Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002, JMB, 317, 401) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin alpha/beta abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin alpha/beta abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2, eine non-ATPase Untereinheit sowie eine ATPase Untereinheit des Base Komplex, funktionelle cNLS beherbergen. Die Deletion der Rpt2 NLS führte zur wt Lokalisation der proteasomalen Subkomplexe. Die Deletion der NLS in Rpn2 dagegen bewirkte eine verschlechterte proteasomale Funktion und eine Mislokalisation der Komplexe. Unsere Daten unterstützen ein Modell wonach die nukleären 26S Proteasomen aus Subkomplexen zusammengelagert werden, die durch Karyopherin alpha/beta in den Zellkern gelangen. / 26S proteasomes fulfil final steps in the ubiquitin-dependent degradation pathway by recognising and hydrolysing ubiquitylated proteins. As the 26S proteasome mainly localises to the nucleus in yeast, we addressed the question how this 2 MDa multisubunit complex is imported into the nucleus. 26S proteasomes consist of 20S proteolytically active core and 19S regulatory particles, the latter composed of two subcomplexes, namely the base and lid complexes. We have shown that 20S core particles are translocated into the nucleus as inactive precursor complexes via the classical karyopherin alpha/beta import pathway (Lehmann et al. 2002; JMB, 317, 401). Here, we provide evidence that nuclear import of base and lid complexes also depends on karyopherin alpha/beta. Potential classical nuclear localisation sequences (NLS) of base subunits were analysed. Rpn2 and Rpt2, a non-ATPase and an ATPase subunit of the base complex, harbour functional NLS. The Rpt2 NLS deletion yielded wild type localisation. However, the deletion of the Rpn2 NLS resulted in improper nuclear proteasome localisation and impaired proteasome function. Our data support the model by which nuclear 26S proteasomes are assembled from subcomplexes imported by karyopherin alpha/beta.

Rhythmische neuronale Aktivität spielt vermutlich eine wichtige Rolle in der Informationsverarbeitung im zentralen Nervensystem. Oszillationen neuronaler Netze sind heterogen, von der Hirnregion und ihrer Funktion abhängig und werden entsprechend ihrer Frequenz eingeteilt. Für ihre Entstehung sind über die Verschaltung der Neuronen und der synaptischen Übertragung hinaus insbesondere die Erregbarkeit und Oszillationseigenschaften einzelner Neurone von Bedeutung. Bestimmte Zellen der hippokampalen Formation wie zum Beispiel Sternzellen (SC) der Schicht II des Entorhinalkortex zeigen oszillatorische Aktivität und antworten verstärkt auf Stimuli einer bestimmten Frequenz – sie sind resonant. Beide Phänomene werden auf spezifische spannungsabhängige Leitfähigkeiten in der Membran zurückgeführt. Es stellte sich heraus, dass die Resonanzfrequenz von SCs durch das Muster der vorhandenen Leitfähigkeiten bestimmt wird und von der Position der Zelle entlang der dorso-ventralen Achse abhängt. Dieser Gradient ist bereits in frühen Entwicklungsstadien nachweisbar. Im Zuge der weiteren Entwicklung werden SCs weniger erregbar und der Bereich der Resonanzfrequenz dehnt sich nach dorsal aus. Pharmakologische Experimente ergaben, dass die Resonanz von SCs von HCN-Kanälen abhängt und von Kv7-Kanälen moduliert wird. Außerdem konnten zwei, bisher unbekannte Klassen von oszillatorischen Interneuronen beschrieben werden, deren Resonanz ebenfalls im Theta-Bereich liegt und auf ähnliche Leitfähigkeiten zurückgeführt werden kann. Weitere, auch CA1-Pyramidenzellen einschließende Experimente ergaben, dass HCN-Kanäle die allgemeine Voraussetzung für Resonanz zu sein scheinen während Kv7-Kanäle potente Modulatoren darstellen. Die pharmakologische Blockade dieser Kanäle unterbrach Netzwerkoszillation im Hippokampus. Dies unterstützt die These, dass bestimmte Leitfähigkeiten Neuronen Resonanzeigeschaften verleihen und somit wiederum Netzwerkoszillationen unterstützen. / Rhythmic neuronal activity is thought to be crucial for information processing in the brain. Neuronal network oscillations are heterogeneous, vary with brain region and type of information processed. They are classified according to their frequency content. Their generation relies on network circuitry, synaptic transmission and neuronal properties. Oscillatory behavior of individual cells has been particularly implicated. Different cell types within the hippocampal formation such as layer II stellate cells (SC) of the medial entorhinal cortex display oscillatory activity and are resonant, i.e., respond preferentially to stimuli of a given frequency. Voltage dependent ionic conductances have been suggested to give rise to these phenomena. It was found that resonance of SCs is defined by the composition of voltage-dependent channels embedded in their membrane and changes with their position along the dorsal-ventral axis. This gradient of SC properties develops during early postnatal life. During the transition to adulthood cells become less excitable and the range of resonance frequencies expands in the dorsal direction. Pharmacological experiments reveal the resonance of SCs to depend strongly on HCN-channels and to be modulated by Kv7-channels. Also, two previously unknown classes of oscillating interneurons were identified in the stratum radiatum of the CA1 region. These are targeted by neurons from the dentate gyrus, display frequency preferences in the theta range which relies on similar membrane conductances. Further experiments including CA1 pyramidal cells suggested HCN-channels to be the primary global requirement for resonance whereas Kv7-channels appear to be effective modulators. Pharmacological blockade of these channels disrupted ongoing network oscillations in the hippocampus. This supports the notion that specific ion channels support rhythmic activity of individual cells and in turn of entire networks.

Endothelin-1 (ET-1) ist ein gefä?aktives Peptid, welches zusätzlich verschiedenste nicht kardiovaskuläre physiologische und pathophysiologische Effekte besitzt. So wurde z.B. beschrieben, dass ET-1 in der Brustdrüse während der Schwangerschaft und Stillzeit exprimiert wird. Zusätzlich zu den bekannten Nährstoffen und Wachstumsfaktoren konnte auch ET-1 in der Muttermilch nachgewiesen werden, was auf eine physiologische Rolle von ET-1 für die Laktation und den säugenden Nachwuchs hinweist. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von ET-1 in der Brustdrüsenentwicklung mit Hilfe von ET-1 transgenen Mäusen aufgeklärt werden. Die eingesetzten transgenen Tiere überexprimieren humanes ET-1 mit den entsprechenden 5''- und 3'' regulatorischen Sequenzen. Mit Hilfe dieser Strategie sollen die ET-1 spezifischen Funktionen während der Brustdrüsenentwicklung untersucht werden. Transgenes ET-1 wurde während der Tragzeit und Stillzeit in der Brustdrüse detektiert. Die Ergebnisse zeigten, dass säugende Neugeborene der ET-1 transgenen Mäuse eine geringere Gewichtszunahme und eine erhöhte Mortalität aufwiesen, welches auf einen Laktationsdefekt hinweist. Die histologische Untersuchung der Brustdrüse während der Tragzeit ergab eine reduzierte Milchkanalausbildung, kollabierte und nicht expandierende Alveoli, vermehrte Adipozytenausbildung und fortbestehende zytoplasmatische Lipidtropfen (CLDs). Zusätzlich war die Expression des Milchproteins WAP reprimiert. Interessanterweise wurde diese Repression nicht durch STAT5, einem beschriebenem Regulator der Milchproteinexpression und Alveolarexpansion, vermittelt, da dessen Aktivität unverändert war. Als Konsequenz dieses Laktationsdefekts konnte eine verfrühte Rückbildung der Brustdrüse festgestellt werden. Diese ging mit einer erhöhten Expression von STAT3 einher. Interessanterweise wies der bekannte Aktivator von STAT3, LIF, ebenfalls eine gesteigerte Aktivität auf, sowohl während der Tragzeit als auch während der Laktation. Zusätzlich zu den beschriebenen Defekten bei der Milchabgabe zeigten histologische Untersuchungen der Brustdrüse eine Laktationshyperplasie während der mittleren Laktationsphase. In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, dass ET-1 Rezeptoren, neben den klassischen Signalwegen dieser G Protein-gekoppelte Rezeptoren, auch mit Tyosinkinaserezeptoren wie z. B. dem EGFR interagieren können. Brustdrüsen von ET-1 transgenen Tieren zeigten eine erhöhte Aktivität sowohl von EGFR als auch von ERK1/2, welches im Zusammenhang mit dem hyperplastischen Phänotyp stehen könnte. Die mögliche tumorfördernde Wirkung von ET-1 wird ferner durch die erhöhte Expression von Amphiregulin, einem EGFR-Liganden, während der Tragzeit und der Laktation verstärkt. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass ET-1 sowohl die Milchsekretion als auch den Milcheinschuss negativ beeinflusst, so dass eine ausreichende Versorgung säugender Jungtiere in der 1. Hälfte der Laktationsperiode nicht mehr gewährleistet ist. Zusätzlich verursachte ET-1 eine Laktationshyperplasie, welche auf die Induktion der EGFR-Achse zurückzuführen ist. Zusammenfassend kann somit festgestellt werden, dass die Ergebnisse auf eine wichtige Rolle von ET-1 in der Brüstphysiologie des Säugers hinweisen. / Endothelin-1 (ET-1) is a potent vasoactive peptide having wide physiological effects on vascular homeostasis and on a variety of pathophysiological processes unrelated to cardiovascular system. It has been noted that ET-1 is expressed in mammary glands during pregnancy and lactation periods. Furthermore, ET-1 is secreted into milk, suggesting additional physiological roles in the lactating mother and in the suckling neonate. Hence, the present study was proposed to elucidate the possible functional roles of ET-1 in mammary gland development employing ET-1 transgenic mice. ET-1 transgenic mice had been generated by using a human genomic ET-1 construct containing 5´ and 3´ regulatory sequences. This transgenic construction strategy grants to analyse the specific functions of ET-1 in normal mammary gland physiology. The transgene expression was found in mammary gland during pregnancy and lactation. ET-1 transgenic mice exhibited a lactational incompetence with reduced weight gain and increased mortality of their newborns, as a result of a secretory defect. In virtue of this defect, ET-1 transgenic mammary glands histologically revealed a reduced ductal outgrowth, collapsed alveoli with a reduced expansion capacity, increased adipocyte accumulation, and persistence of cystoplasmic lipid droplets (CLDs) during lactation. In addition, the expression of the milk protein, WAP, was found to be constantly suppressed in ET-1 mammary glands although the activity of STAT5, which is known to be a regulator of the expression of milk proteins and alveolar expansion, was found to be normal. Furthermore, as a consequence of the secretory defect, ET-1 transgenic mammary glands exhibited focal precocious involution during early stages of lactation along with an increased activity of STAT3. Consistently, the known activator of STAT3, LIF, was strongly upregulated during lactation and pregnancy. Besides the secretory defect of ET-1 transgenic mammary glands, histological analysis revealed a local lactational hyperplasia during the middle of lactation. Alternatively to the classical G protein-coupled receptors GPCR signalling pathways, endothelin receptors are able to communicate with tyrosine kinase receptors such as the epidermal growth factor receptor (EGFR) for which the term receptor transactivation was coined. Mammary glands of ET-1 transgenic animals exhibited an increased activity of the EGFR and ERK1/2, which could contribute to the observed hyperplastic phenotype. In support of the potential tumourigenicity of ET-1, one of the EGFR ligands, amphiregulin, was found significantly upregulated in ET-1 transgenic mammary glands, both during pregnancy and lactation periods. In summary, high levels of ET-1 affect the secretion and the milk let down process. Consequently the normal support of milk for the suckling neonates is severely impaired during the first half of the lactation period. In addition, ET-1 caused lactational hyperplasia in the mammary glands due to the induction of the EGFR axis. This suggests an important role for ET-1 in mammary gland physiology.

In der Forschung dient die Hauskatze als Modellspezies für die Entwicklung und Verbesserung assistierter Reproduktionstechniken (ART) für wildlebende Katzenarten, von denen die meisten der 36 Arten auf der Roten Liste für bedrohte Tierarten als gefährdet eingestuft sind. Eine erfolgreich angewandte Methode der ART bei Hauskatzen ist die In-vitro-Produktion von Embryonen. Allerdings gestaltet sich die Übertragbarkeit der Protokolle auf andere Feliden aufgrund speziesspezifischer reproduktionsbiologischer Besonderheiten oft sehr schwierig. Das Ziel dieser Doktorarbeit war daher die Charakterisierung des felinen Oviductins, ein Glykoprotein, welches ausschließlich im Eileiter exprimiert wird und das in mehreren Studien bei anderen Tierarten einen positiven Effekt auf die Interaktion der Gameten, Befruchtung, Teilungsraten und Embryonalentwicklung gezeigt hat. Die feline Oviductinsequenz konnte in der vorliegenden Arbeit vollständig identifiziert werden. Sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeigte sich eine zyklusabhängige Expression von Oviductin im Eileiter mit höchsten mRNA-Kopienzahlen bzw. höchster Proteinsynthese während des Östrus. Für funktionelle Studien wurde eine Methode zur Herstellung eines rekombinant exprimierten Oviductins in E.coli etabliert. Die Anwesenheit des rekombinanten Proteins führte zu einer signifikant höheren Spermienbindung an die Zona pellucida feliner Eizellen. Die Zugabe des rekombinanten Proteins während der In-vitro Fertilisation (IVF) hatte keinen Einfluss auf die Teilungs- oder Entwicklungsraten der Embryonen, allerdings zeigten Blastocysten, die sich aus einer IVF mit Oviductin entwickelten, eine signifikant höhere Expression des gap junction protein alpha 1 Gens, was für eine verbesserte Embryonenqualität spricht. / The domestic cat serves as a model to develop and improve assisted reproductive techniques for wild felid species from which most of them are listed on the IUCN Red List of threatened species. In-vitro embryo production is successfully applied for the domestic cat but adaption to other felids, caused by their diversity in reproductive physiology, is often difficult. The biggest challenge is to create an in-vitro environment as near as possible to in-vivo conditions within the oviduct where final maturation of gametes, fertilization and early embryo development occur. Therefore, the aim of this doctoral thesis was to characterize feline oviductin, a glycoprotein which is exclusively expressed in the oviduct. Several functional studies with other species could show an influence of oviductin on gamete interaction, fertilization, cleavage rates and embryo development. In the present work gene sequence of the feline oviductin could be identified. Highest mRNA copy numbers and protein synthesis were detected during oestrus, indicating a cycle-dependent expression of oviductin in the cat. For functional studies, a method for production of recombinant oviductin in E.coli was established. Sperm-zona binding was significantly higher when recombinant oviductin was present. Addition of oviductin during in-vitro fertilization (IVF) had no effect on cleavage, morula rates or blastocyst development. In contrast, in blastocysts developed from IVF with oviductin, we found a significantly higher mRNA expression of gap junction alpha protein 1, suggesting a higher quality of in-vitro produced embryos.

Kanalrhodpsine (ChRs) sind lichtaktivierbare Kationenkanäle, welche als primäre Fotorezeptoren in Grünalgen dienen. In der Optogenetik werden ChRs verwendet um neuronale Membranen zu depolarisieren und mit Licht Aktionspotentiale auszulösen. Das mit blauem Licht aktivierte Chlamydomonas Kanalrhodopsin 2 (C2) und effiziente Mutanten wie C2 H134R stellen die am häufigsten genutzten depolarisierenden, optogenetischen Werkzeuge dar. Komplementär zu ChRs werden Protonen- und Chloridpumpen aus Archaebakterien zur neuronalen Inhibierung durch lichtinduzierte Hyperpolarisation verwendet. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die ChR-Chimäre C1V1, ein grünlichtaktiviertes ChR, das sich durch hervorragende Membranlokalisierung und hohe Fotoströme in HEK-Zellen auszeichnet. C1V1 und C1V1-Mutanten mit feinabgestimmten spektralen und kinetischen Eigenschaften ermöglichen die neuronale Aktivierung mit Wellenlängen bis 620 nm sowie die unabhängige Aktivierung zweier Zellpopulationen in Kombination mit C2. Um die strukturelle Basis von Kanalöffnung und Ionentransport in ChRs zu verstehen, wurden gezielt Mutationen in C2 und C1V1 eingeführt. Die Fotoströme der entsprechenden Mutanten wurden auf Kationenselektivität und kinetische Veränderungen untersucht. Während Aminosäuren, die den Kanal an der zytosolischen Seite begrenzen, die Kationenfreisetzung und Einwärtsgleichrichtung der ChRs bestimmen, spielen zentral im Kanal gelegende Aminosäuren ein entscheidende Rolle für Kationenselektivität und -kompetition. Ein enzymkinetisches Modell ermöglichte außerdem die Zerlegung der Fotoströme in Beiträge der verschiedenen, konkurrierenden Kationen. Im letzten Teil der Arbeit wurde pHoenix, ein optogenetisches Werkzeug zur Ansäuerung synaptischer Vesikel, entwickelt. In Neuronen des Hippocampus wurde pHoenix verwendet, um die treibenden Kräfte für die vesikuläre Neurotransmitteraufnahme sowie den Zusammenhang zwischen Vesikelfüllstand und Freisetzungswahrscheinlichkeit zu analysieren. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-activated cation channels functioning as primary photoreceptors in green algae. In the emerging field of optogenetics, ChRs are used to depolarize neuronal membranes, thus allowing for light-induced action-potential firing. The blue light-activated Chlamydomonas channelrhodopsin 2 (C2) and high-efficiency mutants such as C2 H134R represent the most commonly used depolarizing optogenetic tools. Complementary to ChRs, green to yellow light-activated proton and chloride pumps originating from archea enable neuronal inhibition by membrane hyperpolarization. In the present work, we developed the chimeric ChR C1V1, a green-light activated ChR with excellent membrane targeting and high photocurrents in HEK cells. Action spectrum and kinetic properties of C1V1 were further fine-tuned by site-directed mutagenesis. The ensemble of C1V1 variants allows for neuronal activation with wavelengths up to 620 nm and can be used in two-color optogenetic experiments in combination with C2 derivatives. In order to understand the structural motifs involved in channel gating and ion transport, conserved residues in C2 and C1V1 were mutated and photocurrents of the respective mutants were analyzed for kinetic characteristics and cation selectivity. In these experiments, residues of the inner gate region were shown to alter cytosolic cation release and inward rectification, whereas central gate residues determine cation competition and selectivity, as well as the equilibrium between the two open channel conformations. Moreover, an enzyme-kinetic model was used to quantitatively dissect ChR photocurrents into the contribution of different competing cations. Finally, we designed pHoenix, an optogenetic tool enabling green-light induced acidification of synaptic vesicles. In hippocampal neurons, pHoenix was used to study both the energetics of vesicular neurotransmitter uptake and the impact of the vesicular contents on synaptic vesicle release.

Die systemische Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) ist durch die Produktion von autoreaktiven Antikörpern charakterisiert. In wie weit veränderte B-Zellrezeptor (BZR) Signalwege oder Co-Rezeptoren in diesem Prozess involviert sind, ist noch nicht ausreichend im humanen SLE untersucht worden. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit eine detaillierte Analyse des inhibitorischen Co-Rezeptors CD22, der Kinase Syk und Akt in B-Zellen des peripheren Blutes von SLE Patienten durchgeführt. SLE Patienten zeigten eine Dysbalance in BZR abhängigen Signalwegen, welche eine B-Zellsubpopulationen unabhängige Reduktion der p-Syk/p-Akt Ratio versursacht. Diese Verschiebung könnte zu einer defekten negativen Selektion und somit zur Bildung von autoreaktiven Zellen führen, die wiederum durch Überlebensvorteile persistieren könnten. Zusätzlich wurde im peripheren Blut von SLE Patienten eine bislang nicht bekannte CD27 Syk++ B-Zellpopulation nachgewiesen. Diese wies, trotz des fehlenden Gedächtnismarkers CD27, Gedächtnismerkmale auf und könnte für die bekannte erhöhte Plasmazell-induktion in SLE Patienten verantwortlich sein. Somit konnte Syk als intrazellulärer Marker einer Gedächtnispopulation identifiziert werden. Des Weiterem stellt die Wiederherstellung der Balance von Syk- und Akt Phosphorylierung nach BZR Aktivierung einen erfolgsversprechenden Therapieansatz bei SLE Patienten dar, um die Entstehung und das Überleben von autoreaktiven B- und Plasmazellen besser kontrollieren zu können. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a severe systemic autoimmune disease in which loss of tolerance to nucleic acids results into the production of autoreactive antibodies (Ab) Therefore, B cells might play a key role in the pathogenesis of this disease. However, abnormalities of BCR associated co receptors and downstream kinases with potential implications in selection processes are rare for human SLE. Thus, a comprehensive analysis of the inhibitory BCR co-receptor CD22, the spleen tyrosine kinase (Syk) and the pro-survival serine kinase Akt has been undertaken to gain new insights into potential BCR signaling disturbances in this autoimmune disease. This data indicate that B cells from SLE patients display an intrinsically disturbed balance of BCR related signaling pathways, resulting in a B cell subset independent reduced p-Syk/p-Akt ratio. This may lead to a diminished BCR dependent negative selection and enhanced survival of SLE B cells, permitting the emergence of autoreactive B and plasma cells. Furthermore, SLE patients exhibit an increased frequency of a novel CD27-Syk++ B cell subset with memory features, enhanced tonic BCR signaling and the capacity to differentiate in auto-Ab secreting cells. The current study provides evidence that the use of intracellular markers, such as Syk, could permit a more precise delineation of CD27- memory B cell subsets in autoimmune diseases since the conventional used memory marker CD27 has some limitations. In addition, the balance between the BCR associated kinases Syk and Akt might be a promising therapeutic target to reduce the occurrence of autoreactive B and plasma cells.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Membranproteine und agieren als Sensoren, Biokatalysatoren oder Ionentransporter. Die Ionentransporter unterteilen sich in lichtgetriebene Ionenpumpen und in lichtaktivierte Kanalrhodopsine. Besonders die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin steht schon lange im Fokus biophysikalischer Untersuchungen. Obwohl die Protonenpumpen seit über 40 Jahren intensiv untersucht werden, ist das Wissen über deren elektrophysiologische Eigenschaften noch immer gering. Aus diesem Grund widmete sich diese Arbeit der elektrophysiologischen Charakterisierung der mikrobiellen Rhodopsine mit dem Fokus auf Protonenpumpen. Hierfür wurden vor allem „Two-Electrode Voltage Clamp“ -Messungen (TEVC) an Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus leavis durchgeführt. Die Untersuchung verschiedener Protonenpumpen hat gezeigt, dass diese eine unerwartet große Diversität in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften aufweisen. Von besonderem Interesse war die Beobachtung, dass einige Protonenpumpen neben Pumpströmen auch passive einwärts gerichtete Photoströme zeigten. Besonders deutlich war der „Pump-Kanal-Dualismus“ bei dem Gloeobacter-Rhodopsin ausgeprägt. Andere Protonenpumpen, wie das Bakteriorhodopsin oder Coccomyxa-Rhodopsin, zeigten keine einwärts gerichteten Photoströme. Das Coccomyxa-Rhodopsin wurde aufgrund seiner hohen Photostrom-Amplituden in Oozyten für eine Mutationsanalyse ausgewählt. Diese Mutationsanalyse verhalf die strukturellen Ursachen für die funktionalen Unterschiede zu identifizieren, welche sowohl zwischen den Protonenpumpen untereinander als auch gegenüber Kanalrhodopsinen beobachtet wurden. Mutationen im Gegenion-Komplex führen zu rein passiven oder inaktiven Transportern. Dagegen übernimmt der extrazelluläre Halbkanal in Protonenpumpe die Aufgabe einen passiven Protonen-Rückfluss während des Pumpzyklus zu verhindern, denn Mutationen in dieser Region verursachen passive Photoströme zusätzlich zum aktiven Pumpstrom. / Microbial rhodopsins are light-sensitive membrane proteins and operate as sensors, enzymes or ion-transporters. The ion transporters are subdivided into light-driven ion pumps and light-gated channels. Biophysical research has put focus on the proton pump bacteriorhodopsin for long time. Despite the fact that light-driven proton pumps are investigated for over 40 years, the knowledge about their electrophysiological properties is surprisingly low. For this reason, this thesis is devoted to the electrophysiological characterization of microbial rhodopsins with special focus on light-driven proton pumps. For this purpose, “Two-Electrode Voltage Clamp”-recordings (TEVC) were primarily performed using oocytes from African clawed frog Xenopus leavis. The investigation of diverse proton pumps has shown that the differences in their electrophysiological behaviors are unexpectedly high. Special interest was laid on proton pumps which show passive inward directed photocurrents when the electrochemical load exceeds a certain level. The dualism of pump and channel activity was particularly pronounced in the proton pump Gloeobacter-rhodopsin. Other proton pumps, for instance bacteriorhodopsin or Coccomyxa-rhodopsin, do not show inward directed photocurrents. Due to high photocurrent amplitudes, the Coccomyxa-rhodopsin was selected for an efficient mutagenesis study. This study allowed the identification of structural key determinants for the differences among proton pumps themselves and for the differences of proton pumps in comparison with light-gated ion channels (channelrhodopsins). Therefore, mutations of the counter-ion-complex cause inactive or purely passive transporters. The extracellular half-channel is the key element in proton pumps which prevents passive proton-backflow during the pump-cycle. Mutations in this region lead to passive leak-currents in overlap with the remaining pump-activity.

Diese Arbeit befasst sich mit dem bisher noch nicht untersuchten Mechanismus der Cyanophycinbiosynthese. Hierzu wurden verschiedene kurze Cyanophycinmoleküle chemisch synthetisiert, die als definierte Primer in in vitro Experimenten verwendet wurden. Die Verwendung dieser Primer ermöglichte erstmals die Richtung der Verlängerung des Cyanophycinmoleküls aufzuklären. Die durchgeführten Experimente zeigten, dass der Einbau der konstituierenden Aminosäuren sukzessiv vom Carboxyterminus aus erfolgt. Weiterhin wurde gezeigt, dass auch die nicht proteinogenen Aminosäuren Ornithin und Citrullin vom Enzym eingebaut werden. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde zudem eine Zuordnung unterschiedlicher Abschnitte der Cyanophycin-Synthetase zu den verschiedenen vom Enzym katalysierten Teilreaktionen versucht. Mutationen im N-terminalen Bereich der Cyanophycin-Synthetase aus Anabaena variabilis ATCC 29413 führten dazu, dass Aspartat nicht mehr in Cyanophycin eingebaut wurde, eine Mutation im C-terminalen Bereich bewirkte, dass Arginin nicht mehr mit Cyanophycin verknüpft werden konnte. Als Reaktionsmechanismus wird für die Bindung beider Aminosäuren jeweils eine Phosphorylierung des C-terminalen Aspartatrestes von Cyanophycin als Acylphosphat vorgeschlagen, wobei die Phosphorylierung der beta-Carboxylgruppe mittels gamma-[³²P]-ATP nachgewiesen werden konnte, die Phosphorylierung der alpha-Carboxylgruppe jedoch nicht. Durch Vergleiche mit Enzymen ähnlicher Aminosäuresequenz und bekannter Raumstruktur wird eine mögliche Begründung für diese unterschiedlichen Befunde gegeben. / This work is occupied with the till now uninvestigated mechanism of the biosynthesis of cyanophycin. Therefore different short cyanophycin molecules were synthesized chemically, which were employed as defined primers for in vitro experiments. The usage of these primers made it possible to clear up the direction of the elongation of the cyanophycin molecule. Experiments showed that the incorporation of the constituent amino acids happens successively starting from the carboxy-terminus. Further it was shown that the nonproteinogenic amino-acids ornithine and citrulline are incorporated by the enzyme. Using site-directed mutagenesis an assignment between segments of the cyanophycin synthetase to different parts of the reactions catalyzed by the enzyme was carried out. Mutations in the N-terminal part of cyanophycin synthetase of Anabaena variabilis ATCC 29413 lead to the finding, that aspartate was not incorporated into cyanophycin anymore. A mutation in the C-terminal part resulted in the disability of the enzyme to incorporate arginine into cyanophycin. As reaction mechanism for the attachment of both of the amino acids a phosphorylation of the C-terminal aspartate as an acylphosphate was proposed. The phosphorylation of the beta-carboxylic-group could be shown by using gamma-[³²P]-ATP, the phosphorylation of the alpha-carboxylic group could not be shown. By comparison with enzymes that share a similar amino acid sequence and have a solved crystal structure a possible explanation for this finding is given.

Der Baikalsee ist der älteste, tiefste und größte (gemessen am Volumen) See der Welt, mit über 1500 endemischen Arten. Er wurde 1996 zum UNESCO Weltnaturerbe deklariert; doch auch dieses einzigartige Ökosystem könnte in Zukunft durch anthropogen bedingte Klimaänderungen und Nährstoff-Einträge gefährdet sein. Rezente und fossile Phytoplankton-Pigmente werden immer häufiger in Monitorings genutzt, um aktuelle und historische Änderungen der Phytoplankton-Produktivität und –Zusammensetzung zu bestimmen, welche Änderungen von klimatischen und anderen Umweltbedingungen anzeigen. Dennoch wurden im Baikal bislang keine rezenten und nur in wenigen Studien fossile Phytoplankton-Pigmente untersucht. Drei Hauptaspekte wurden in dieser Arbeit untersucht: (1) die Phytoplnkton und Phytoplankton-Pigment Verteilung in der euphotischen Zone, (2) deren Sedimentation zum Seeboden und Degradierung im oxischen Oberflächensediment, und (3) Änderung der fossilen Pigmente während des Holozäns (seit 10.000 Jahren) und der vorangegangenen Warmzeit (vor 129.000-117.000 Jahren). Schlussfolgernd läßt sich sagen, dass Pigment-basierte Analysen im Baikal verlässliche Aussagen über rezente und historische Phytoplankton-Variationen ermöglichen, welche durch Umwelteinflüsse (natürlichen oder menschlichen Ursprungs) induziert werden. Im Rahmen des EU-Projekts CONTINENT und des Langzeit-Monitorings der Staatlichen Universität Irkutsk werden die Ergebnisse zur Phytoplankton-Entwicklung seit der letzten Warmzeit bis zum Beginn des 21. Jahrhunderts den lokalen Naturschutz und globale Klimastudien unterstützen. / Lake Baikal is the World´s oldest, deepest and largest (by volume) lake and contains over 1,500 endemic species. Since 1996, after becoming a UNESCO World Heritage Area, the effects of global warming and local anthropogenic eutrophication on its unique ecosystem become a subject of international discussion. Recent and fossil phytoplankton pigments are being increasingly used to monitor recent and past responses of the phytoplankton composition and productivity to changes of climatic and other environmental conditions in aquatic systems. However, phytoplankton pigments were not yet investigated in the water column of Lake Baikal and only little in its sediment. Three main aspects were investigated in this thesis: (1) the distribution of phytoplankton and phytoplankton pigments in the euphotic zone, (2) its sedimentation through the water column and preservation within the oxidised surface sediment, and (3) variation of fossil phytoplankton pigments in the pristine lake during Holocene (since 10,000 years ago) and last interglacial (129,000-117,000 years ago). Taken together, pigment-based analyses were shown to accurately reflect phytoplankton variation caused by environmental changes of natural or human origin in Lake Baikal. In conjunction with the EU project CONTINENT and the long-term monitoring in Irkutsk, the phytoplankton development determined from the last interglacial up until the early 21st century will be used for future research of climate changes as well as for the Lake Baikal’s protection.

In multizellulären Organismen bilden Epithel- und Endothelzellen die äußere Begrenzung innerer und äußerer Körperoberflächen bzw. kleiden die Blutgefäße aus. So schaffen sie abgegrenzte Organkompartimente mit individuellen, der jeweiligen Funktion angepassten Bedingungen. Dazu muss die parazelluläre Diffusion von Stoffen eingeschränkt werden. Die Abdichtung des parazellulären Spalts erfolgt durch tight junctions (TJ). Claudine (Cld) bilden das strukturelle Rückgrat der TJ. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass einzelne Aminosäuren der zweiten extrazellulären Schleife (2. EZS) eines Claudins für die parazelluläre Dichtigkeit essentiell sind. Da endogene TJ-Stränge fast ausschließlich aus mindestens zwei verschiedenen Claudinen aufgebaut sind, wurde die Wirkung von Aminosäuresubstitutionen in der 2. EZS von Cld5 auf die parazelluläre Dichtigkeit in einer claudinheterogenen Umgebung analysiert. Dafür wurden verschiedene Cld5-Mutanten stabil in MDCK-II-Zellen exprimiert. Die Aminosäuresubstitutionen in der 2. EZS von Cld5 führten nicht nur zum Verlust der durch Cld5wt bedingten parazellulären Abdichtung, sondern darüber hinaus zu einer geringeren parazellulären Dichtigkeit im Vergleich zur Vektorkontrolle. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde mit einem Peptid, dessen Sequenz der C-terminalen Hälfte der 1. EZS von Cld1 entsprach (Cld153-81), eine reversible Öffnung der TJ von epithelialen Zelllinien erzielt. Mit dem N-terminal verkürzten Clostridium perfringens Enterotoxin-Fragment CPE194-319 wurde ebenfalls eine Reduktion der parazellulären Dichtigkeit von Epithelzellen erzielt. Insgesamt tragen die Untersuchungen dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis der durch Claudine vermittelten Abdichtung des parazellulären Spalts bei. Darüber hinaus bieten Cld153-81 und CPE194-319 neue Perspektiven für eine gezielte therapeutische Öffnung der TJ, um beispielsweise die Wirkstoffzufuhr ins Gehirn zu verbessern. / Epithelial and endothelial cells form the external lining of outer and inner body surfaces and blood vessels of multicellular organisms. Thus, they create separate compartments each exhibiting an environment optimally adjusted to their respective function. To build up such compartments epithelial and endothelial cells have to restrict the paracellular diffusion of substances. The paracellular cleft is sealed by tight junctions (TJ). In electron microscopical images TJs appear as a network of intermembranous strands in the apical region of the lateral cell membrane of epithelial and endothelial cells. Claudins (Cld) form the structural backbone of TJs. The present study provided evidence for the first time that single amino acids of the second extracellular loop (ECL) of a claudin are essential for the paracellular tightness of epithelial cells. The effect of single amino acid substitutions of the second ECL of Cld5 were studied in cells expressing various other endogenous claudins except Cld5. Point mutants of Cld5 were stably expressed in MDCK-II cells. While the expression of Cld5wt caused increased paracellular tightness, this effect was completely abolished by the Cld5 point mutants. Furthermore, the mutants even decreased the paracellular permeation of certain substances compared with the vector control. Further findings of the present study demonstrated that a peptide corresponding to the C-terminal half of the first ECL of Cld1 is capable of opening the TJ in a reversible manner. Using an N-terminal fragment of clostridium perfringens enterotoxin (CPE194-319) a reduction of the paracellular tightness of epithelial cells was demonstrated. Taken together, the findings of the present study contribute to a better understanding of the sealing of the paracellular cleft by claudins. Furthermore, Cld153-81 und CPE194-319 open new perspectives for a targeted therapeutic opening of the TJs suited for enhancing the transport of active substances into diseased tissue.