence of multidrug-resistant strains, and the devastating effect of the human immunodeficiency virus co-infection have led to an urgent need for the development of new and more efficient anti-TB drugs. They can be designed based on metabolic pathways which are essential for the pathogen and absent in its host; that is the case for the histidine biosynthetic pathway, which is absent in mammals and has been proved to be essential in mycobacteria. More precisely, experimental data has demonstrated that the disruption of Mycobacterium tuberculosis L-histidinol dehydrogenase hisD-encoding gene by homologous recombination resulted in unviable histidine auxotrophic mutants, proving its essentiality for survival. Since the coding enzymes of this pathway may represent attractive targets for the design of anti-TB agents, the hisD gene from M. tuberculosis H37Rv was amplified, cloned and sequenced, and the recombinant protein was superexpressed in the soluble form in Escherichia coli BL21(DE3). The results reported here validate hisD as the structural gene coding for histidinol dehydrogenase in M. tuberculosis, which is a crucial step towards purification of recombinant protein to provide material for structural and kinetic studies, aiming at the rational design of new anti-TB agents.

A ocorrência de tuberculose (TB) nas penitenciárias de muitos países tem sido descrita como um problema de saúde pública, especialmente naqueles em fase de desenvolvimento sócio-econômico. No Brasil, a dimensão do problema é pouco conhecida, entretanto a introdução, em 2007, da informação sobre a origem prisional do caso de TB na ficha de notificação do SINAN aumentou a visibilidade do problema e permitiu a primeira avaliação nacional. Em 2011, a população privada de liberdade representou 0,2% da população geral, porém contribuiu com 6,8% dos casos de tuberculose notificados. Somada à alta endemicidade, também é particularmente elevada a frequência de formas resistentes e multirresistentes, relacionadas ao tratamento irregular e à detecção tardia de casos de resistência. Este trabalho teve como objetivo realizar um inquérito entre a população privada de liberdade com sintomas respiratórios de tuberculose, a fim de estimar a incidência da doença, analisar o perfil de sensibilidade aos fármacos e o genótipo dos isolados de Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), em uma penitenciária, na cidade de Charqueadas, Rio Grande do Sul. Foi aplicado um questionário de triagem entre os 1900 privados de liberdade da penitenciária, a fim de identificar os sintomáticos respiratórios (SR) que apresentavam tosse por mais de três semanas. Os SR identificados e que concordaram em participar do estudo, responderam a questionário epidemiológico, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e forneceram duas amostras de escarro em dias consecutivos para a realização dos exames de baciloscopia, cultura e teste de sensibilidade. Essas amostras também foram utilizadas para a extração do DNA e aplicação da técnica de spoligotyping. Com TB, foram identificados 72 pacientes (3,8%). Dezessete (23,6%) tiveram pelo menos um episódio de TB anterior, e neste caso, foram considerados como casos de retratamento. Assim sendo, a incidência de novos casos foi de 2,9% (55/1900 habitantes), o que corresponde a 3789 casos de tuberculose por 100.000 habitantes. Os testes de sensibilidade identificaram, entre os isolados testados, resistência de 15% a pelo menos uma droga, dos quais 89% eram resistentes apenas à isoniazida (INH) ou em combinação com outra droga. A classificação dos genótipos após a análise por spoligotyping mostrou que 40% dos isolados pertencem à família LAM; 22% à família T; 17,5% à família Haarlem, 12,5% à família U; 3% à família X. Os SITs mais frequentemente encontrados foram 729 (27%), 50 (9,5%), 42 (8%), 53 (8%) e 863 (8%). Já relatados em outros estudos, os SITs 729 e 863 podem ter relação com a situação de encarceramento. Além disso, pelo número elevado de genótipos agrupados, podemos concluir que a TB nesta população específica tenha sido causado principalmente, por linhagens que foram transmitidas nos últimos anos (transmissão recente). Além do mais, foi possível identificar grupamentos específicos não relatados na população em geral no mesmo período e na mesma região. / The occurrence of tuberculosis (TB) in prisons in many countries has been described as a public health problem, especially in those in the process of socio-economic development. In Brazil, the dimension of the problem is poorly understood, however by introducing, in 2007, the information about the origin of the prison TB case in the notification form from SINAN, increased the visibility to the issue and allowed the first national evaluation. In 2011, the prison population represented 0.2% of the general population, but contributed with 6.8% of reported cases of tuberculosis. Added to the high endemicity it is also especially high the frequency of multidrug resistant forms and related to the irregular treatment and late detection of cases of resistance. The objective of this work was to conduct a survey among prisoners with TB respiratory symptoms in order to estimate the incidence of the disease, to analyze the drug susceptibility profile and genotype the Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) isolates from a prison of Charqueada City, southern of Brazil. A screening questionnaire was applied to 1900 persons deprived of freedom, in order to identify patients with respiratory symptoms (RS) who had a cough for more than three weeks. The identified patients with RS who agreed to participate in the study answered an epidemiological questionnaire, signed a consent form and provided two sputum samples in consecutive days for the examinations of bacilloscopy, culture and sensitivity test. The samples were also used for DNA extraction spoligotyping analysis. Seventy-two patients (3.8%) were identified as TB positive. Seventeen (23.6%) had at least one episode of TB, and in this case, were considered for retreatment. Thus, the incidence of new cases was 2.9% (55/1900 inhabitants), which corresponds to 3789 cases of tuberculosis per 100,000 inhabitants. The sensitivity tests identified, among the isolates tested, 15% resistant to at least one drug, of which 89% were resistant only to isoniazid (INH) or in combination with another drug. The classification of genotypes after analysis by spoligotyping showed that 40% of the isolates belong to the family LAM, 22% from family T; 17.5% from family Haarlem, 12.5% from family U and 3% from family X. The SITs more frequently found were 729 (27%) 50 (9.5%), 42 (8%), 53 (8%) and 863 (8%). Has already reported in other studies, the SITs 729 and 863 may be related to the situation of incarceration. In addition, with the large number of genotypes grouped, we can conclude that this specific TB population was caused especially by strains that were transmitted in recent years (recent transmission). Furthermore, it was possible to identify specific clusters often not reported in the general population from the same period and the same region.

Tuberculose (TB) Multidroga resistente (MDR) é definida como a doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis) com resistência ao menos a isoniazida (INH) e rifampicina (RMP), sendo um crescente problema de saúde pública em todo o mundo. A escolha do tratamento da tuberculose multiresistente (MDR-TB) deveria ser baseada em testes de suscetibilidade as drogas. Estes métodos são laboriosos e demorados, sendo comum ter que aguardar até mais de quatro semanas para obtenção do resultado. Por esta razão, a maioria dos pacientes é orientado a realizar o tratamento sem um teste de susceptibilidade. A detecção precoce do bacilo, bem como a detecção de sua resistência, é crucial para um tratamento adequado, evitando a propagação de cepas resistentes na comunidade. Os métodos baseados em biologia molecular, apesar de rápidos, costumam requerer o uso de equipamentos de alto custo, como o, sequenciador ou GeneXpert MTB/RIF o que inviabiliza a sua utilização na rotina dos laboratórios públicos no Brasil. Por estas razões, objetivamos padronizar uma metodologia de hibridização molecular em membranas (LINE-TB/MDR) capaz de detectar as mutações mais frequentemente relacionadas com resistência a RMP e a INH em isolados de M. tuberculosis, as duas principais drogas utilizadas no tratamento da doença. Sondas gênicas com estas mutações, localizadas nos genes katG, rpoB e inhA , foram fixadas em membrana de náilon para hibridizar com o produto de um PCR multiplex, permitindo a detecção rápida das mutações. O método foi validado em um painel de referência de 108 amostras devidamente caracterizadas pelo teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA) e sequenciamento gênico. Quando comparado com o TSA a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo, para RMP foi 100% em todas as análises. Considerando a análise de resistência a INH, o teste obteve sensibilidade, especificidade, VPP e VPN de 77%, 100%, 100% e 82% respectivamente. Quando comparado com o sequenciamento a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN para RMP foi de 100% para todas as análises. Para resistência a INH a sensibilidade especificidade PPV e NPV foi 94,3%, 100%, 100% e 94,8% respectivamente. O método desenvolvido poderá ser utilizado como uma alternativa para a identificação rápida de cepas multirresistentes, além de permitir a identificação do complexo M. tuberculosis. / Multidrug-resistant (MDR) tuberculosis (TB), defined as the disease caused by a Mycobacterium tuberculosis strain with resistance to at least isoniazid (INH) and rifampicin (RMP), is a growing public health and clinical problem worldwide. The choice of treatment of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is often based on drug susceptibility testing (DST). Drug susceptibility testing by conventional methods takes more than 4 weeks. An accurate and early detection of drug resistance in M. tuberculosis isolates is crucial for appropriate treatment, and to prevent the development of further resistance and the spread of resistant strains. Generally, DNA sequencing-based approaches are considered the reference assays for the detection of mutations, but often they have been found to be too cumbersome for routine use. For this reason, the aim of this study was to standardize a molecular hybridization method (LINE-TB/MDR) able to detect the most frequent mutations related to resistance to RMP and INH in M. tuberculosis isolates. Specific mutations found in the genes rpoB, katg and inhA have been reported as a marker for resistance to tuberculosis first line drugs. The assay was validated on a reference panel with 108 samples well-characterized by antimicrobial susceptibility testing (AST) and DNA sequencing. When compared to AST, the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the LINE-TB/MDR, were 100% for all analyses. For INH resistance, the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 77%, 100%, 100% and 82% respectively. When compared with sequencing, the sensitivity, specificity, PPV and NPV of the LINE-TB/MDR, for RMP resistance, were 100% for all analyses. For INH resistance the sensitivity, specificity, PPV and NPV were 94,3%, 100%, 100% and 94.8% respectively The developed assay could be used as an alternative for rapid identification of multi drug resistant (MDR) strains, and additionally, allowing the M. tuberculosis complex identification.