Ziel: Einsetzbarkeit und Nutzen der digitalen Spracherkennung in der radiologischen Diagnostik sollte an Hand des Spracherkennungssystems SP 6000 getestet werden. Methodik: Das Spracherkennungssystem SP 6000 wurde in das Institutsnetzwerk integriert und an das vorhandene Radiologische Informationssystem (RIS) angebunden. 3 Testpersonen nutzten bei 2305 Diktaten dieses System zur Befunderstellung. Es wurden Datum, Diktatlänge, Zeitaufwand zur Kontrolle/Korrektur, Untersuchungsart und die Fehlerrate nach dem Erkennungsvorgang bei jedem Diktat erfaßt. Korreliert wurde gegenüber 625 durch die gleichen Untersucher konventionell geschriebenen Befunden. Ergebnisse: Nach dem einstündigen Initialtraining lagen durchschnittliche Fehlerraten von 8,4 - 13,3 % vor, die erste Adaptation des Spracherkennungssystems (nach 9 Arbeitstagen) verringerte auf Grund der Lernfähigkeit des Programms die durchschnittliche Fehlerrate auf 2,4 - 10,7 %. Die 2. und 3. Adaptation ergab nur geringe Änderungen der Fehlerrate. Der interindividuelle Vergleich der Entwicklung der Fehlerrate bei der gleichen Untersuchungart zeigte die relative Unabhängigkeit der Fehlerrate vom einzelnen Nutzer. Schlußfolgerungen: Unter Betrachtung der ermittelten Ergebnisse kann das digitale Spracherkennungssystem SP 6000 als vorteilhafte Alternative zur schnellen Erstellung radiologischer Befunde beurteilt werden. Der Vergleich der Befundungsdauer des Schreibens mit der des Diktierens beweist die individuellen Unterschiede bei der Schreibgeschwindigkeit und damit einen Zeitvorteil des Befundens mittels Spracherkennung bei normaler Tastaturfertigkeit. / Purpose: Applicability and benefits of the digital speech recognition in the radiological diagnostics should be tested with the speech recognition system SP 6000. Methods: The speech recognition system SP 6000 was integrated into the network of the institute and connected to the existing Radiological Information System (RIS). 3 subjects of the test used this system for writing 2305 findings from dictation. After the recognition process the date, length of dictation, time required for checking/correction, kind of examination and error rate were recorded for every dictation. By the same subjects of the test, a correlation was performed with 625 conventionally written findings. Results: After an 1-hour initial training the average error rates were 8.4 to 13.3 %. The first adaptation of the speech recognition system (after 9 days) decreased the average error rates to 2.4 to 10.7 % due to the ability of the program to learn. The 2nd and 3rd adaptations resulted only in small changes of the error rate. An individual comparison of the error rate developments in the same kind of investigation showed the relative independence of the error rate of the individual user. Conclusion: The results show that the speech recognition system SP 6000 can be evaluated as an advantageous alternative for quickly recording radiological findings. A comparison between manually writing and dictating the findings verifies the individual differences of the writing speeds and shows the advantage of the application of voice recognition when faced with normal keyboard performances.

Das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) ist ein hochkonserviertes, ubiquitär in Eukaryonten vorkommendes Protein. Seine Bezeichnung geht auf die erstmalige Beschreibung in Tumorzellen zurück und weist zugleich auf seine besondere translationelle Regulation hin. Das zugehörige Gen wird als TPT1 bezeichnet und befindet sich beim Menschen auf dem langen Arm des Chromosom 13. Eine pathophysiologische Bedeutung für TCTP wurde bei Tumorerkrankungen, Erkrankungen des allergischen Formenkreises sowie bei Infektionen durch Parasiten beschrieben. Für diese Arbeit wurde zur Untersuchung grundlegender Regulationsphänomene die TCTP-mRNA des Kaninchens als geeignetes Modell ausgewählt. Es wurden die volllangen TCTP-mRNA1 und 2, die sich in der Länge ihrer 3'UTR unterscheiden, sowie Deletionsvarianten, denen die UTR-Abschnitte fehlen, kloniert. In Proteinbindungsstudien (Electromobility Shift Assays, UV-Crosslinking-Experimente, RNA-Affinitätschromatographie) wurden potentielle Bindungsfaktoren der TCTP-UTRs analysiert. Die an der mRNA des Kaninchens erarbeiteten Ergebnisse wurden durch Untersuchungen an humanen Melanomzellen ergänzt. In in vitro Translationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Regulation der TCTP-mRNA durch ihre 5'UTR und 3'UTR2 vermittelt wird. In RNA-Bindungsstudien konnte eine Reihe potentieller Bindungsfaktoren der UTRs charakterisiert werden. Bei Verwendung von Extrakten aus verschiedenen Kaninchengeweben zeigten sich deutliche gewebsspezifische Unterschiede. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass es in der Melanomzelllinie MeWo bei der Ausbildung einer Chemoresistenz zu einer Expressionssteigerung des TCTP kommt. In einem ersten Schritt wurde der Beitrag von Transkription und Translation in vergleichenden Northern und Western Blot Analysen untersucht. Auf mRNA-Niveau findet man in den resistenten Zellen eine deutliche Steigerung der Expression im Vergleich zu den sensiblen Zellen. Der mRNA-Menge in den chemosensiblen Zellen steht eine vergleichsweise geringe Menge an Protein gegenüber. Folglich liegt die mRNA in diesen Zellen in einem inaktiven Zustand vor. Es konnten drei Cytoskelettproteine gamma-Actin, beta-Tubulin und alpha-Actinin als Bindungspartner der TCTP-3'UTR in den Melanomzellen identifiziert werden. Eine Bedeutung von TCTP für die Entstehung der Chemoresistenz lässt sich aufgrund seiner anti-apoptotischen Wirkung vermuten. Die Regulation der TCTP-Translation stellt bei durch Cytostatika hervorgerufener Hemmung der Transkription einen wichtigen Pathomechanismus in chemoresistenten Melanomzellen dar. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is a highly conserved protein expressed in all eukaryotic organisms. It was first described in tumor cells showing a special regulation of translation. The chromosomal localisation of the respective human gene TPT1 has been determined (13q14). TCTP has been implicated in cellular processes such as cell growth and apoptosis. Its medical importance has been shown in malignant transformation, allergic reactions and immunity against parasitic organisms. In order to investigate basic mechanisms of translational regulation the rabbit TCTP-mRNA was chosen due to its high homology to its human counterpart. The TPT1 gene is transcribed into two TCTP-mRNAs differing in the length of their 3'untranslated regions. These two mRNAs and variants missing the untranslated regions were cloned into expression vectors. In Electro mobility shift assays, UV-crosslinking assays and RNA affinity purification several TCTP-mRNA binding factors were characterised. Furthermore, the role of TCTP in human chemoresistant melanoma cells was investigated. In cell-free translation assays the importance of the 5'UTR and 3'UTR2 was shown. However, in wheat germ extracts the regulation of the TCTP-mRNA mediated by its 5'UTR is less important. In Electro mobility shift assays and UV-crosslinking assays with radiolabelled transcripts of the untranslated regions great variations in tissue-specific protein binding were found. Recently, TCTP had been implicated in the development of chemoresistance in the human melanoma cell line MeWo. As a first step, the contribution of transcriptional and translational regulation was analysed by comparing TCTP-expression in Northern and Western blot assays. Transcription of the TPT1 gene is increased in chemoresistant melanoma cells whereas translation is inhibited in those cells susceptible to chemotherapeutic agents. Three proteins, gamma-actin, beta-tubulin and alpha-actinin, were identified as factors binding to the TCTP-3'UTR in melanoma cells. For the interaction of these cytoskeleton components their ability to bind intracellular calcium ions could be of great importance. The role of TCTP in the development of chemoresistance can be explained by its anti-apoptotic function. In conclusion, the regulation of TCTP-translation when transcription is blocked by inhibitors of DNA-function is an important mechanism to overcome the effect of these anti-proliferative agents.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der molekularzytogenetischen Charakterisierung von invasiv duktalen und invasiv lobulären Mammakarzinomen sowie der Identifizierung unterschiedlicher genetischer Alterationsmuster in Tumorsubgruppen der invasiv duktalen Mammakarzinome. Mit Hilfe der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) wurden 30 invasiv duktale und 20 invasiv lobuläre Mammakarzinome auf genetische Veränderungen untersucht. In beiden Tumorarten überwiegen DNA-Deletionen gegenüber DNA-Gewinnen, daher scheint die Inaktivierung tumorsupprimierender Gene einen größeren Einfluß auf das maligne Wachstumsverhalten auszuüben. Invasiv duktale Mammakarzinome zeichnen sich durch eine im Mittel größere Anzahl an Alterationen pro Tumorfall aus als invasiv lobuläre Karzinome (14,9 vs. 8,9). Neben einer größeren Anzahl an DNA-Verlusten ist auch die Anzahl der DNA-Überrepräsentierungen deutlich höher verglichen mit invasiv lobulären Mammakarzinomen (6,2 pro Tumorfall vs. 2,7 pro Tumorfall). DNA-Gewinne auf Chromosom 1q und DNA-Verluste auf den Chromosomen 6q, 11q22- qter und 13q fanden sich in >=40% der Fälle in beiden histologischen Tumortypen. In invasiv duktalen Mammakarzinomen traten DNA-Gewinne mit größerer Frequenz auf den Chromosomen 6p, 8q, 11q13, 16p, 17q, 19p/q und 20q auf. Ebenfalls häufiger waren DNA-Deletionen auf den Chromosomen 2q, 3p, 4p/q, 5q, 7p, 8p, 9q, 10q und 15q zu finden. DNA-Verluste auf den Chromosomen 16q, 17p, 18q und 22q wurden dagegen vermehrt in invasiv lobulären Karzinomen detektiert. Gut (G1) und schlecht (G3) differenzierte invasiv duktale Mammakarzinome zeichnen sich durch ein unterschiedliches genetisches Muster aus. Während gut differenzierte Tumore durch DNA-Gewinne auf 1q, 11q11-13, 16p und 20q gekennzeichnet sind, weisen die schlecht differenzierten Tumore zusätzlich DNA-Deletionen im Bereich der Chromosomen 5q, 18q und 21q21 auf. Außerdem läßt sich ein unterschiedliches genetisches Muster bei Östrogenrezeptor- positiven und Östrogenrezeptor-negativen invasiv duktalen Mammakarzinomen feststellen. Die Östrogenrezeptor-negativen Tumore zeigen eine größere Anzahl an Alterationen, dazu gehören zusätzliche DNA-Überrepräsentierungen auf 1p, 6p und 22q und DNA-Verluste der Chromosomen 5q, 7p, 8p und 12q. Somit läßt sich feststellen, daß sich invasiv duktale und invasiv lobuläre Mammakarzinome durch ein wiederkehrendes Muster chromosomaler Veränderungen charakterisieren lassen. / The aim of the study was to analyze invasive ductal and invasive lobular breast carcinomas regarding to molecular DNA imbalances as well as different DNA imbalances in tumor subgroups of the invasive ductal carcinomas. Comparative genomic hybridization (CGH) was applied to analyze 30 invasive ductal and 20 invasive lobular breast carcinomas to carry out genetic alterations. In both tumor subgroups, DNA losses showed a higher incidence compared to DNA gains, suggesting a higher influence of inactivation of tumor suppressor genes in tumor progression. Invasive ductal carcinomas showed a higher incidence of alterations per case compared to invasive lobular carcinomas (14,9 vs. 8,9). Besides a higher incidence of DNA losses, particularly DNA gains were statistically significant in invasive ductal carcinomas (6,2 per tumorcase vs. 2,7 per tumorcase). DNA gains on chromosome 1q and DNA losses on chromosomes 6q, 11q22-qter and 13q were investigated in >=40% of all tumor cases. DNA gains were observed with a higher frequency in invasive ductal carcinomas on 6p, 8q, 11q13, 16p, 17q, 19p/q and 20q. Additionally, DNA losses showed a higher incidence on 2q, 3p, 4p/q, 5q, 7p, 8p, 9q, 10q and 15q compared to invasive lobular carcinomas. In contrast, DNA losses on 16q, 17p, 18q and 22q reached statistical significance in invasive lubular carcinomas. Well-differentiated (G1) and poorly differentiated (G3) invasive ductal carcinomas reflected different genetic imbalances. Well-differentiated carcinomas are associated with DNA gains on 1q, 11q11-13, 16p and 20q, whereas poorly differentiated tumors showed additional DNA losses on 5q, 18q and 21q21. Furthermore, the investigation indicated that the average number of alterations is correlated also to the estrogen receptor content of the invasive ductal carcinomas. Tumors with estrogen receptor negative content showed a higher incidence of alterations on the following regions, i.e., DNA gains on 1p, 6p and 22q and DNA losses on 5q, 7p, 8p and 12q. Consequently, invasive ductal and invasive lobular carcinomas are characterized by distinct patterns of chromosomal alterations.

Die Deckzellen des Urothels sind die einzigen Zellen, die mit dem Urin über einen längeren Zeitraum in direktem Kontakt stehen. Ihre apikale Plasmamembran weist ein facettiertes Aussehen auf und hat dicht gepackte Uroplakin III Moleküle eingelagert, die durch Ausbildung von hexagonalen Proteinkomplexen entscheidend sind für die hohe chemische Resistenz, gegen die zum Teil zellschädigende Zusammensetztung des Urins. Unterhalb der apikalen Plasmamembran befinden sich zahlreiche diskuide Vesikel. Diese entsprechen in ihrem molekularen Membranaufbau der apikalen Membran und können als präapikale Reservemembran angesehen werden, die bei Bedarf in die apikale Plasmamembran eingebaut werden kann. In der vorliegenden Arbeit ist untersucht worden, in wieweit SNARE-Proteine für die Fusion zwischen den diskuiden Vesikeln und der apikalen Plasmamembran von Bedeutung sind. In Immunoblotanalysen wurde das Vorkommen von Synaptobrevin, Syntaxin, SNAP23, NSF und alpha,beta-SNAP gezeigt und es konnte in Immunopräzipitationen die Ausbildung des SNARE-Haftkomplexes nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzuntersuchungen und Immunogoldmarkierungen bestätigten das Vorhandensein von SNARE-Proteinen und wiesen durch das subzelluläre Verteilungsmuster der Proteine auf einen kombinierten homotypischen und heterotypischen Fusionsmechanismus hin. Hinweise auf eine mit der Fusion der Vesikel gleichgeschaltete Endozytose wurden nicht gefunden, das Abknospen von Membranbestandteilen der apikalen Zellmembran konnte jedoch ultrastrukturell gezeigt werden. Ein weiterer Hinweis auf eine möglicherweise kontinuierliche Erneuerung der apikalen Zellmembran der Deckzellen konnte durch den Nachweis von Uroplakin III im Urin von gesunden Probanden gebracht werden. In einem Zentrifugationsexperiment wurde Uroplakin III in Fraktionen von Membranaggregaten sehr unterschiedlicher Größe nachgewiesen, was die ultrastrukturellen Befunde, die das Abknospen sowohl von einzelnen Vesikeln, wie auch von größeren Membranbestandteilen zeigten, bestätigt. / The luminal surface of the bladder epitehlium is continuously exposed to the urine that differs in ionic composition and osmolarlity from blodd. The apical plasma membrane of facet cells, facing the urine, is covered with rigid-looking plaques consisting of hexagonal uroplakin-particles. Together with tight junctions these plaques form a specialized membrane compartment that represents one of the tightest and most impermeable barrier of the body. Plaques also occur in the membrane of cytoplasmic discuid vesicles. Here we show that synaptobrevin, SNAP23, syntaxin, NSF and alpha/beta-SNAP are perfectly colocalized with uroplakin III at the apical plasma membrane and with the membrane of discuid vesicles. This distribution suggest that discuid vesicles of a homotypic and heterotypic fusion events. Furthermore we detected uroplakin III containing membranes of different size in the urine of healthy humans and rats. probably facet cells maintain their permeability barrier by a process of membrane renewal where pieces of the apical membrane are continuously taken off by freshly fused discuid vesicles.

Thema: Ziel der Studie war die Evaluierung der mobilen CT im intensivmedizinischen Einsatz Methodik: Es wurde eine Prozessanalyse der mobilen CT in einem Interventionsraum auf der Intensivstation sowie der ortsfesten CT in der radiologischen Abteilung vorgenommen. Der klinische Teil richtete sich auf die Evaluierung des intensivmedizinischen Personals bezüglich der Bewertung der mobilen CT. Weiterhin wurden die mit der mobilen CT untersuchten Patienten hinsichtlich ihrer Transportfähigkeit anhand intensivmedizinischer Bewertungssysteme bewertet. Ergebnisse: Die CT-Untersuchungen mit der mobilen CT im Interventionsraum haben einen leichten zeitlichen Vorteil gegenüber denen in der radiologischen Abteilung (55 vs 65 Minuten). Die mobile CT wurde von der Mehrheit des intensivmedizinischen Personals positiv bewertet, z.B. empfanden sie 81 % der Ärzte sowie mehr als 50 % der Pflegekräfte als Arbeitserleichterung. Bei vier der 24 untersuchten Patienten hätte es keine Alternative zur mobilen CT gegeben. Schlussfolgerung: Die mobile CT hat sich im klinischen Einsatz bewährt. Sie gewährleistet eine kontinuierliche intensivmedizinische Umgebung bei der CT-Untersuchung. Darüber hinaus ermöglicht sie bei nicht transportfähigen Patienten eine adäquate radiologische Diagnostik. / Purpose: To evaluate portable CT in ICU settings. Methods: Assessment of workflow of portable and stationary CT. Evaluation of ICU staff by questionnaire. Risk of transportation Assessment of examined patients by ICU-scores). Results: Examination by portable CT is little less time consuming compared to CT-examination in the radiology department (55 vs. 65 minutes). There was a great acceptance of portable CT by ICU staff. 81 % of ICU physicians and more than 50 % of nurses assessed portable CT as a reduction of work load. Portable CT could not have been missed in four of 24 examined patients for examination by computed tomography. Conclusions: Portable CT enables ICU-care to be continued during CT-examination. By Bedside CT patients can be examined who otherwise would have to abandon advanced radiologic diagnostic.

Bakterien der Gattung Shigella sind die Erreger der bakteriellen Ruhr beim Menschen. Der wesent-liche Virulenzfaktor der Shigellen ist ihre Fähigkeit zur Invasion. Die Invasion in Epithel-zellen ist Ausdruck des erregerspezifischen Infektionsprozesses, der gekennzeichnet ist durch eine vom Bakterium induzierte zelluläre Aufnahme über einen Phagozytose-ähnlichen Mechanismus. In dessen Verlauf führt die charakteristische Reorganisation des Zytoskeletts der Zelle zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur an der bakteriellen Eintrittsstelle. Als essentielles Glied der Signalisationskaskade vom Bakterium zum zellulären Zytoskelett erwies sich das kleine G-Protein Rho. Es wurde gezeigt, daß Rho als Regulator der Veränderungen des Zytoskeletts selbst an den bakteriellen Invasionslocus rekrutiert wird. Diese Rekrutierung umfaßt drei Isoformen von Rho: RhoA, RhoB und RhoC. Trotz hoher Sequenzhomologie der Isoformen untereinander ( 85% ) existiert ein unterschiedliches Rekrutierungsmuster dieser Isoproteine an der Eintrittsstelle von Shigella flexneri. RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum. Demgegenüber werden RhoB und RhoC in die bakterieninduzierten zellulären Protrusionen rekrutiert. Der Mechanismus dieser isoformspezifischen Rekrutierung ist nicht bekannt. Anhand unserer Experimente konnten wir zeigen, daß das allen kleinen G-Proteinen gemeinsame C-terminale Peptid-Motiv CAAX ( C = Cystein, A = aliphatische Aminosäure, X = Leucin ) eine wesentliche Voraussetzung für die Rekrutierung von Rho darstellt, sich die isoformspezifische Rekrutierung jedoch nicht anhand des CAAX-Motivs erklären läßt. Bedeutsam für die differentielle Rekrutierung der Isoproteine ist vielmehr die präterminale Region des Moleküls. Diese Beobachtung hat weitreichende Konsequenzen für die funktionelle Rolle von Rho bei der Epithelzellinvasion durch Shigella. / Shigella is the etiologic agent of human bacillary, an infectious large bowel disease. A major feature of Shigella's pathogenic potential is the capacity to invade epithelial cells. Shigella entry into epithelial cells is considered a parasite-induced internalization requiring cytosceletal rearrangements; Shigella entry induces a blossom-like membrane structure at the bacterial entry site. This membrane folding process is dependent on the small GTPase rho. It has been shown that three rho isoforms rhoA, rhoB and rhoC are recruited into bacterial entry sites with different localization relative to the membrane structures. While rhoA preferentially accumulates in close vicinity to entering bacteria, rhoB and rhoC are recruited into the tips of Shigella-induced cellular protrusions. We could show that the C-terminal CAAX-region of rho is a prerequisite for recruitment, but not sufficient for different recruitment of rho isoforms. Additional information for differential recruitment patterns seems to come from the preterminal region of rho proteins. This result is of great importance for the functional role of rho during Shigella-invasion into epithelial cells.

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals mit Hilfe von drei unterschiedlichen experimentellen Modellen der Einfluß von Adrenomedullin (ADM) auf die myokardiale Kontraktilität des Rattenherzens untersucht. Die Methodik umfaßte die Verwendung des isolierten Herzen nach Langendorff, des isolierten Papillarmuskelpräparats und der konfokalen Laserscan Mikroskopie bei adulten Kardiomyozyten. In keinem der Ansätze konnte ein direkter Effekt von ADM auf die Kontraktilität nachgewiesen werden. An isolierten adulten Kardiomyozyten hatte ADM weder Einfluß auf die systolische Zellverkürzung noch auf den gleichzeitig registrierten zytosolischen Kalziumgehalt. Auch an isolierten Papillarmuskeln verursachte ADM keine Änderung der maximalen Kraftentwicklung oder Kraftanstiegsgeschwindigkeit. Endothelin-1 wurde sowohl am Papillarmuskelpräparat als auch an isolierten, adulten Kardiomyozyten als Positiv-Kontrolle verwendet und verursachte in beiden Versuchsaufbauten einen deutlichen Anstieg der kontraktilen Parameter. Als dritte Methode wurde das isoliert perfundierte Herz nach Langendorff verwendet. Unter Gabe von ADM zeigte sich ein Abfall des koronaren Perfusionsdrucks, entsprechend den bereits bekannten vasodilatierenden Eigenschaften des Peptids. Dieser Effekt war zwar begleitet von einer Abnahme der kontraktilen Parameter der Herzen, allerdings ist am isoliert und flußkonstant perfundierten Herz eine Abnahme des koronaren Perfusionsdrucks aufgrund des Gregg-Phänomes mit einer Abnahme der Kontraktilität vergesellschaftet. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit kann daher der Schluß gezogen werden, das Adrenomedullin keinen Einfluß auf die Kontraktilität des Rattenherz hat. / The objective of this study was to investigate the influence of Adrenomedullin (ADM) on myocardial contractility of the rat heart in three different experimental models. First in the isolated rat heart preparation (Langendorf), second on the isolated papillary muscle preparation and third with confocal laserscan microscopy of isolated adult cardiomyocytes. None of these experimental models could show a direct effect of ADM on the contractility of the rat heart. In isolated adult cardiomyocytes, ADM had no influence on systolic cell shorting or on the simultaneously registered cytosolic calcium concentration. In isolated papillary muscle preparation ADM administration did not change maximal contractile force or time constants of contraction. Endothelin-1 was used as a positive control in both experimental setups and induced a marked increase in contraction parameters. In the isolated rat heart preparation (Langendorff), ADM induced a decrease of the coronary perfusion pressure, reflecting the already well described vasodilatatory properties of this peptide. This decrease was paralleled by a reduction of the contractile parameters of the heart, but in isolated rat heart preparations with constant coronary flow, a reduction of coronary perfusion pressure is always paralleled by a decrease of contractility due to the Gregg-Phenomenon. In conclusion the results of this study show that Adrenomedullin has no influence on myocardial contractility in the rat heart.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen zu zellulären Mechanismen ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden. Es wurde dabei zunächst die ANCA-induzierte Aktivierung neutrophiler Granulozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Quervernetzung der ANCA-Antigene auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten die Generation von Sauerstoffradikalen auslöst. Der zweite Komplex beschäftigte sich mit der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten, die einen zentralen Mechanismus für die Auflösung von Entzündungen darstellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Apoptose neutrophiler Granulozyten durch IL-8 verzögert und durch TNF-alpha akzeleriert wird. Dabei führt die Interaktion mit extrazellulären Matrixsubstanzen wie Fibronektin zu einer weiteren Akzeleration der TNF-alpha-induzierten Apoptose. Die Bedeutung der Tyrosin Phosphorylierung für diesen Prozess wird gezeigt, und Ly-GDI, ein regulatorisches Protein für kleine GTPase-Proteine der Ras-Superfamilie, wurde als ein Substrat der Tyrosin-Kinasen charakterisiert. Letztlich konnten neue Kandidaten-Proteine für die Regulation der Lebensspanne neutrophiler Granulozyten identifiziert werden. / Mechanisms of ANCA-associated vasculitis were studied. First, the activation of human neutrophils by ANCA was investigated. The data demonstrate the important role of cross-linking ANCA-antigens by the auto-antibodies on the cell surface for the initiation of a respiratory burst. The second issue was the regulation of neutrophil apoptosis that is central to the resolution of inflammation. These experiments indicate that apoptosis was delayed by IL-8 and accelerated by TNF-alpha. Interaction with extracellular matrix proteins, such as fibronectin resulted in further acceleration of apoptosis. The important role of protein tyrosine phosphorylation was demonstrated, and Ly-GDI, a regulator of GTPase-proteins of the ras-superfamily was characterized. Finally, proteins that may control the life span of neutrophils were identified.

Für die Diagnose und das Monitoring des Sézary Syndrome haben sich zwei hauptsächliche Herangehensweisen etabliert: die Immunophänotypisierung und PCR basierte T-Zell-Rezeptor (TCR)-Gen-Rearrangement Analyse. Die verminderte Expression von T-Zell-Antigenen auf im Blut zirkulierenden Lymphozyten ist beim Sézary Syndrom beschrieben, insbesondere der Antigene CD7 und CD26. Jedoch ist die Verteilung des genetisch definierten Tumorzellklons auf die CD7 und CD26 positiven bzw. negativen Subpopulationen bisher nicht untersucht worden. Aus diesem Grund etablierten wir eine qualitative sowie eine quantitative klonspezifische PCR und bestimmten die Verteilung der klonalen Zellen auf diese Subpopulationen. Diese Daten wurden anschließend in Beziehung zur Klinik und zur Prognose der Patienten gesetzt. Für jeden unserer fünf Sézary Syndrom Patienten wurde die Sequenz des klonalen TCR-gamma und TCR-beta Rearrangementes ermittelt. Es erfolgte eine durchflußzytometrische Analyse der PBMC hinsichtlich der CD7 und CD26 Expression. Anschließend wurde für jeden Fall eine klonspezifische qualitative und quantitative (real-time) PCR etabliert. Mit Hilfe dieser PCR untersuchten wir das Vorhandensein und die Frequenz klonaler Zellen in den sortierten Subpopulationen. Die FACS-Analyse ergab bei unseren Patienten im Vergleich zu den Kontrollen eine verminderte CD7 und CD26 Expression der Lymphozyten. In der qualitativen PCR konnten klonale Zellen sowohl in der CD7+ und CD7- Population gezeigt werden, gleiches gilt für die CD26 Populationen. Die quantitative PCR zeigte, dass der dominante T-Zell-Klon sowohl CD7+ als auch CD7- sein kann, wohingegen CD26- Tumorzellen bei weitem überwiegen. Hinsichtlich Klinik und Prognose deutete sich an, das ein CD7+ Tumorzellklon eine bessere Prognose für den Patienten bedeuten kann. Zusammenfassung: Die Tumorzellen des Sézary Syndrom zeigen einen CD3+CD7+CD26- sowie CD3+CD7-CD26- Phänotyp. Aus diesem Grund kann bei dieser Erkrankung die Tumorzelllast im Blut über die Bestimmung der CD3+CD26- Zellen erfolgen. Die Signifikanz eines CD7+ Tumorzellkolons in Bezug zur Prognose muß an einem größeren Patientenkollektiv überprüft werden. / Introduction: For diagnosis and monitoring of the Sézary syndrome (SS) two crucial approaches are applied: immunophenotyping and PCR based T-cell receptor (TCR)-gene rearrangement analysis. The absence of T-cell antigens, in particular CD7 and CD26, on peripheral circulating tumor cells has been described in SS patients. However, the prevalence of the genetically identified malignant T-cell clone in CD7 and CD26 positive and negative subsets in SS has never been investigated so far. Thus we have performed qualitative and quantitative PCR based turmor cell determination in the corresponding FACS-separated T-cell fractions. These data were then correlated to clinical outcome and prognosis. Methods: For each of five SS patients with a total of 15 peripheral blood samples the sequences of clonal TCR-gamma and/or TCR-beta rearrangements were established. Then clone-specific qualitative und quantitative (real-time) PCR have been developed for each case. Using these PCR, we estimated presence and frequency of tumor cells in FACS-sorted CD3+CD7+/- as well as CD3+CD26+/- T-cell subsets. Results: The qualitative PCR showed that the malignant T-cells can be both: CD7 positive or negative, the same is true for CD26. The quantitative PCR demonstrated that CD7+ as well as CD7- tumor cells can occur simultaneously whereas CD26- tumor cells predominate by far. The individual tumor cell phenotypes did not fluctuate substantially in the disesase course, but considerable interindividual variations were seen. Furthermore we found in our patients, that CD7+ tumor cells may be a factor for a more favourable prognosis. Conclusions: The tumor cells in SS have mostly a CD3+CD7+CD26- as well as CD3+CD7- CD26- phenotyp. Thus, the tumor burden in this disease can be assessed by an estimation of the CD26- T-cells. The significance of a CD7+ t-cell clone for a better prognosis has to be re-evaluated in a larger patient-collective.

Einleitung: Das p53 Tumorsuppressorgen spielt eine zentrale Rolle für Regulation des Zellzyklus und die Induktion der Apoptose. MDM2, das Protein des mdm2 Gens, bindet an p53, hemmt seine Funktion als Transkriptionsfaktor und bewirkt den raschen Abbau des Proteins. Methode: Gefriergewebe von 178 primären Ovarialkarzinomen wurde mittels PCR, SSCP Single Strand Conformation Polymorphism), DNA-Sequenzierung und Immunhistochemie auf p53 Mutationen (exon 2-11) und p53 Proteinüberexpression untersucht. Das mdm2-Gen wurde an 92 Ovarialkarzinomen, neun Borderline-Tumoren, sechs Cystadenomen und 20 normalen Ovargeweben mittels reverse Transkriptase PCR der Gesamt-RNA und Sequenzierung der mdm2-cDNA auf alternatives RNA-splicing untersucht. Ergebnisse: p53 Mutationen waren in 56% (99/178) und eine p53 Proteinüberexpression in 62% (110/178) der Ovarialkarzinome nachweisbar. Bei p53 Mutationen war die rezidivfreie und Gesamtüberlebenszeit der Patientinnen signifikant kürzer als bei p53 Wildtyp (p=0,029 und p=0,014). Patientinnen mit p53 Überexpression (p=0,001) oder p53 missense Mutationen (p=0,008) waren signifikant häufiger resistent oder refraktär gegen eine Chemotherapie mit Cis- oder Carboplatin und Cyclophosphamid als Patientinnen mit normalem p53. mdm2 alternatives oder aberrantes RNA splicing war in 66/92 (72%) der Ovarialkarzinome, 7/9 (78%) der Borderline-Tumore, 5/6 (83%) der Cystadenome und 11/20 (55%) der normalen Ovargewebe nachweisbar. Eine Gesamtzahl von 30 verschiedenen Splice-Varianten-Sequenzen wurde identifiziert, von denen 22 einen partiellen oder vollständigen Verlust der p53 Bindungsstelle aufwiesen. Bei 28/30 der Sequenzen fand das splicing nicht an Exon/Intron-Grenzen statt, so daß diese als aberrantes Splicing klassifiziert wurden. Eine splice-Variante von 654 bp (mdm2b) wurde in 41% der Ovarialkarzinome, aber nur 11% (1/9) der Borderline-Tumore und 5% (1/20) der normalen Ovargewebe exprimiert. Die Expression von mdm2b in Ovarialkarzinomen korrelierte signifikant mit schlechtem Differenzierungsgrad (p=0,004), Resttumor nach Operation (p=0,004), hoher S-phase-Fraktion (p=0,016) und p53 Proteinüberexpression (p=0,018). Eine kürzere Splice-Variante von 221 bp war in nur 16% der Ovarialkarzinome, 56% der Borderline-Tumore und 40% der normalen Ovargewebe nachweisbar und korrelierte mit frühem Stadium (p=0,017) und längerem Gesamtüberleben (p=0,048) bei Ovarialkarzinom. Zusammenfassung: p53 Alterationen korrelieren in der univariaten Analyse signifikant mit einer Resistenz gegen eine platinhaltige Chemotherapie, frühem Rezidiv und kürzerem Gesamtüberleben bei Ovarialkarzinom. In der multivariablen Analyse ist p53 jedoch kein unabhängiger Prognosefaktor. mdm2 alternatives und aberrantes Splicing sind in Ovarialkarzinomen häufig, kommen aber auch in normalem Ovargewebe vor. Während die Expression der mdm2b Splice-Variante mit histologisch aggressiveren Tumoren assoziiert war, kamen kürzere Splice-Varianten typischerweise in frühen Ovarialkarzinomen und benignen Geweben vor. mdm2 Alterationen stabilisieren möglicherweise das p53 Protein und führen ohne Vorhandensein einer p53 Mutation zu einer Proteinakkumulation in Ovarialkarzinomen. / Objective: The p53 tumor suppressor gene plays a central role in cell cycle regulation and induction of apoptosis. MDM2, the protein of the mdm2 gene, binds to p53, inhibits its transcriptional activity and promotes nuclear export and rapid degradation of the p53 protein. Methods: Frozen tissue of 178 ovarian carcinomas was analyzed for mutations of the p53 gene (exons 2-11) and p53 overexpression by SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), DNA-sequencing and immunohistochemistry. 92 cases of ovarian cancer, nine borderline ovarian tumors, six cystadenomas and 20 normal ovarian tissues were analyzed for mdm2 alternative RNA splicing by reverse transcription of total RNA, nested PCR amplification of mdm2 cDNAs and DNA sequencing of RT-PCR products. Results: p53 mutations were found in 56% (99/178) and p53 protein overexpression in 62% (110/178) of the tumors. Time to progression and overall survival were significantly shortened in patients with p53 mutations compared to wildtype p53 (p=0.029 and p=0.014). Resistance to adjuvant Cis- or Carboplatin chemotherapy was significantly more frequent in patients with p53 overexpression (p=0.001) or p53 missense mutations (p=0.008) than patients with normal p53. mdm2 RNA splicing was seen in 66/92 (72%) of the ovarian carcinomas, 7/9 (78%) of borderline tumors, 5/6 (83%) of benign cystadenomas and 11/20 (55%) of the normal ovarian tissues. A total of 30 splice variant sequences were identified, out of which 22 had a partial or complete loss of the p53 binding site. 28/30 do not splice at exon/intron boundaries and were therefore considered aberrant splice variants. The mdm2b splice variant of 654 bp, which splices out most of the p53 binding domain, was expressed in 41% of ovarian carcinomas, but only in 1/9 (11%) LMP tumors, and 1/20 (5%) of the normal ovaries. Expression of mdm2b in ovarian carcinomas was significantly correlated with poor grade of differentiation (p=0.004), residual tumor after surgery (p=0.004), high S-phase fraction (p=0.016) and p53 protein overexpression (p=0.018). A small splice variant of only 221 bp was present in only 16% of the ovarian carcinomas, but 56% of borderline tumors, and 40% of normal ovarian tissues and was correlated with early stage of ovarian cancer (p=0.017) and longer overall survival (p=0.048). Conclusion: p53 alterations correlate significantly with resistance to platinum-based chemotherapy, early relapse and shortened overall survival in ovarian cancer patients in univariate analysis. In multivariable analysis though, p53 was not an independent prognostic factor. mdm2 alternative and aberrant splicing was found frequently in ovarian tumors but also in normal ovarian tissue. While expression of the mdm2b splice variant was associated with histologically more aggressive ovarian carcinomas, smaller size variants were typically seen in early stage ovarian carcinomas and benign tissues. mdm2 alterations may stabilize p53 protein and cause p53 accumulation in the absence of p53 mutation in ovarian tumors.