Endocytosis is an essential cellular process consisting of the internalization of extracellular cargo and its transport towards different intracellular destinations. Multiple endocytic routes are tailored for the internalization and trafficking of different types of cargo and multiple endocytic organelles provide specialized biochemical environments where different molecular events take place. Membrane receptors and cargo molecules are internalized by both Clathrin-dependent and –independent endocytosis into early endosomes. From here two main endocytic routes are followed: 1) the recycling route, mainly followed by membrane receptor and other molecules like Transferrin, brings the cargo back to the plasma membrane and 2) the degradative route, followed by molecules like Epidermal Growth Factor (EGF) and Lipoprotein particles (LDL), leads the cargo to degradation into late endosomes/lysosomes. In addition to the basic function of intracellular cargo transport, the endocytic system fulfils many other cellular and developmental functions such as transmission of proliferative and survival signals and defence against pathogens. In order for cells to properly perform their various and numerous functions in organs and tissues, the activity of the endocytic system needs to be coordinated between cells and, within individual cells, integrated with other cellular functions. Even though molecules orchestrating the endocytic sorting and transport of different types of cargo have long been investigated, our understanding of the molecular machinery underlying endocytosis and its coordination into the cellular systems remains fragmentary. The work presented in this thesis aimed at understanding how this high-order regulation and integration is achieved. This requires not only a comprehensive analysis of molecular constituents of the endocytic system but also an understanding of the general design principles underlying its function. To this end, in collaboration with several members of the Zerial group and with the HT-Technology Development Studio (TDS) at MPI-CBG, I developed a new strategy to accurately profile the activity of human genes with respect to Transferrin (Tfn) and Epidermal Growth Factor (EGF) endocytosis by combining genome-wide RNAi with several siRNA/esiRNA per gene, automated high-resolution confocal microscopy, quantitative multi-parametric image analysis and high-performance computing. This provided a rich and complex genomic dataset that was subsequently subjected to analysis with a combination of tools such as a multi-parametric correlation of oligo profiles, phenotypic clustering and pathways analysis, and a Bayesian network reconstruction of key endocytic features. Altogether, the genomic endeavour and the subsequent analyses provided a number of important results: first, they revealed a much higher extent of off-target effects from RNAi and provided novel tools to infer the specific effects of genes loss of function; second, they identified a large number of novel molecules exerting a regulatory role on the endocytic system, including uncharacterized genes and genes implicated in human diseases; third, they uncovered the regulatory activity of signalling pathways such as Wnt, Integrin, TGF-β, and Notch, and found new genes regulating the sorting of cargo to a specialized subset of early endosomes that function as intracellular signalling platforms; and fourth, a systems analysis by Bayesian networks revealed that the cell specifically regulates the number, size, concentration of cargo and intracellular position of endosomes, thus uncovering novel properties of the endocytic system. In conclusion, the work presented here not only provided a dataset extremely rich of information whose potential has just begun to be uncovered but also shows how genomic datasets can be used to reveal design principles governing the functioning of biological processes.

The cohesin complex is essential for mitosis and meiosis. The specific meiotic roles of individual cohesin proteins are incompletely understood. We report in vivo functions of the only meiosis-specific STAG component of cohesin, STAG3. Newly generated STAG3-deficient mice of both sexes are sterile with meiotic arrest. In these mice, meiotic chromosome architecture is severely disrupted as no bona fide axial elements (AE) form and homologous chromosomes do not synapse. Axial element protein SYCP3 forms dot-like structures, many partially overlapping with centromeres. Asynapsis marker HORMAD1 is diffusely distributed throughout the chromatin, and SYCP1, which normally marks synapsed axes, is largely absent. Centromeric and telomeric sister chromatid cohesion are impaired. Centromere and telomere clustering occurs in the absence of STAG3, and telomere structure is not severely affected. Other cohesin proteins are present, localize throughout the STAG3-devoid chromatin, and form complexes with cohesin SMC1β. No other deficiency in a single meiosis-specific cohesin causes a phenotype as drastic as STAG3 deficiency. STAG3 emerges as the key STAG cohesin involved in major functions of meiotic cohesin.

Die „donor lymphocyte infusion“ (DLI) stellt eine wirksame Therapieoption für ein Rezidiv bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) dar. Jedoch ist die DLI oft mit einer „graft-versus-host disease” (GvHD) assoziiert, die auf einer proinflammatorischen, gegen den Empfänger gerichteten T-Zell-vermittelten Immunantwort beruht. Eine Strategie, den „graft-versus-leukemia” (GvL)-Effekt zu steigern und dabei das Risiko einer GvHD zu mindern, besteht in dem adoptiven Transfer hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche selektiv AML-assoziierte Antigene erkennen. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit darin, eine neue Strategie zur Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone, welche die Leukämie-assoziierten Antigene (LAAs) Wilms‘-Tumor-Antigen 1 (WT1), Proteinase 3 (PR3), Nucleophosmin 1 (NPM1) und Survivin als attraktive Ziele für spezifische Immuntherapien erkennen, zu entwickeln. Zunächst wurden mithilfe der innovativen Streptamer-Technologie die Frequenzen von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen WT1, PR3, NPM1 und Survivin im peripheren Blut von 10 gesunden HLA-A*02:01+ Spendern analysiert. Auf diese Weise konnten jedoch nur sehr geringe bis keine detektierbaren Frequenzen LAA-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen führten zu dem Schluss, dass AML-Peptid-spezifische CD8+ T-Zellen im Gegensatz zu Virus-spezifischen T-Zellen aufgrund deutlich geringerer Frequenzen nicht direkt aus dem peripheren Blut isoliert werden können. Daher erfolgte die in vitro-Expansion der CD8+ T-Zellen mithilfe von autologen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs). DCs sind als professionelle Antigen-präsentierende Zellen in der Lage, Effektorzellen des adaptiven Immunsystems zu stimulieren sowie deren Expansion zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Protokoll für die Generierung von Fast-MoDCs etabliert. Diese zeichneten sich durch die ausgeprägte Expression kostimulatorischer und Antigen-präsentierender Moleküle, die Sekretion großer Mengen des proinflammatorischen Zytokins IL-12 sowie ein effizientes stimulatorisches Potenzial gegenüber CD4+ T-Zellen aus. Erneute Frequenzanalysen nach zweimaliger in vitro-Stimulation mit Peptid-beladenen Fast-MoDCs mittels ELISpot ergaben einen Anstieg der Frequenzen AML-Peptid-spezifischer CD8+ T-Zellen, insbesondere von WT1126-spezifischen CD8+ T-Zellen. Daraufhin erfolgte die Anreicherung der stimulierten CD8+ T-Zellen mit Spezifität für die vier untersuchten LAAs WT1, PR3, NPM1 und Survivin mittels Streptamer-Technologie. Dabei erzielte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Lymphozyten deutlich höhere Reinheiten als die von CD8+ T-Zellen mit Reaktivität gegen die Peptide PR1169, NPM1283,mut A/D und Survivin95. Aus diesem Grund wurden die weiteren Untersuchungen auf WT1126 als das bisher vielversprechendste der untersuchten Peptide begrenzt. CD8+ T-Zellen von drei gesunden Spendern wurden mit bestrahlten T2-Zellen und Fast-MoDCs, welche mit dem HLA-A*02:01-restringierten Peptid WT1126 beladen waren, stimuliert. Anschließend erfolgte die Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen mittels Streptamer-Technologie. Bereits nach einmaliger Stimulation kam es zu einer deutlichen Anreicherung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zellen, welche effektiv in der Lage waren, Peptid-beladene Zielzellen zu lysieren. Jedoch konnte nach zweimaliger Stimulation nochmals eine deutliche Steigerung in Reinheit und Ausbeute erzielt werden. Die angereicherten Zellen wurden als Effektor-Gedächtnis-T-Zellen charakterisiert. Ausgehend von den Streptamer-isolierten CD8+ T-Zellen eines Spenders erfolgte die Generierung WT1126-spezifischer CD8+ T-Zell-Klone. Im Rahmen der Klonierung wurden 32 WT1126-spezifische CD8+ T-Zell-Klone generiert. Drei vielversprechende Klone wurden genauer hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Diese exprimierten hoch-avide T-Zell-Rezeptoren und zeigten einen heterogenen Phänotyp von zentralen Gedächtnis-T-Zellen hin zu terminal differenzierten Effektor-Gedächtnis-T-Zellen. Zudem führten sie zu einer effizienten Lyse der HLA-A*02:01+ und WT1+ Zelllinien T2 und SET-2. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass die untersuchten Klone auch HLA-A*02:01- und WT1-exprimierende primäre Blasten von AML-Patienten effektiv lysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Streptamer-basierte Anreicherung stimulierter Tumorpeptid-spezifischer CD8+ T-Zellen vor anschließender Klonierung eine geeignete Strategie für die Generierung hoch-avider CD8+ T-Zell-Klone mit anti-tumoraler Aktivität darstellt. So generierte CD8+ T-Zell-Klone mit Reaktivität gegen AML-assoziierte Antigene können für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien zur Therapie eines Rezidivs bei AML-Patienten nach allogener SZT verwendet werden.

This work was performed in the framework of an interdisciplinary graduate program that focuses on the establishment and extension of innovative compounds for the packaging of electronic systems. Such chemically or biotechnologically tailored compounds can be used for the direct patterning of optically, magnetically or biologically functional structures in nano- and biotechnical products. In order to organize matter at the nanometer scale, imprinting litho-graphy techniques or self-organization processes are appropriate. Fine-tuning of numerous engineering processes requires continuous and high precision monitoring as well as control of diverse parameters. These demands are only partially met by physical or chemical components since they use surrogate parameters, measure off-line, or provide insufficient performances. Biological compounds, in particular protein-based feedback systems, fulfill certain system requirements to a considerable degree. Hydrophobins and S-layer proteins are surface active proteins, produced by filamentous fungi or bacteria. In nature, these (self )assembly proteins form highly ordered and robust structures. In addition, their tolerance for different sequence manipulations and chemical modifications allows extensive functionalization of these nanometer-sized proteins. Hence, these surface active proteins can also be fused with other protein domains to create chimera, which retain function of both original proteins. In conclusion, both hydrophobins and S-layer proteins represent a versatile tool in numerous fields of applied biotechnology, medicine or diagnostics. But until now, efficient in vitro operation in molecular designed protein coatings is strongly restricted due to their complex assembly mechanism. In the first phase of this work, it was demonstrated, that representatives of class I and class II hydrophobins tend to form multilayered structures on solid surfaces. It was found that only two protein orientations seems to be preferentially formed. In the process of assembly, the orientation of the first hydrophobin layer strictly depends on the substrate wettability. Consequently, each of the following hydrophobin layers is inverse oriented to the layer before. This alternating assembly mechanism has to be taken into account, when working with functionalized hydrophobins, because a hydrophobin-fused functional protein domain is exclusively located on one side of the protein. Due to the densely packed structure of surface active proteins, a fused functional domain, embedded between two hydrophobins is barely available for external reagents. Basically, the simultaneous existence of a broad spectrum of ordered and disordered assembly structures, demonstrated the need of an uniform protein film assembly for applications in fine-diagnostics or biomedicine. With regard to molecular designed protein coatings, this work further aimed at establishing conditions to develop a method for a ‘layer-by-layer’ assembly of protein chimeras. Based on their amphiphilic character, self-assembly behavior of surface active proteins can be influenced by conventional ionic surfactants. In order to study the effect of surfactants on the composition and morphology of adsorbed protein films, contact angle measurements, nulling ellipsometry, SEM, AFM and AFAM were performed. It was found that the layer thickness of assembled protein films is strictly dependent on the amount of added surfactant. At certain threshold surfactant concentrations, hydrophobins and S-layer proteins assemble in uniform layers, which are as thick as expected for a protein monolayer or a bilayer. Assembled protein films are covered by a smooth surfactant layer, which prevents further protein assembly. AFAM measurements reveal the formation of well defined lattice structures under the coverage of surfactants. Even the removal of the surfactant layer is possible without inter-fering with protein specific secondary structures. Solvent accessibility and functionality of protein-fused domains was successfully demonstrated. As compared to conventional assembly techniques, this novel protein deposition method offers a possibility for a ‘directed’ protein coating on solid surfaces. In addition, it guarantees broadly ranged homogeneous assembly of protein chimeras on non-planar or even porous surfaces independent of their position. Finally, a prototype for an interfacial FRET was developed in a close collaboration with the Institute of Physical Chemistry (TUD). This innovative FRET between semiconducting nano-particles and illuminating protein chimeras takes place across an oil/water interface. Hydro-phobins were used to stabilize artificial oil droplets in aqueous solution. These small proteins possess the ability to attach fused functional domains very close to an oil/water interface. When, in addition to this, an optically active nanostructure directly docks to the hydrophobin, the distance of a protein-fused domain and the nanostructure are in the range of the FÖRSTER radius. It was successfully demonstrated that quantum dots and fluorescent proteins fulfill the spectroscopic requirements of such a donor/acceptor pair. The FRET performance of these excitable oil droplets was examined as a ‘proof of concept’. Due to its modular design, this signal amplification setup could be exploited in numerous fields of technical application ranging from quantification of micronutrient to photothermal cancer therapy.

Das Neuroblastom (NB) zählt zu den therapieresistentesten Tumoren des Kleinkindalters. Besonders NB-Patienten mit MYCN-Amplifikation sind mit einer schlechten Prognose konfrontiert. Neuere Studien legen nahe, dass eine spezifische aktive Immuntherapie gegen MYCN ein vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung dieser malignen Erkrankung darstellen könnte. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde ein sogenanntes Minigen-Vakzin, welches für drei ausgewählte Epitope aus der MYCN-AS-Sequenz kodiert, generiert. Die Auswahl der Minigen-Epitope erfolgte mit dem MHC-Liganden-Vorhersageprogramm syfpeithi, welches drei starke H2-Kk-Liganden lieferte. Außerdem wurden zwei weitere Vakzine hergestellt: als Negativkontrolle MYCNLow, dessen MYCN-Peptide laut syfpeithi schlechte MHC-Klasse-I-Liganden darstellen und ein cDNA-Vakzin auf Basis der gesamten MYCN-cDNA-Sequenz. Zur Applikation der Vakzine wurden attenuierte Salmonella typhimurium SL7207 verwendet, die eine zusätzliche Stimulierung des mukosalen Immunsystems hervorrufen. Für die Untersuchung der Impfstoffe in vivo wurden zwei neuartige immunkompetente NB-Mausmodelle etabliert. Dazu wurden die syngenen NXS2/C1300 A/J-Mausmodelle soweit modifiziert, dass sie über eine induzierbare MYCN-Expression verfügten. Nach Auswahl und Charakterisierung geeigneter Transfektanten in vitro und in vivo wurde in diesen Modellen die Wirksamkeit der Vakzine untersucht. In diesen Versuchen konnte mit Hilfe der Vakzine das Primärtumorwachstum von NXS2-MYCN in geimpften Tieren signifikant im Vergleich zu Kontrollen reduziert und die Metastasierung durch C1300-MYCN Zellen signifikant verzögert werden. Mit den in-vivo-Versuchen anschließenden Analysen wurde schließlich bewiesen, dass die Immunantwort durch tumorinfiltrierende MYCN-spezifische zytotoxische CD8+ T-Zellen vermittelt wird. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine MYCN-DNA-Vakzinierung erfolgreich zur Behandlungen MYCN-exprimierender NB im Mausmodell eingesetzt werden kann. / High-level expression of MYCN protein caused by amplification of the gene characterizes a malignant phenotype of neuroblastoma (NB). Recent studies suggest that MYCN might be a promising target for immunotherapy. Therefore, we investigated the efficacy of three MYCN-specific DNA vaccines. Two minigene vaccines were generated; each encoded for three selected epitopes of the MYCN protein sequence with the highest, or as a control lowest, predicted affinity to MHC-Class-I Molecules. The third vaccine based on the cDNA of MYCN. Salmonella typhimurium SL7207 were used as oral application vehicle for the vaccines in in vivo experiments to induce an additional stimulation of the immune system. To investigate the immunotherapeutic approach NXS2- and C1300-cells syngeneic to immunocompetent A/J-mice were stably transfected with a tetracycline inducible vector system coding for MYCN. The transfectants were characterized and established in vitro and in vivo. In the MYCN-overexpressing models vaccination with the MYCN-DNA-vaccines resulted in significant reduced primary tumor growth or decelerated metastasis spread. The immune responses in the in vivo experiments followed by orally applied MYCN-DNA vaccines was mediated by tumor infiltrating cytotoxic CD8+ and CD4+ T cells. MYCN specificity of infiltrating lymphocytes was verified by MYCN-specific cytolytic activity and IFN-gamma secretion ex vivo. Finally, we showed that blocking of MHC-class I molecule H2-Kk approbated cytotoxicity mediated by CD8+ T cells, indicating MYCN specificity of the induced immune response. In summary, we showed that a MYCN based DNA vaccination strategy is effective against MYCN-expressing NB in vivo. In light of the description of MYCN-specific T cells in NB patients, the lytic action of autologous T cells on MYCN-expressing cells and the results of this study underline the possible potential of an active immunotherapy against MYCN as an alternative therapeutic approach to treat NB.

Knochen ist ein multifunktionales Organ und zugleich ein biologisches Material. In dieser Arbeit wird der Heilungsverlauf eines Knochenbruchs (als biologisches Material) näher untersucht mit Hilfe von Computermodellen. Im menschlichen Körper kommt es nach einem Bruch zu einer vollständigen Regeneration des Knochens, ohne dass eine Narbe nach der Heilung zurückbleibt. In grob 10% der Frakturen kommt es jedoch zu Komplikationen bis zu einem Nicht-Heilen des Bruches. Das Ziel von intensiver interdisziplinärer Forschung ist es daher, nicht nur die medikamentöse Behandlung solcher Komplikationen zu verbessern, sondern auch durch externe, biophysikalische Stimulation die Heilung anzuregen. Gewöhnlich heilt ein Knochenbruch nicht direkt (Primäre Knochenheilung), das heißt durch Bildung von neuem Knochen im Knochenspalt, sondern über Sekundäre Knochenheilung. Während der sekundären Heilung bildet sich vorübergehend zusätzliches Gewebe außerhalb des Frakturspaltes, der so genannte Kallus, der die Aufgabe hat, den Bruch zu stabilisieren. Im Kallus werden im Laufe der Heilung verschiedene Gewebearten gebildet (z.B. Bindegewebe, Knorpel und Knochen). Die Gewebe werden von spezialisierten biologischen Zellen gebildet. Die spezialisierten Zellen entwickeln sich aus mesenchymalen Stammzellen (d.h. sie differenzieren), die in den Kallus wandern. Hauptziel der Arbeit ist das bessere Verständnis der mechano-biologischen Regulation der Gewebeformation während der Heilung eines normalen Knochenbruches. Dazu wurden Computersimulationen durchgeführt und mit experimentellen Daten eines Schafmodels verglichen. / Bone is a multifunctional organ, a biological material and is able to fully restore bone fractures without leaving a scar. However, in about 10% of the bone fractures, healing does not lead to a successful reunion of the broken bone ends. Intensive interdisciplinary research therefore looks for new ways to promote healing not only by medication, but also by external biophysical stimulation. Usually, bone fractures do not heal by a direct bridging of the fracture gap with newly formed bone (primary bone healing). Instead, secondary bone healing proceeds indirectly via the formation of an external callus (additional tissue). Within the callus, intricate tissue type patterns are formed, which evolve during the healing progression. Stem cells differentiate into specialized cells, which lay down different tissues such as fibrous tissue, cartilage and bone. This cell differentiation can be biophysically stimulated, e.g. by mechanical deformation of the cytoskeleton. The main aim of this thesis was to connect the microscopic cell response to mechanical stimulation with the macroscopic healing progression. Simple rules for cell behaviour were implemented in a computer model, the progression of healing was simulated and the outcome of the simulations was compared to results from animal experiments. In comparison to existing simulations of bone healing, this study approached the problem from a more physical viewpoint and linked experimental in vivo data and computer modelling.

Angiopoietin-2 (Ang-2) wirkt gefäßdestabilisierend und ist Voraussetzung für das Aussprossen von Gefäßen am Anfang der angiogenen Kaskade. Die Expression des Antagonisten der endothelialen Rezeptor-Tyrosin-Kinase Tie-2 ist streng gewebsspezifisch reguliert. Trotz des Zusammenhangs von Ang-2 und pathologischer Angiogenese sind die molekularen Mechanismen der ang-2 Regulation noch unverstanden. Mittels Microarray wurden die genomweiten Expressionsänderungen in endothelialen Zellen nach Behandlung mit dem demethylierenden 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-dC) untersucht. Unter den induzierten Genen wurde ang-2 mit dem Fokus auf angiogeneserelevante Gene identifiziert. Obwohl die Endothelzellen unter Kontrollbedingungen ang-2 exprimieren, wurde die Expression durch Demethylierung weiter gesteigert. Es wurden jedoch keine potentiellen CpG-Inseln in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts identifiziert. Diese Daten lassen auf einen methylierungsunabhängigen Effekt von 5-Aza-dC auf die ang-2 Expression schließen. Zur molekularen Untersuchung der ang-2 Expression wurden 3kb der 5´-flankierenden Sequenz des humanen ang-2 Gens kloniert und der Transkriptionsstartpunkt (TS) bestimmt. Durch funktionelle 5´-Deletionsanalyse und zielgerichtete Mutagenese wurden regulatorische Promotorelemente identifiziert. Die Promotorregion -105 bis +51 relativ zum TS war ausreichend für die Vermittlung der basalen ang-2 Expression. Mittels Bindungsstudien wurden die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 als Proteine, die primär an den ang-2 Minimalpromotor binden, identifiziert. Die Basen -78 bis -74 relativ zum TS sind eine essentielle Sp-Bindestelle für die Regulation der ang-2 Expression. Durch Mutation von potentiellen Bindungsstellen für Proteine der ETS-Familie wurde die ang-2 Promotoraktivität signifikant reduziert. Jedoch konnte die Spezifität von ETS-Proteinen in Bindungsstudien nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben neue Einblicke in die ang-2 Regulation offenbart und zeigen, dass die Sp1/Sp3-abhängige Aktivierung des proximalen Promotorbereichs (-105/-56) entscheidend für die transkriptionelle ang-2 Regulation in Endothelzellen ist. / Angiopoitein-2 (Ang-2) acts destabilizing on blood vessels and is mandatory for the onset of the angiogenic cascade. The expression of the antagonistic ligand of the endothelial cell tyrosine kinase receptor Tie-2 is tightly regulated. Despite the accumulating evidence confirming the involvement of Ang-2 in pathologic angiogenesis, the molecular mechanisms controlling ang-2 expression are still unclear. Using microarray analysis, the global changes of gene expression were investigated after treatment of endothelial cells with the demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (5-aza-dC). Focusing on angiogenesis related genes, ang-2 was identified among the upregulated ones. Although endothelial cells expressed ang-2 under control conditions already the expression was further increased by drug-induced demethylation. A screen for CpG-islands revealed no putative islands surrounding the transcription initiation site. These data indicate a methylation-independent effect of 5-aza-dC on the ang-2 expression. To elucidate underlying molecular mechanisms of ang-2 expression, 3kb of the human ang-2 gene were cloned and the transcription start site (TS) determined. Regulatory promoter elements were identified by functional 5’-deletion analysis and site-directed mutagenesis. The promoter region -105 to +51 relative to TS was recognized as sufficient and necessary for the ang-2 gene transcription. Electrophoretic Mobility Shift Assays revealed Sp1 and Sp3 as dominant nuclear proteins binding to the ang-2 promoter. The region spanning -78/-74 was identified as essential Sp1/3 site regulating ang-2 expression. The mutation of potential ETS-binding sites resulted in a significant decrease of ang-2 promoter activity. However, the binding of ETS-proteins could not be confirmed by means of EMSA. The results of this thesis revealed new insights of ang-2 regulation and strongly suggest that Sp1/Sp3-dependent activation of an upstream enhancer at -105 to -56 is crucial for the regulation of ang-2 expression in endothelial cells.

Hintergrund: In einer Vielzahl von Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass malignes Wachstum nach Laparotomie deutlich gesteigert sein kann. Die Mechanismen, welche dieser Beobachtung zugrunde liegen sind bisher nur ungenügend erforscht. Die Schwere des chirurgischen Traumas durch Verletzung der Bauchwand kann mit postoperativer pulmonarer Dysfunktion korrelieren und Änderungen im Hämostasesystem hervorrufen. Durch diese Beeinflussung von Organsystemen und funktionellen Systemen könnten intra- und/ oder postoperativ Bedingungen entstehen, welche das Wachstum pulmonaler, hämatogener Metastasen begünstigen. Die Hypothesen der vorliegenden Studie waren: (a) eine Reduktion des chirurgischen Traumas und (b) die Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen die malignen Zellen führen zu einer signifikant geringeren pulmonalen Metastasierung. Beide Hypothesen wurden im Tiermodel getestet. Die Tumorzellen wurden intravenös verabreicht und bildeten pulmonale Metastasen. Methodik: In Studie 1 wurde die Inzidenz von Lungenmetastasen nach Laparotomie (OP) oder Anlage eines CO2 Pneumoperitoneums bestimmt. Insgesamt 60 Tiere wurden in 3 Gruppen aufgeteilt (n=20/Gruppe): Kontroll-Gruppe, Laparoskopie-Gruppe und Laparotomie-Gruppe. 1 x 105 TA3Haushka Adenocarcinom-Zellen wurden direkt im Anschluss an den Eingriff intravenös verabreicht. In Studie 2 wurde die Wirkung einer perioperativen Immunstimulation auf die Entstehung pulmonaler Metastasen untersucht. Insgesamt 100 Tiere wurden in 5 Gruppen aufgeteilt (n=20/Gruppe): Kontroll-Gruppe, Laparotomie-Gruppe (OP), OP + Monophosphoryl Lipid A (MPLA), OP + lysierte Tumorzellen (LTC), OP + MPLA + LTC. Das Vakzine bestand aus 5 x 105 lysierten TA3Ha Tumorzellen (LTC) und wurde fünfmal präoperativ und einmal postoperativ verabreicht. Monophosphoryl Lipid A, ein nichttoxisches Lipopolysaccharid-Derivat wurde in der OP + MPLA Gruppe als Immunstimulans und in der OP + MPLA + LTC Gruppe als Adjuvans verwendet. Allen Versuchstieren wurden analog zu Studie 1 105 TA3Haushka Adenocarcinom-Zellen direkt im Anschluss an den Eingriff verabreicht. Am 14. postoperativen Tag wurden die Tiere getötet, die Lungen entnommen und die Anzahl der pulmonalen Metastasen bestimmt. Ergebnisse: Studie1: Verglichen mit der Kontroll- und Laparoskopie-Gruppe entwickelten die Tiere der Laparotomie-Gruppe signifikant mehr Lungenmetastasen. Zwischen Kontroll- und Laparoskopie-Gruppe bestand kein statistischer Unterschied. Studie 2: Die Tiere der OP + LTC Gruppe und OP + LTC + MPLA Gruppe zeigten signifikant weniger pulmonale Metastasen im Vergleich zur OP Gruppe allein. Nur 30% der Tiere der OP + LTC + MPLA Gruppe entwickelten Lungentumoren. Im Gegensatz dazu traten bei 100% der Tiere der OP Gruppe Lungenmetastasen auf. Zusammenfassung: Das operative Trauma einer Laparotomie war assoziiert mit einer deutlich gesteigerten Inzidenz pulmonaler Metastasen. Die Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen die intravenös verabreichten Tumorzellen bewirkte eine deutlich geringere Anzahl pulmonaler Metastasen. / Background: Subcutaneous tumor growth and establishment is increased after laparotomy; significantly smaller increases have been noted after CO2pneumoperitoneum (CO2 pneumo). Less is known about the impact of surgery on the fate of blood borne tumor cells. The extent of surgical abdominal wall trauma also correlates with the extent of early postoperative pulmonary dysfunction and changes of the haemostasis. These changes may favor lung metastases (mets) formation. This study's hypotheses were: (a) a reduction in surgical trauma or (b) a specific immune up-regulation would limit lung mets formation. An intravenous tumor cell injection lung met model was used to test these hypotheses. Methods: Study 1 determined the incidence of lung mets after sham laparotomy (OP) and CO2 pneumo. Three groups were studied (n=25/group): Anesthesia control (AC), CO2 pneumo, and OP. 1 x 105 TA3Haushka adenocarcinoma cells were inoculated via tail vein injection into all mice immediately after surgery. Study 2 determined the impact of perioperative immunomodulation on lung mets formation. Five groups were studied (n=20/group): AC, OP, OP + Monophosphoryl Lipid A (MPLA), OP + lysed tumor cells (LTC), or OP + MPLA + LTC. The vaccine consisted of 5 x 105 lysed TA3Ha tumor cells (LTC) and was given 5 times preop and once postop to the vaccine groups. MPLA, the nontoxic moiety of lipopolysaccharide, was used both as a vaccine adjuvant in the OP + MPLA + LTC group and as a nonspecific perioperative immune up-regulator in the OP + MPLA group. Five periop injections of MPLA were given to the OP + MPLA group. All mice were given tail vein injections of tumor cells after surgery. Fourteen days after surgery all mice were sacrificed, the lungs transected en bloc, and India ink injected into the trachea. The lungs were placed in Fekete's solution to counterstain the tumor foci white. The number of surface lung metastases was determined by two blinded observers, separately. Results: In Study 1, there were significantly more lung tumors in the OP group than the AC group or the CO2 Pneumo group.There were no significant differences in the number of metastases between the AC and the CO2 Pneumo groups or in the incidence of animals in each group with 1 or more lung mets. In Study 2 significantly fewer metastases were noted for the Op + LTC group and the OP + LTC + MPLA group when compared to the OP group. Significantly fewer of the OP + LTC + MPLA group mice developed one or more lung tumors than in the OP, OP + MPLA, and the OP + LTC groups. Conclusions: Full sham laparotomy was associated with more postoperative lung metastases than CO2 pneumo or anesthesia alone in this murine model. Up-regulation of the immune system in the perioperative period with lysed tumor cells, alone or in combination with MPLA, resulted in significantly fewer postoperative lung metastases.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Verständnis und der Erkenntnis von Erdbeben. Es ist der Versuch, sich diesem Naturereignis anzunähern und es auf unterschiedliche Weisen zu begreifen: (i) Was eigentlich ist ein Erdbeben? Was macht es aus? Worin besteht seine Faszination? (ii) Wie wurden und werden Erdbeben in der europäischen Text- und Bildtradition dargestellt? (iii) Welches Verhältnis besteht zwischen der Form der Darstellung und dem Inhalt 'Erdbeben'? Wie verändert sich das Phänomen, wenn die Darstellungsform sich verändert? (iv) Und schließlich: welche Form scheint am geeignetsten, um Erdbeben darzustellen? Um diesen Fragen nachzugehen, untersucht die Arbeit 16 Beispiele auf das ihnen immanente Verhältnis von Form und Inhalt. Die Beispiele werden dabei so ausgewählt, daß sich ein möglichst breites formales Spektrum ergibt: Neben den heute üblichen Formen der Erdbebendarstellung, die am Beispiel der Reaktion auf das Erdbeben von Kobe behandelt werden (§ 13 Seismologischer Artikel, § 14 Pressemeldung, § 15 Erdbebensimulator im Natural History Museum, London), beschäftigt sich die Arbeit mit Beispielen sowohl aus der griechischen Tradition (§ 1 Poseidon-Mythos, § 2 Aristoteles' 'Meteorologica'), als auch aus der römischen (§ 3 Senecas 'Naturales Quaestiones', § 4 'Aetna'), als auch aus der christlichen (§ 5 'Bibel', § 6 Thomas von Aquins Aristoteles-Kommentar, § 7 Apokalypse-Illustrationen aus dem Hochmittelalter); desweiteren wird eine Gruppe von Darstellungen untersucht, die nach dem Erdbeben von Lissabon 1755 entstanden sind (§ 8 Bänkellieder, § 9 Voltaire, § 10 Kupferstiche von Le Bas, § 11 Kant, § 12 John Michell). Am Ende der Sammlung wird der Science-Fiction Roman 'Richter 10' von Clarke und McQuay (§ 16) näher betrachtet. In einem abschließenden Resüme beklage ich, daß die Form naturwissenschaftlicher Darstellung unsinnlich und verfügend ist. Die Dissertation soll daher in einen Gegenentwurf münden, und so reflektiert das letzte Kapitel (§ 17) die Erfahrung der 16 vorangegangen. Ich schlage hier die Transponierung der Erdbewegung in das Akustische vor und führe dies exemplarisch für ein Beben aus Chile von 1994 durch. Eine Reihe weiterführender Überlegungen zeigt, daß über die formale Dimension hinaus die akustische Transformation auch inhaltlich vielversprechend ist: Weitab vom naturwissenschaftlichen mainstream nämlich bringt diese ganz neue Form die Möglichkeit mit sich, die Frage der Erdbebenprognose auf ungewohnte Weise zu stellen, und somit tut sich hier parallel zu einer neuen Darstellungsform auch ein neues Forschungsfeld auf. / The dissertation in hand is engaged in the understanding and cognition of earthquakes. Essentially it is the attempt to draw near the natural phenomenon and to broaden our conception of it: (i) What actually is an earthquake? What makes it up? Why might it be fascinating? (ii) How were and how are earthquakes depicted in the textual and pictoral tradition in Europe? (iii) How is the form of depiction related to the content 'earthquake'? How does the phenomenon change when the form of depiction is altered? (iv) And last not least: which form seems to be most suitable for the depiction of an earthquake? According to the above questions 16 'earthquake-depictions' are sampled to investigate the relation between form and content. The attempt is made to provide a collection of great diversity in form: Today's usual manner of earthquake depiction is represented by the reaction, the earthquake of Kobe has received (§ 13 seismological article, § 14 press releases, § 15 earthquake simulator in the Natural History Museum London); then there are chosen: two samples of the Old Greek tradition (§ 1 myth of Poseidon, § 2 Aristoteles' 'Meteorologica'), further two from the Roman tradition (§ 3 Seneca's 'Naturales Quaestiones', § 4 'Aetna'), and two from the Christian tradition (§ 5 'Bible', § 6 Thomas Aquinas on Aristotle's 'Meteorologica'); furthermore there are some samples looked upon that show reaction on the Lisbon earthquake of 1755 (§ 8 shocking ballads, § 9 Voltaire, § 10 copper engravings of Le Bas, § 11 Immanuel Kant, § 12 John Michell). Last not least the science fiction novel 'Richter 10' by Clarke and McQuay (§ 16) is examined. Finally I complain that the manner of scientific depiction is 'un-sensual' and disposing. Therefore the dissertation is meant to flow into a counter-project. The last chapter scrutinizes the experience of the investigations before under a wider angle. In consequence I suggest to investigate an acoustical transponation of the earth's movements. An example of the new kind of sound that emerges from that is drawn from a 1994 earthquake in Chile. A range of further considerations show that not only the form of the acoustical transformation seems promising but also its content: far from the mainstream of seismological research the new acoustic form renders the question of earthquake prediction in a unusual but new and fairly easy way. All of this results in me hoping that the releasing of this new form of depiction triggers of a new field of scientific research at the same time.

LIDAR es un acrónimo de LIght Detection And Ranging. En la presente tesis, se usan técnicas basadas en lidar elástico para monitorizar la atmósfera remotamente y derivar información cuantitativa acerca de sus parámetros ópticos. Esta tesis doctoral comprende el diseño y operación de una estación lidar elástica basada en un láser pulsado de Nd:YAG operando a las longitudes de onda de 1064 y 532 nm, en lo que se refiere a los sistemas de recepción, control y diseño de algoritmos de inversión. Básicamente, puede dividirse en tres partes bien diferenciadas: La primera (Caps. 1, 2 y 3) comprende el estudio de la dispersión elástica (Rayleigh y Mie) en la atmósfera, orientada al cálculo del balance de enlace, e intenta vislumbrar la interrelación entre variables físicas tales como la temperatura, la presión y la humedad, y el fenómeno de dispersión, dejando de lado su posible extrapolación a modelos meteorologicos. Partiendo de esta base, se estiman valores de extinción y retrodispersión para diferentes condiciones atmosféricas y, como resultado, se presenta un balance de enlace para el sistema. El mismo incluye el estudio del alcance lidar, la estimación de la relación señal a ruido, y la evaluación de fotodiodos para diferentes librerías del usuario. Esta primera parte se cierra con las especificaciones globales del sistema. La segunda parte de este trabajo (Caps. 4, 5 y 6) atiende al diseño e implemen-tación del receptor, sistemas de sincronización y control. El receptor optoelectrónico se basa en amplificadores realimentados en corriente y cuenta con un excelente producto ganancia ancho de banda. Por lo que respecta al subsistema de sincronismo, se presentan dos unidades distintas con vistas a un futuro sistema lidar de escaneo, lo cuál ofrece la posibilidad de realizar scans entrelazados. Para terminar, el sistema de control diseñado se basa en el software de control LabView, que ofrece una filosofía de control distribuido. Con este propósito, se han especificado e implementado protocolos de bus lidar y su señalización para la presente estación lidar. Finalmente, la tercera parte comprende el diseño de algoritmos de inversión con y sin memoria (Caps. 7 y 8). Los algortimos sin memoria para atmósferas homogéneas se basan en procedimientos de ajuste por regresión como son el método de la pendiente y el de mínimos cuadrados y, en el caso de atmósferas inhomogéneas, se basan en el método de Klett y calibraciones adecuadas. Los algortimos con memoria se basan en diferentes modelos estocásticos para la atmósfera y filtrado de Kalman no lineal. Además de los algortimos de inversión, también se calculan y discuten las curvas del error de inversión. El Cap. 9 describe las medidas llevadas a cabo con el sistema que este trabajo ha permitido construir así como el resultado de aplicar los algoritmos de inversión presentados en los capítulos precedentes. La inversión de escenas reales comprende estudios de la estructura de polución, estudios de nubes (ceilometría, básicamente desplazamiento y estructura de las nubes) y señala posibles fuentes de error en el factor de solapamiento. / LIDAR is an acronym of LIght Detection And Ranging. In the present case, the elastic lidar techniques are used to remotely sense the atmosphere and to derive quantitative information about its optical parameters.This thesis comprises the design and operation of an elastic lidar station based on a pulsed Nd:YAG laser operating at the 1064- and 532-nm wavelengths, in the parts concerning receiver, control systems, and inversion algorithms.Basically, it can be divided in three different parts: The first one (Chaps. 1, 2, and 3) encompasses the study of the elastic scattering (Rayleigh and Mie) in the atmosphere for link-budget purposes and gives some insight into the interweaving between physical variables such as temperature, pressure and humidity, and the scattering phenomena, letting apart any possible extrapolation to meteorological models. From this basis, extinction and backscatter figures for different atmospheric conditions can readily be assessed and, as result, a system link budget is presented. This includes lidar range study, signal-to-noise ratio assessment, and photodiode evaluation from custom-made libraries. At the end of the first part, the system specification is made. The second part of this work (Chaps. 4, 5, and 6) is concerned with the design and implemen-tation of receiver, synchronization, and control systems. The optoelectronic receiver is based on current-feedback amplifiers and features a very large gain-bandwidth product. As for the synchronization subsystem, two different units are presented with a view to a future scanning lidar system, which makes room for interspersed scans. Eventually, the control system designed is LabView based and features a distributed control philosophy. For that purpose, lidar bus protocols and signals are specified and built for the actual lidar station. Finally, the third part encircles the design of inversion algorithms with and without memory (Chaps. 7 and 8). Non-memory algorithms for homogeneous atmospheres are based on regression curve-fitting procedures, such as the slope-method and the least squares while in instances of inhomogeneous atmospheres they are based on Klett's method and appropriate calibrations. Memory algorithms are based on different stochastic models for the atmosphere and on non-linear Kalman filtering. In addition to these inversion procedures, error assessment plots are also derived and discussed. Chap. 9 describes the measurements carried out with the system this work has contributed to build and the results of applying to them the inversion algorithms discussed in the preceding chapters.The inversion of live-scenes involves pollution structure studies, cloud studies (ceilometry, cloud motion and wave clouds, basically), and hints overlap factor error sources.