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Recently the suspected precursor lesions of ductal adenocarcinoma of the pancreas have been called Pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) and graded according to the degree of dysplasia. To correlate each grade of PanIN with molecular genetic alterations, we determined the frequency of allelic losses at chromosomal arms 9p (the location of the p16 gene), 17p (p53 gene) and 18q (DPC4/SMAD4 gene) in 81 microdissected PanINs, using a combination of whole genome amplification and microsatellite analysis. In addition, p53 and Dpc4 protein expression was determined by immunohistochemistry. Essentially no allelic losses were identified in the non-dysplastic PanIN-1 lesion. In PanIN-2 with low grade dysplasia the frequency of allelic losses at chromosomal region 9p, 17p and 18q was 20%, 33% and 17%, respectively, which increased to 46%, 77% and 58%, respectively, in PanIN-2 with moderate dysplasia, to 87%, 60% and 88% in PanIN-3 with high grade dysplasia, and to 100%, 91%, and 82% in the invasive carcinomas. The progressive occurrence of allelic losses at all three loci strongly supports the PanIN progression model for pancreatic carcinoma. Nuclear p53 and loss of Dpc4 protein expression was associated only with PanIN-3 and invasive carcinomas, consistent with the model that inactivation of p53 and DPC4 are late events in pancreatic carcinogenesis. Since the aberrant protein expression patterns, were preceded, however by a sharp increase in allelic losses from PanIN-2 with low grade dysplasia to PanIN-2 with moderate dysplasia it is suggested that the increasing grade of dysplasia in the PanIN lesions identify biologically relevant steps towards invasive carcinoma. The discrepancy between alleic loss frequencies and p53 and DPC4 expression also raises the possibility that additional tumor suppressor genes on chromosomes 17p and 18q promote early pancreatic carcinogenesis.

Untersuchungen zur Rolle des oberen Gastrointestinaltraktes in der Verwertung von Milcholigosacchariden: Verdauung und Transport. In Bezug auf den Gehalt (5-8 g/l) und des komplexen Musters an auf Lactose basierenden Oligosacchariden ist die humane Milch einzigartig unter den Säugetieren. Bisher ist nur sehr wenig über die Funktion von Frauenmilcholigosacchariden (FMO) bekannt. In dieser Arbeit wurde die Verdaubarkeit von FMO durch Glycosidasen des oberen Gastrointestinaltraktes und eines magenähnlichen pH-Wertes sowie deren Transport untersucht. Während einer 2 h Inkubation von FMO mit humaner Speichelamylase sowie Pankreasamylase des Schweins wurden die Oligosaccharide nicht angegriffen. Auch konnten keine Auswirkungen eines pH von 2,5 auf die Struktur neutraler FMO nachgewiesen werden. Im Gegensatz hierzu führte dieser bei sauren, d.h. sialylierten Komponenten, zu einer minimalen Abspaltung von Sialinsäure. Da isolierte Disaccharidasen aus dem humanen Dünndarm nicht verfügbar waren, wurden Bürstensaummembran-Vesikel (BBMV) aus dem des Schweines verwendet. Während einer 24 h Inkubation von FMO mit BBMV wurden minimale Mengen an nicht fucosylierten und/oder sialylierten Oligosacchariden angegriffen. Hierbei wurden Glucose, Lacto-N-Triose und Lactose freigesetzt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden Transportstudien an Caco-2-Zellen durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß nur für neutrale FMO ein gerichteter Flux über das Monolayer vorlag, nicht aber für saure Komponenten. Dieser gerichtete Flux ging bei 15 °C verloren, was auf einen endocytotischen Transport der neutralen Oligosaccharide hindeutet. Der Flux über das Monolayer betrug ca. 2% der apikal angebotenen FMO. Mittels HPLC-MS, unter Verwendung einer Hypercarbsäule, analysierte intrazelluläre Fraktionen zeigten eine gerichtete Aufnahme von neutralen FMO, wohingegen keine sialylierten Oligosaccharide nachweisbar waren. Nach Gabe von Brefeldin A, einem Inhibitor des endocytotischen Transportes, kam es zu einer Anreicherung des intrazellulären Gehaltes an neutralen FMO sowie einer Abnahme des transepithelialen Fluxes, so daß für diese Komponenten ein endocytotischer Transport postuliert werden kann. Die Aufnahme in die Zelle unterlag für Lacto-N-Tetraose einer Sättigung mit einem Km von 1,4 mmol/l und Vmax von 18,5 nm

Formine sind an einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wie u. a. der Zytokinese, Endozytose oder auch der Vermittlung von Zellpolarität beteiligt, da sie Schlüsselregulatoren des Aktin- und Mikrotubulizytoskeletts sind. Durch carboxyterminale Formin-Homologie (FH)-Domänen wird die Bildung von Aktinfilamenten vermittelt. Unabhängig davon konnte für einige Formine eine Beteiligung an der Mikrotubulidynamik nachgewiesen werden.Das Genom des filamentösen Pilz Ashbya gossypii codiert für die drei Formine: AgBNI1, AgBNR1 und AgBNR2. Im Fokus der Arbeit stand die Aufklärung der molekularen und zellulären Funktion von AgBnr2. Mit biochemischen Versuchen zur molekularen Analyse konnte sowohl die Fähigkeit zur Aktinpolymerisierung, als auch zur Co-Sedimentierung mit Mikrotubuli für die carboxyterminalen FH-Domänen von AgBnr2 gezeigt werden. Mit Hilfe von in vivo Experimenten, wie Mutantenanalyse, Co-Lokalisierungsstudien und Hefe 2-Hybrid Versuchen konnten die Ergebnisse bestätigt werden. Nach der Repression von AgBNR2 in einem Agbnr1 Deletionsstamm konnten Sporulationsdefekte beobachtet werden. Für das Formin AgBnr2 konnte weiterhin die Wechselwirkung und Co-Lokalisierung mit dem Homolog des sporulationsspezifischen Proteins ScSpo21 nachgewiesen werden, was auf eineBeteiligung des Formins an der Sporulation hindeutet. Durch mikroskopische Untersuchungen und in vitro Versuchen mit gereinigten Zellkernen wurde der Nachweis erbracht, dass AgBnr2 während der Sporulation Aktinfilamente am Zellkern polymerisieren kann.Die Ergebnisse enden in dem Modell zur Bnr-vermittelten Verankerung von Aktinfilamenten am Zellkern. Die Filamente dienen während der Sporenbildung möglicherweise dem Transport von Vorläufervesikeln, die u. a. zur Bildung der Prosporenmembran genutzt werden. Dieses Modell scheint innerhalb der Hemiascomyceten Gültigkeit zu besitzen. Ergänzende Versuche mit ScBnr1 aus S. cerevisiae, dem Homolog zu AgBnr2, weisen auf eine konservierte Funktion der Bnr-Formine hin.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten der Assoziation von Saccharose-Synthase (SUS) mit subzellulären Strukturen. Durch cDNA-Durchmusterungen konnten proteinogene Bindepartner von SUS sowie Aktin identifiziert und zum Teil verifiziert werden. Die dritte Isoform SuS3 aus Mais wurde auf molekularer Ebene identifiziert und das rekombinante Protein biochemisch charakterisiert. Trotz signifikanter Sequenzunterschiede zwischen den SUS-Isoformen, wurden ähnliche katalytische Eigenschaften und mögliche posttranslationale Modifikationen der Enzyme nachgewiesen, darunter die Redox-Modifikation der Enzymaktivität und das Potential zur reversiblen Phosphorylierung. Der Einfluss der Phoshorylierung von SUS auf dessen enzymatische und assoziative Aktivität wurde mittels mutagenisiertem Protein untersucht und zeigte kein stark verändertes Verhalten infolge der Mutationen. Eine metabolische Regulation der SUS-Aktin-Wechselwirkung durch Zucker konnte bestätigt und die katalytische Aktivität von SUS in Gegenwart von Aktin gezeigt werden. Assoziationsstudien von Aktin mit synthetischen Peptiden sowie immunologische Untersuchungen lieferten Hinweise für die Aktinbindedomäne in SUS. Co-Pelletierungsexperimente zeigten die Assoziation von SUS mit Mikrotubuli aus Rinderhirn. In vitro konkurriert SUS mit Aldolase um die Bindung an Miktotubuli. Als proteinogene Bindepartner von SUS wurden einige im Kohlenhydratstoffwechsel sowie im 26S-Proteasom-Komplex involvierte Proteine identifiziert. Ebenso wurde eine Glutathion-Peroxidase identifiziert, die ubiquitäre Transkriptakkumulation dokumentiert und die katalytische Aktivität des rekombinanten Proteins gezeigt. Eine weitere cDNA-Durchmusterung führte zur Identifikation verschiedener glykolytischer Enzyme als potentielle Interaktionspartner von Mais-Aktin sowie zu Bindepartnern, die nach Sequenzanalyse Domänen mit Homologien zu bekannten ABPs aus tierischen Organismen zeigten.

Biological tubes possessing a curvilinear form and a hollow interior exist in most multicellular eukaryotes. In Eumetazoa, the tubes usually comprise an eminently complex network and enable the transport and exchange of fluids and gases between tissues and organs, but also between organisms and their environment. Thus, tubular structures are both morphologically and physiologically integral parts of the animals. Based on a genetic screen for novel factors involved in heart tube differentiation and morphogenesis in Drosophila, the identified mutants were subdivided into several classes: cardiac hyperplasia (kuz and mam, both involved in the Notch-dependent cardiomyocyte specification, Publication 1); impaired cytokinesis (pav and tum, both components of the centralspindlin complex); a single ptc mutant showing a “truncated” heart (Publication 2); and a single loss-of-function mutant displaying reduced lumen diameter in epithelial tubes and perturbed secretion of ECM-components. The latter allele was mapped to the gene locus gartenzwerg (garz) that encodes a large ArfGEF. Due to its novelty, garz was selected as a central part of the thesis (Publication 3). Although garz seems to be expressed ubiquitously, its transcripts are abundant in active secreting cells of tubular structures. Moreover, mutations of garz abolish Golgi-integrity, cause massive retention of secretory cargo in the ER and arrest the apical transport of lipids and ECM molecules. As a consequence, lumen of the salivary glands and trachea fail to expand and show a decreased diameter. The observed phenotypes in tracheal network and salivary glands phenocopy those of COPI/COPII-subunits as well as actin-dependent secretion mutants, suggesting the underlying mechanism might be common. Thus, it is supposed that proper tubulogenesis needs Garz for initiation of the Arf1-COPI machinery. Furthermore, Golgi-based post-translational modifications, targeted sorting of vesicles, outward transport of proteins, or directed membrane delivery all depend on the secretory pathway, and such processes are essential in establishing polarized cells which build the tubular structures. In conclusion, this mechanism seems to be neither restricted to tubulogenesis nor specific to Drosophila. Due to the presence of garz homologues in every eukaryotic genomes, the Arf1/COPI based secretory pathway may play a universal role in metazoan development.