The family of human kallikrein-related peptidases (KLKs) numbers 15 serine proteinases implicated in tumour progression. Despite the wide tissue distribution of KLKs and the numerous reports of their differential expression in pathological settings, the signalling mechanism(s) whereby these enzymes regulate tissue function are not yet known. Further, knowledge of the levels of their activity, as well as of their potential endogenous targets, has only been extracted from in vitro studies and cell culture systems. We hypothesized that KLKs can trigger tumour signalling via proteinase-activated receptors (PARs), a family of G-protein-coupled receptors. To test our hypothesis, we evaluated the ability of KLKs 5, 6, and 14: to activate or prevent signalling via PARs 1, 2, and 4 in cells and tissues expressing these receptors. Further, we used a novel activity-based probe approach, coupled with conventional immunoassay (ELISA), to determine the abundance of active KLK6 relative to total immunoreactive KLK6 in cancer-related biological fluids. We concluded that KLKs can regulate multiple signalling pathways triggered by PARs 1, 2, and 4, resulting in calcium release, platelet aggregation and vascular relaxation, and they can cause murine inflammation. Further, our activity-based ELISA demonstrated the presence of active KLK6 in ovarian cancer ascites fluids and cancer cell supernatants. We, therefore, suggest that tumours can produce active KLKs, which can potentially control tumour behaviour by regulating PAR activity.

Doctor of Philosophy / Department of Anatomy and Physiology / Timothy I. Musch / Matching local muscle O[subscript]2-supply to O[subscript]2-demand during the prodigious exercise-induced metabolic challenge is achieved through coordinated mechanisms of vascular control. The unique sensitivity of ATP-sensitive potassium (K[subscript]ATP) channels to cell metabolism indicates the potential to match energetic demand to peripheral O[subscript]2 transport. The aim of this dissertation was to determine the magnitude and kinetics of the K[subscript]ATP channel contribution to vascular control during exercise in health and heart failure. It was hypothesized that K[subscript]ATP channel inhibition via glibenclamide would, in healthy rats, 1) reduce exercising skeletal muscle blood flow and vascular conductance 2) speed the fall of microvascular O[subscript]2 driving pressure (PO[subscript]2mv; set by the O[subscript]2 delivery-O[subscript]2 utilization ratio) during muscle contractions and 3) in heart failure rats, augment the PO[subscript]2mv undershoot and delay the time to reach the contracting steady-state. A total of 55 male Sprague-Dawley rats were used under control and glibenclamide conditions (5 mg kg[superscript]-1). Hindlimb muscle blood flow (radiolabelled microspheres) was determined at rest (n = 6) or during treadmill exercise (n = 6-8; 20, 40 and 60 m min[superscript]-1, 5% incline). Spinotrapezius muscle PO[subscript]2mv (phosphorescence quenching) was measured in 16 heart failure (coronary artery ligation) and 12 healthy rats and during 180 s of 1-Hz twitch contractions (~6 V). The major effects of glibenclamide were, in healthy rats, 1) a reduction in exercising hindlimb skeletal muscle blood flow with the greatest effect in predominantly oxidative muscle fiber types and at higher running speeds 2) an increased prevalence of the undershoot of PO[subscript]2mv steady-state and doubled time to reach the steady-state and 3) in heart failure rats, a reduced baseline PO[subscript]2mv, an augmented undershoot of the steady-state and time to reach steady-state and a reduction in the mean PO[subscript]2mv during contractions. These data suggest that the K[subscript]ATP channel contributes substantially to exercise-induced hyperemia and may contribute to the slowing of VO[subscript]2 kinetics given the spatial and temporal effects of glibenclamide. The K[subscript]ATP channel-mediated protection against a severe O[subscript]2-delivery to O[subscript]2-utilization mismatch at the onset of contractions raises serious concerns for sulphonylurea treatment in diabetes which is likely to cause perturbations of [metabolite] and compromise exercise tolerance.

L'hypercholestérolémie familiale autosomique dominante (ADH) est un trouble génétique caractérisé par des taux élevés de lipoprotéine de basse densité (LDL) plasmatique. Un niveau élevé de LDL plasmatique est connu pour contribuer au développement de l’athérosclérose, une cause majeure des crises cardiaques et des accidents vasculaires cérébraux. Le récepteur des LDL (LDLR) est la principale voie d’élimination des particules de LDL. En revanche, la proprotéine convertase subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une glycoprotéine sécrétée par le foie, se lie au LDLR et augmente sa dégradation dans les lysosomes, ce qui entraîne une augmentation de LDL plasmatique et un risque plus élevé de maladie cardiovasculaire. En outre, des mutations de-perte-de fonction de PCSK9 peuvent considérablement réduire les niveaux de LDL plasmatiques et réduire le risque de maladie coronarienne jusqu'à ~ 88%. Toutes ces découvertes ont fait de PCSK9 une cible importante pour le traitement de l'hypercholestérolémie. Des anomalies génétiques du LDLR, de PCSK9 ou de l’apolipoprotéine B (apoB), le ligand du LDLR, peuvent provoquer l'ADH, mais dans certaines familles ADH il n'a pas été possible d'identifier de mutation de ces gènes, suggérant que d'autres anomalies génétiques pourraient également être impliquées dans la maladie. Dans la présente thèse, qui repose sur deux études (articles), nous avons étudié les protéines d’interaction de PCSK9 (premier article, chapitre 2) et l'effet de PCSK9 sur l'athérosclérose (deuxième article, chapitre 3). Dans notre première étude, l'analyse par spectrométrie de masse des protéines interagissant avec PCSK9 a révélé que la Golgi glycoprotéine 1 (GLG1) est une nouvelle protéine d’interaction de PCSK9. Leur co-immunoprécipitation révélée par immunobuvardage et leur co-localisation par microscopie confocale par immunofluorescence ont confirmé que GLG1 est un partenaire de PCSK9. De plus, nos résultats ont montré que GLG1 interagit aussi avec le LDLR et l'apoB. En utilisant un modèle murin, nous avons montré des taux sanguins plus faibles de PCSK9, de cholestérol et de triglycérides chez les souris knockdown GLG1. De plus, le déficit en GLG1 a réduit l'activité de la protéine de transfert des triglycérides microsomales (MTP) et induit l'agrégation périnucléaire de l'apoB, réduisant ainsi la sécrétion d'apoB. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d'athérosclérose chez la souris pour étudier l'effet de l'absence de PCSK9 sur les plaques d’athérosclérose. Nous avons montré que la surexpression d'un mutant gain-de-fonction de PCSK9 dans le foie de souris a accéléré le développement de plaques d'athérosclérose dans la racine aortique et que celles-ci ont ensuite été réduites en induisant la régulation négative de PCSK9 en utilisant le système Tet-on. En conclusion, nous avons contribué à l'identification d'une nouvelle protéine interagissant avec PCSK9, GLG1, qui régule le taux plasmatique de cholestérol et représente une cible potentielle pour le traitement de l'hypercholestérolémie. Nous avons également démontré que la modulation du gène PCSK9 régule directement le niveau de plaques d'athérosclérose dans la racine de l'aorte. Ces études aideront à développer des thérapies efficaces pour réduire l'hypercholestérolémie et le risque de maladie cardiovasculaire / Autosomal dominant hypercholesterolemia (ADH) is a genetic disorder characterized by high plasma low-density lipoprotein (LDL) cholesterol levels. Elevated plasma LDL level is known to contribute to the development of atherosclerosis, a leading cause of heart attack and stroke. Liver LDL receptor (LDLR) acts as a primary pathway for endocytosis and clearance of LDL particles. In contrast, PCSK9, a liver-secreted glycoprotein, binds to LDLR and enhances its lysosomal degradation, resulting in increased plasma LDL concentrations and a higher risk of cardiovascular disease. Genetic defects in LDLR, PCSK9, and apolipoprotein B (apoB), the ligand of LDLR, can cause ADH, but in some ADH-families no mutations can be found in these genes, suggesting that other gene defects may also be involved in ADH. Furthermore, loss-of-function mutations in PCSK9 can greatly reduce plasma LDL levels and lower risk of coronary heart disease by up to ~88%. All these findings have made PCSK9 an attractive target for the treatment of hypercholesterolemia. In the present thesis, which is based on two studies (articles), we investigated protein interactors of PCSK9 (first article, chapter 2) and the effect of PCSK9 on atherosclerosis (Second article, chapter 3). In our first study, mass spectrometry analysis of PCSK9 interacting proteins revealed that Golgi glycoprotein 1 (GLG1) is a novel PCSK9 interactor. Co-immunoprecipitation, Western blotting, and colocalization by confocal immunofluorescence microscopy confirmed that GLG1 is an endogenous PCSK9 binding partner. We also demonstrated that LDLR and apoB interact with GLG1. Using a mouse model, we found lower levels of circulating PCSK9, cholesterol, and triglycerides in Glg1 knockdown mice. Moreover, GLG1 deficiency reduced microsomal triglyceride transfer protein (MTP) activity and induced perinuclear aggregation of apoB, thereby, reducing apoB secretion. In our second study, we developed a mouse model of atherosclerosis to investigate the effect of PCSK9 modulation on the regression of atherosclerotic plaques. We showed that overexpression of a PCSK9 gain-of-function in mouse liver accelerated the development of atherosclerotic lesions in the aortic root, which were then reduced by inducing PCSK9 downregulation using a Tet-on system. In conclusion, we have contributed to the identification of a novel PCSK9 interacting protein, GLG1, which regulates plasma level of cholesterol and represents a potential target for hypercholesterolemia treatment. We also demonstrated that PCSK9 gene modulation directly regulates the level of atherosclerotic plaques in the aortic root. We showed in our study that the wild-type mice, overexpressing PCSK9-D377Y in an inducible manner, is a useful mouse model for understanding the molecular role of PCSK9 on atherosclerotic plaques development. These studies will help to develop effective therapies to reduce hypercholesterolemia and the risk of cardiovascular disease.

L’athérosclérose est un important facteur de risque des maladies cardiovasculaires ischémiques. Cette pathologie est caractérisée par la formation de plaques lipidiques dans l’intima des vaisseaux sanguins. Le récepteur éboueur cluster de differentiation-36 (CD36) est impliqué dans l’internalisation et l’accumulation de lipoprotéines au sein des macrophages qui vont devenir des cellules spumeuses, ce qui est à l’origine de la formation de lésions athérosclérotiques. Notre hypothèse est que les azapeptides, dérivés du peptide de relâche de l’hormone de croissance 6 (GHRP-6), vont interférer avec l’internalisation des lipoprotéines par les macrophages et ainsi réduire la progression des lésions. Nous avons utilisé des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoe-/-) qui ont été traitées quotidiennement par une injection sous-cutanée de 300 nmol/kg de MPE-001 ou de MPE-003. Les effets des azapeptides ont été étudiés sous deux régimes alimentaires, soit le maintien d’une diète enrichie en lipides et en cholestérol (HFHC) pendant la durée de l’étude, ou par une diète HFHC suivie d’une diète normale pendant la période de traitement. Nos résultats montrent que les azapeptides ont réduit la progression des lésions à différents sites aortiques et artériels et induit leur régression au niveau des sinus aortiques du coeur. Ces effets ont été associés à une diminution de médiateurs pro-inflammatoires au niveau plasmatique et à une augmentation des marqueurs caractéristiques des macrophages anti-inflammatoires (M2). Nos travaux ont montré que l’effet athéroprotecteur des azapeptides dépend de la présence du récepteur CD36. Ces résultats appuient le développement de ligands sélectifs du récepteur CD36 dans le traitement de l’athérosclérose. / Atherosclerosis is an important risk factor for the development of ischemic heart disease. This pathology is characterized by the formation of lipid plaques in the intima of the blood vessels. The receptor cluster of differentiation 36 (CD36) is involved in the internalization and retention of lipoproteins within macrophages that will become foam cells, which induce the formation of atherosclerotic lesions. Our hypothesis is that azapeptides, derived from growth hormone release peptide-6 (GHRP-6), will interfere with the internalization of lipoproteins by macrophages and thereby reduce the progression of lesions. We used apolipoprotein E-deficient mice (apoe-/-) which were treated daily with a subcutaneous injection of 300 nmol / kg of MPE-001 or MPE-003. The effects of azapeptides were studied under two diets regimen, the mice were either maintained under a diet enriched in fat and cholesterol (HFHC) for the duration of the study or were given a HFHC diet followed by a normal diet during the treatment period. Our results show that azapeptides reduced the progression of lesions at different aortic and arterial sites and induced their regression in the aortic sinuses of the heart. These effects have been associated with a decrease in pro-inflammatory mediators in plasma and an increase in markers characteristic of anti-inflammatory macrophages (M2). Our work has shown that the atheroprotective effect of azapeptides depends on the presence of the CD36 receptor. These results support the development of selective ligands for the CD36 receptor in the treatment of atherosclerosis.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) represents approximately 25% of all pediatric cancers diagnosed every year. In about 80% of cases, pediatric patients will attain a 5-year event-free survival. Unfortunately, patients who are resistant to treatment or who relapse have a poor prognosis. Hence, novel therapeutic approaches are necessary to increase survival rates. Epigenetic alterations, such as DNA methylation and histone modifications, are involved in disease development, progression, and in particular, resistance to treatment. These reversible alterations represent novel targets in ALL. We recently discovered candidate epigenetic drugs in FDA-approved drug libraries. We performed a secondary screen to test the activity of these drugs in a panel of cancer cell lines. We found that a cardiac glycoside, called proscillaridin A, had anticancer specificity against pediatric leukemia cell lines. Thus, we hypothesize that proscillaridin A has some drug repositioning potential in pediatric ALL. To characterize its epigenetic mechanism of action, we treated two ALL cell lines Nalm-6 (pre-B ALL) and Molt-4 (T-ALL) in vitro for different time points (2-96h) with clinically relevant concentrations of proscillaridin A and analyzed cell growth, cell cycle, gene expression and chromatin modifications. We observed dose-dependent growth inhibition in both cell lines, where 50% of growth inhibition (IC50) was obtained at 3.0 and 2.3 nM in Nalm-6 and Molt-4, respectively. Our results using BrdU staining indicate a cell cycle block in the G2/M phase. By western blot, we detected significant decreases in histone 3 acetylation levels (H3K14ac, H3K9ac, and H3K27ac). Decreases in histone acetylation were associated with a significant reduction in histone acetyltransferase expression (CBP, P300 and TIP60) as well as the CMYC oncogene. By RNA sequencing and gene set enrichment analysis, we observed an upregulation of apoptosis and cell differentiation genes, as well as a decrease in cell proliferation and C-MYC target genes. These promising results illustrate the potential of using the cardiac glycoside proscillaridin A as a novel drug in treatment of relapsed or refractory ALL.

Le neuroblastome pédiatrique est un des cancers extra-crâniens des plus fréquents chez les enfants. Malgré une amélioration du taux de survie avec les thérapies actuellement disponibles, les stades avancés de neuroblastome ou en rechute présentent un très mauvais pronostic. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être développées afin d'augmenter la survie des patients. Une de ces approches est la thérapie épigénétique. Le neuroblastome, comme plusieurs autres cancers pédiatriques, contient plusieurs altérations épigénétiques au niveau de la méthylation de l'ADN et des modifications des histones. Lors d'un criblage de médicaments déjà approuvés par la FDA, nous avons découvert quelques molécules ayant des caractéristiques de médicaments épigénétiques jusqu’alors jamais découvertes. Notre étude cherche donc à démontrer l'efficacité de ces molécules dans le traitement de lignées cellulaires de neuroblastome. Suite à des tests préliminaires, une des molécules approuvées par la FDA s'est démarquée : le disulfirame, un médicament approuvé pour le traitement de l’alcoolisme chronique. Nous avons donc traité des lignées cellulaires de neuroblastomes (IMR-32, N91, SK-N-DZ, SK-N-SH et SK-N-AS ) pendant 48 heures avec du disulfirame à des concentrations pertinentes sur le plan clinique (10nM à 50 µM). Nos résultats démontrent une inhibition de croissance de 50 % (IC50) d'environ 80 nM pour les lignées cellulaires testées. De plus, après analyse par cytométrie de flux, on observe un blocage du cycle cellulaire en G2/M. Nous avons également observé une diminution du facteur de transcription MYCN ainsi qu’une baisse d’acétylation de plusieurs marques d’histones (H3K9ac, H3K14ac, H3K27ac). Une analyse par séquençage d'ARN a confirmé le bloc en G2/M par une baisse d'expression de gènes associés à cette phase ainsi que la diminution de MYCN par une baisse de gènes cible de MYC. Des travaux sont en cours afin de déterminer le mécanisme d’action du disulfirame. Cette recherche permettra d’évaluer l’efficacité du disulfirame dans le traitement du neuroblastome / Pediatric neuroblastoma is one of the most common extracranial cancer in children. Despite an improvement in survival with the currently available therapies, neuroblastoma with an amplification of the transcription factor MYCN has a very poor prognosis. New therapeutic approaches must be developed to increase the survival of patients. One such approach is epigenetic drug therapy. Neuroblastoma, like many other pediatric cancers, contains several epigenetic alterations at the level of DNA methylation and histone modifications. In a screening of FDA-approved drugs, we discovered some molecules having characteristics of epigenetic drugs that were unknown until now. Our study seeks to demonstrate the efficacy of these molecules in the treatment of neuroblastoma cell lines. Following preliminary tests, one of the molecules approved by the FDA stood out: disulfiram, a medication approved for the treatment of chronic alcoholism. We treated neuroblastoma cell lines (MYCN amplified: IMR-32, N91 and SK-N-DZ; MYCN non-amplified: SK-N-AS and SK-N-SH) for 48 hours with disulfiram at clinically relevant concentrations (from 10 nM to 20 µM). Our results demonstrate a 50% growth inhibition (IC50) of 80nM for the cell lines tested. In addition, after analysis by flow cytometry, we found a cell cycle block in G2/M. RNA sequencing also revealed that disulfiram affects a many genes (downregulated n=508, upregulated n=207). We also observed a decrease in the transcription factor MYCN and a reduction in acetylation of several histone marks by Western blot’s analysis. Further studies are underway to determine the mechanism of action of disulfiram. This study shows the potential of disulfiram in the treatment of neuroblastoma.

This thesis represents the culmination of the main project I have undertaken during my master's program. It is important to note that additional data collection and analysis were conducted by intern students under my supervision, which will be integrated into a forthcoming manuscript where I will be credited as the first co-author. Due to space and focus limitations of this thesis, these additional findings have not been included here. / La famille des canaux potassiques à rectification entrante (Kir), exprimée de manière ubiquitaire, repolarise et maintient le gradient de tension à travers les membranes des cellules excitables et non-excitables. Les canaux Kir sont fortement régulés par divers lipides membranaires, tels que les phosphoinositides, les phospholipides anioniques secondaires, le cholestérol, le Coenzyme A (CoA) à longue chaîne et l'acide arachidonique. Kir2.1 est fortement exprimé dans le tissu musculaire strié des cellules cardiaques auriculaires et ventriculaires. Il joue un rôle essentiel dans la régulation du potentiel de membrane au repos et de la contraction des cellules musculaires cardiaques et lisses en générant le courant K+ à rectification entrante (IK1). (IK1). Les mutations de Kir2.1 avec perte de fonction sont à l'origine du syndrome d'Andersen-Tawil (ATS). Par conséquent, l'altération de la fonction de Kir2.1 est un déterminant essentiel au bon fonctionnement du cœur. Les endocannabinoïdes sont une classe spéciale de lipides naturellement exprimés dans une variété de cellules, y compris les cellules cardiaques, neuronales et immunitaires. Le système endocannabinoïde, y compris les récepteurs cannabinoïdes (CBR), agit comme un système de réponse au stress qui s'active. Des études menées chez l'animal et chez l'homme suggèrent que la modulation pharmacologique de ce système pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique. Cependant, ces dernières années, il est devenu clair que si les endocannabinoïdes peuvent déclencher des changements de signalisation en aval par l'intermédiaire des CBR, ils peuvent également interagir directement avec les canaux ioniques indépendamment des CBR pour moduler la fonction cellulaire. Dans cette étude, nous avons utilisé la technique de double électrode en voltage imposé pour examiner les effets d'un panel d'endocannabinoïdes sur la fonction de Kir2.1. Nous avons montré qu'un sous-ensemble d'endocannabinoïdes, mais pas tous, peut réguler la fonction de Kir2.1 à des degrés divers, indépendamment des CBR. Nous avons également démontré que les endocannabinoïdes peuvent également réguler les protéines mutées menant à l'ATS (G144S et V302M). Nous avons également observé que l'effet des endocannabinoïdes n'est pas conservé parmi les membres de la famille Kir, avec des différences observées entre les canaux Kir2.1, Kir4.1 et Kir7.1. Ces résultats pourraient avoir des implications plus larges pour les fonctions des cellules cardiaques, neuronales et immunitaires. Mots clés : Kir2.1, Endocannabinoïdes, LQT7, Rectification entrante, G144S, Kir7.1, Kir4.1 / The ubiquitously expressed family of inward rectifier potassium (Kir) channels repolarizes and maintains the voltage gradient across excitable and non-excitable cell membranes. Kir channels are highly regulated by various membrane lipids, such as phosphoinositides, secondary anionic phospholipids, cholesterol, long chain acyl- Coenzyme A (CoA), and arachidonic acid. Kir2.1 is highly expressed in striated muscle tissue of atrial and ventricular heart cells. It is critically involved in regulating the resting membrane potential and contraction of cardiac and smooth muscle cells through the generation of the current IK1. Loss-of-function mutations in Kir2.1 cause Andersen-Tawil syndrome (ATS). Therefore, altered Kir2.1 function is a critical determinant of proper heart function. Endocannabinoids are a special class of lipids that are naturally expressed in a variety of cells, including cardiac, neuronal, and immune cells. The endocannabinoid system, including cannabinoid receptors (CBRs), acts as a stress response system that is activated. Studies in both animals and humans suggest that pharmacological modulation of this system might represent a novel approach to treatment. However, in recent years, it is becoming clear that while endocannabinoids can trigger downstream signaling changes through CBRs, they can also directly interact with ion channels independently of CBRs to modulate cellular function. In this study, we used the electrophysiology technique called two-electrode-voltage-clamp (TEVC) in combination with mutagenesis studies to examine the effects of a panel of endocannabinoids on the function of Kir2.1. We showed that a subset of endocannabinoids, but not all, can regulate the Kir2.1 function to varying degrees, independent of CBRs. We also demonstrated that endocannabinoids can also regulate mutants linked with ATS (G144S and V302M). We also observed that the effect of endocannabinoids is not conserved among Kir family members, with differences observed between Kir2.1, Kir4.1 and Kir7.1 channels. These findings could have broader implications for cardiac, neuronal, and immune cell functions. Key words: Kir2.1, Endocannabinoids, LQT7, Inward rectification, G144S, Kir7.1, Kir4.1

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Il est important de connaître le métabolisme stéréosélectif du R,S-propranolol car le pouvoir b-bloquant de l'énantiomère S(-) est environ 100 fois plus puissant que celui de l'énantiomère R(+). La stéréosélectivité du métabolisme des énantiomères du propranolol semble dépendante de la voie d'administration. Ainsi, les surfaces sous la courbe des concentrations plasmatiques (SSCp) de l'énantiomère S(-) suivant l'administration orale et l'injection intraveineuse sont 1,48 et 1,17 fois supérieures à celles de l'énantiomère R(+). Deux hypothèses sont proposées dans le but de connaître les facteurs responsables des différences stéréosélectives dans le métabolisme des énantiomères du propranolol. La première hypothèse est basée sur la capacité des organes extrahépatiques à métaboliser les médicaments. Il a été démontré que les poumons, les reins et les cellules épithéliales de l'intestin contiennent des isoenzymes du cytochrome P-450. Suivant une administration orale, la contribution intestinale au premier passage du propranolol est de 43%, alors que son extraction systémique est de 23%. Nous postulons que le métabolisme préférentiel de l'énantiomère R(+) dans la paroi intestinale est, en grande partie, responsable de la stéréosélectivité suivant l'administration orale. La deuxième hypothèse repose sur le fait que la dose atteignant le foie influence la stéréosélectivité du métabolisme des énantiomères du propranolol. En effet, lorsque 0,1 mg/kg ou 5 mg de propranolol sont injectés par la voie intraveineuse, une quantité maximale de 2 à 3 mg atteint le foie. Par contre, lorsque 40 mg ou plus sont administrés par voie orale, le propranolol traverse les cellules épithéliales de l'intestin et, même en tenant compte de la capacité d'extraction de l'intestin, au moins 25 mg atteindront le foie. Afin de déterminer l'effet de la voie d'administration et de la dose sur la stéréosélectivité du métabolisme des énantiomères du propranolol, des lapins conscients ont reçu des doses variables de R,S-propranolol par voie orale (40, 80 et 120 mg/kg) et intraveineuse (0,5 et 10 mg/kg). Des expériences in vitro ont permis de déterminer la capacité des cellules épithéliales de l'intestin, du foie, des poumons et des reins à métaboliser le R,S-propranolol. L'incubation de chaque énantiomère individuellement a permis de déterminer si l'interaction entre les énantiomères ou la saturation du métabolisme d'un énantiomère pourrait influencer la stéréosélectivité du métabolisme. Suivant l'administration orale de 40 mg/kg et l'injection intraveineuse de 0,5 mg/kg, le métabolisme des énantiomères du propranolol n'est pas stéréosélectif. Les doses orales de 80 et 120 mg/kg génèrent une augmentation non-linéaire des SSCp des deux énantiomères et la SSCp du S(-)-propranolol augmente plus rapidement que celle du R(+)-propranolol, signifiant qu'une stéréosélectivité dans le métabolisme des énantiomères du propranolol apparaît lorsque la dose augmente. Suivant l'administration orale de 120 mg/kg, on observe des concentrations plasmatiques de S(-)-propranolol nettement supérieures à celles de son antipode (p < 0,05). L'injection intraveineuse de 10 mg/kg génère également une cinétique d'ordre zéro, mais dans ce cas, les SSCp du S(-)-propranolol sont inférieures à celles du R(+)-propranolol (p < 0,05). In vitro, seuls le foie et la muqueuse intestinale métabolisent le propranolol. Suivant l'incubation de 5,8 et 58 mM de R,S-propranolol dans les cellules épithéliales de l'intestin, les vitesses d'élimination du R(+)-propranolol sont plus rapides que celles du S(-)-propranolol. Aux concentrations de 5,8 mM dans les cellules hépatiques, un métabolisme rapide sans stéréosélectivité est observé. Par contre, suivant l'incubation de 58 mM de R,S-propranolol, une diminution des vitesses d'élimination des deux énantiomères du propranolol et l'apparition d'un métabolisme préférentiel de l'énantiomère R(+) sont notées. Ces résultats suggèrent que la stéréosélectivité de la cinétique des énantiomères du propranolol est dépendante de la dose dans les cellules hépatiques. Par rapport à ces derniers résultats, l'incubation de 2,9 et 29 mM de chaque énantiomère individuellement dans les cellules épithéliales de l'intestin montre que le métabolisme du S(-)-propranolol est saturé. À une concentration de 2,9 mM dans les cellules hépatiques, les vitesses d'élimination de chaque énantiomère sont le double par rapport au mélange racémique, ce qui signifie que les énantiomères d'un mélange racémique inhibent l'élimination de leur antipode. À une concentration de 29 mM, la saturation de l'élimination de l'énantiomère S(-) et l'apparition d'un métabolisme stéréosélectif sont observées. Nous concluons que l'intestin et le foie sont responsables du métabolisme stéréosélectif des énantiomères du propranolol. La stéréosélectivité dose-dépendante dans les cellules hépatiques est principalement responsable de l'élimination préférentielle du R(+)-propranolol observée in vivo chez le lapin. Finalement, ces résultats démontrent que la stéréosélectivité ne dépend pas d'une différence de clairance intrinsèque pour les deux énantiomères, mais de la saturation du métabolisme du S(-)-propranolol.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'amylose réticulé (AR), obtenu suite à la reticulation de l'ami don à haute teneur en amylose par traitement à l'épichlorhydrine, a été introduit au début des années 1990 comme excipient pour la libération contrôlée de médicaments. Divers taux de reticulation de l'amylose peuvent être obtenus en variant le rapport épichlorhydrine / amylose. Les cinétiques de libération de médicaments à partir de comprimés d'AR, en fonction du taux de reticulation du polymère, de la force de compression et de la charge en principe actif ont été étudiés. L'analyse cinétique de la liberation ainsi que l'absence d'une transition polymérique de l'état vitreux à caoutchouteux suggéraient l'implication d'un mécanisme de libération autre que la seule diffusion du principe actif. Une hypothèse d'un mécanisme de libération reposant sur la pénétration de l'eau dans le comprimé provoquant le remplacement des liens amylose-amylose par de nouveaux liens eau-amylose capables de freiner la pénétration de l'eau et la diffusion du principe actif avait été émise. Ce travail constitue la suite logique du développement et de la caractérisation physico-chimique de l'AR utilisé comme excipient pour la préparation de formes à liberation contrôlée de médicaments. La libération de principes actifs peu solubles en milieu aqueux à partir d'une matrice d'AR peut parfois être trop lente et s'effectuer sur plusieurs jours. Pour ces médicaments, la vitesse de libération peut être accélérée en ajoutant une quantité déterminée d'a-amylase dans le mélange pulvérulent d'AR et de principe actif, avant d'effectuer la compression. Une augmentation du contenu en a-amylase dans les comprimés provoque une augmentation marquée de la vitesse de libération et une augmentation de la linéarité des profils de libération, alors que de fortes modifications de la concentration d'a-amylase dans le milieu de dissolution présentent moins d'effet. Pour des concentrations élevées d'a-amylase, l'hydrolyse enzymatique devient le processus prédominant du contrôle de la libération du principe actif. Les profils de libération témoignent de l'influence de deux mécanismes qui régissent le contrôle de libération: i) un gonflement du comprimé accompagné par une diffusion du principe actif et ii) une hydrolyse enzymatique provoquant une érosion du comprimé et une accélération du taux de libération. En-dehors de ses aptitudes pour contrôler la libération de principes actifs, l'AR possède des propriétés liantes et peut aussi devenir un agent de désagrégation. La dureté augmente avec le degré de reticulation jusqu'à un maximum de dureté pour le degré AR-15. Une plus grande proportion d'AR ainsi qu'une augmentation de la force de compression ont pour conséquence d'augmenter la dureté et de diminuer la friabilité des comprimés. La présence de 0.2 % de stéarate de magnésium dans les comprimés contenant de l'AR ne semble pas avoir d'effet sur la dureté et la friabilité. Une étude comparative des propriétés liantes de l'amylose réticulé (AR-8) et de l'amylopectine réticulée à 8 % semble démontrer qu'une augmentation de la teneur en amylose conduit directement à une augmentation de la dureté des comprimés. Les résultats des tests de désagrégation se sont révélés satisfaisants lorsque l'AR 15 est comparé à l'Avicel PH-102®. La vitesse d'absorption d'eau des comprimés augmente lorsque le taux de reticulation de l'amylose augmente suggérant que les propriétés de désagrégation de l'AR (taux de reticulation supérieur à 15 %) soient reliées à une pénétration rapide de l'eau dans les comprimés. La caractérisation de l'AR par analyse d'image a permis de démontrer qu'un gel se forme à la surface des comprimés à base d'amylose réticulé en moins de 10 minutes suivant l'immersion des comprimés dans l'eau. La formation du réseau de gel de la surface vers le centre du comprimé s'effectue progressivement pendant plusieurs heures jusqu'à ce qu'un équilibre de gonflement soit atteint (environ 72 heures). Quelque soit le taux de reticulation, les spectres RMN des comprimés d'amylose réticulé s'apparentent au spectre Va de l'amidon. Suivant l'immersion dans l'eau des comprimés à base d'amylose ayant un faible taux de reticulation, on assiste à la naissance progressive d'un spectre décrivant la forme cristalline de type B de l'amylose caractérisée par la formation de doubles hélices. La gélatinisation, la reticulation et le traitement de l'amidon à haute teneiu- en amylose modifient profondément l'organisation granulaire de l'amidon natif, comme en témoignent les profils de rayons X. Cette modification s'accentue avec l'augmentation du degré de reticulation suggérant que l'hélice simple de l'amylose subit une déformation tant et si bien que la structure devient complètement déformée pour des taux de reticulation très élevés. Les résultats obtenus en FT-IR sont en accord avec les résultats de diffraction de rayons X démontrant que pour les degrés faibles de reticulation, l'association intra- et inter-chaînes d'amylose est favorisée. L'ensemble des études de caractérisation par gonflement, par analyse d'image, par diffraction de rayons X, par FT-IR et par RMN démontrent que la propriété d'excipient pour la libération contrôlée vient, vraisemblablement,de l'habileté de l'amylose de former des gels compacts qui ne s'érodent pas. La gélification s'effectue suite à l'immersion des comprimés dans l'eau et à la transformation de la partie amorphe de l'amylose en une structure thermodynamiquement plus stable constituée d'hélices d'amylose aimelées et arrangées dans une superstructure de type B. La reticulation modérée de l'amidon à haute teneur en amylose implique aussi le greffage des molécules d'amylopectine au sein des longues sections de chaînes d'amylose permettant ainsi l'obtention d'un gel plus souple et élastique, tout en demeurant relativement résistant aux enzymes amylolytiques. L'augmentation excessive du taux de reticulation conduit à la déformation des hélices d'amylose, ce qui a comme conséquence l'inhibition de la réassociation de l'amylose se traduisant par l'augmentation des vitesses de libération des principes actifs. Les temps de libération sont maximaux pour les produits ayant un taux de reticulation modéré ; dans ce cas, les forces de réassociation des chaînes d'amylose seraient parfaitement équilibrées par la souplesse et élasticité du gel résultant de la reticulation impliquant les chaînes d'amylose et d'amylopectine.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le vieillissement de la population fait en sorte que la mortalité liée aux maladies cardiovasculaires et en particulier à la défaillance cardiaque est de plus en plus élevée. Bien que l'atteinte de la perfusion coronarienne soit reconnue comme un facteur favorisant l'apparition des déficits contractiles de la défaillance cardiaque, les mécanismes impliqués dans les dysfonctions coronariennes ont été peu étudiés. La connaissance de ces mécanismes est primordiale pour l'élaboration d'une thérapeutique adéquate permettant de traiter la maladie et d'améliorer la qualité de vie de ces patients. Des controverses existent quant à la contribution de la voie de l'endothéline-1 (ET-1) dans la défaillance cardiaque et son implication dans les déficits coronariens n'a pas été établie. Nous avons donc étudié l'action de l'ET-1 au niveau de la réactivité coronarienne et de la contractilité cardiaque dans un modèle d'insuffisance cardiaque chronique. Des cœurs de hamsters cardiomyopathiques (UM-X7.1) et des cœurs provenant de hamsters syriens normaux âgés de plus de 200 jours ont été utilisés. Les cœurs ont été isolés et perfusés à débit constant (5-10 ml/min) selon la méthode de Langendorff. La pression de perfusion coronarienne (PPC), la pression ventriculaire gauche développée et la fréquence cardiaque furent évaluées. Des courbes dose-réponse de la réactivité coronarienne à l'ET-1 ont été construites pour les cœurs normaux et défaillants. La sensibilité coronarienne à l'ET-1 est similaire pour les deux groupes (EC50) et la réponse maximale était identique. L'infusion du phosphoramidon, du BQ 788 (antagoniste des récepteurs ETB) ou du BQ 123 (antagoniste des récepteurs ETA) ne modifie pas la PPC. Ces observations suggèrent que l'ET-1 n'est pas impliquée dans l'expression des dysfonctions coronariennes observables dans ce modèle de défaillance cardiaque. L'infusion du BQ 788 ne modifie pas la réponse à l'ET-1 exogène, suggérant une implication peu importante des récepteurs ETB dans l'action vasoconstrictrice de l'ET-1. Par contre, la réponse vasoconstrictrice à l'ET-1 est complètement abolie par l'infusion du BQ 123 dans les cœurs normaux tandis que l'addition du BQ 788 est nécessaire pour abolir cette réponse dans les cœurs défaillants. Ces observations suggèrent une implication de l'activation des récepteurs ETB en présence d'un antagoniste des récepteurs ETA ou encore un déséquilibre entre l'activation des récepteurs ETB endothéliaux et musculaires lisses dans les cœurs défaillants. La diminution significative de la contractilité cardiaque observée avec l'utilisation du phosphoramidon et du BQ 123 révèle que l'ET-1 endogène participe au maintien de la contractilité cardiaque. Les récepteurs ETA seraient impliqués dans l'action inotrope de l'ET-1 alors que les récepteurs ETB ne semblent pas importants puisque l'infusion du BQ 788 n'a pas d'effet significatif sur la contractilité cardiaque. Nous suggérons que l'utilisation d'un inhibiteur de la synthèse de l'ET-1 ou d'un antagoniste des récepteurs ETA pourrait comporter un risque pour des patients dont la fonction cardiaque est altérée. Il semble impératif de développer de nouveaux antagonistes de l'ET-1 qui soient vasosélectifs et de la sorte garantir un usage sécuritaire chez ces patients.