Die Studie beinhaltet eine biochemisch-molekularbiologische Analyse des 20S-Proteasoms und seiner Aktivierung durch Proteine der PA28-Familie. Das 20S-Proteasom ist die zentrale Epitop-prozessierende cytosolisch-nukleäre Protease des MHC-Klasse-I-Antigenpräsentationsweges. In Mikroglia, wie auch in anderen Zellen, unterliegt das Proteasom einer Interferon-g-(IFN-g)-vermittelten strukturellen Plastizität, d.h. einer Substitution der Untereinheiten der Aktiven Zentren. Durch diesen Austauschmechanismus werden proteolytische Schnittpräferenzen modifiziert, was für die Hierarchie von cytotoxischen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Lipopolysaccharide (LPS) bewirken in Mikroglia ebenfalls Veränderungen der proteasomalen Zusammensetzung des 20S-Komplexes und seines PA700-Aktivators. Dies ist ein Hinweis auf die Rolle des Proteasoms auch bei der Prozessierung von Antigenen des endolysosomalen Antigenpräsentationsweges. Die Modulation der Zusammensetzung des 20S-Proteasoms in Mikroglia durch IFN-g und LPS ist ein weiterer Beleg für die Rolle der Mikroglia bei der zellulären Immunantwort im Zentralnervensystem. Funktionen des Proteasoms in der MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation werden durch den Proteasomaktivator PA28 optimiert. Die PA28-Proteinfamilie besteht aus den Proteinen PA28a, PA28b und PA28g. Diese Studie trägt - basierend auf kinetischen Modellierungen, Mutagenese- und Protein-Protein-Interaktionsstudien und Untersuchungen zur MHC-Klasse-I-Antigen-präsentation in PA28-Transfektanten - zur funktionellen Neubewertung dieser drei Proteine bei. Die drei PA28-Proteine sind autonome Aktivatoren des Proteasoms. Heteromere PA28ab-Komplexe verursachen eine stärkere Aktivierung des Proteasoms als die homomeren PA28a-oder PA28b-Komplexe. Das PA28g-Protein ist in vitro ein schwacher Aktivator verschiedener proteasomaler Peptidaseaktivitäten, der dennoch in unserem in vivo-Modell eine verbesserte MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation bewirkt. Kinetische Argumente sprechen für Funktionen der PA28a und PA28b-Proteine als Translokasen für Peptidsubstate und -produkte des Proteasoms. Anhand des HBx-Proteins des Hepatitis B-Virus wird die Möglichkeit illustriert, das vorgestellte Modell zur Analyse viraler Faktoren anzuwenden, die mit der Aktivierung des Proteasoms durch PA28 interferieren. / The 20S proteasome is the proteolytic core complex of the main cytoplasmic and nuclear protein degradation system. One of the numerous functions assigned to the 20S proteasome is the generation of antigenic peptides from intracellular proteins. MHC class I surface presentation of antigenic peptides is one key event of the cellular immune response. The presented study was aimed on the biochemical and molecular-biological analysis of the 20S proteasome and its activation by regulatory proteins of the PA28 family. In the brain, microglial cells are the major antigen presenting cells and they respond sensitive to pathologic events. Cultured mouse microglia was used as a model to study the correlation between microglial activation parameters and structural plasticity of the 20S/26S proteasome. In response to interferon-g , constitutive active site subunits were replaced by inducible subunits as described for other cellular systems. These replacements result in altered proteolytic cleavage preferences, indicating that activated microglia adapts its proteasomal subunit composition to the requirements of an optimized MHC class I epitope processing. Since lipopolysaccharide (LPS), a glycolipid of bacterial pathogens, also alters proteasome subunit composition of the 20S proteasome and its activator PA700, a function of microglial proteasome in processing of antigens of the endolysosomal pathway has been postulated. The modulation of the 20S proteasome subunit composition indicates that microglia is part of the cellular immune response in the central nervous system. The proteasome activator PA28 has been reported to optimize MHC class I antigen presentation. The PA28 protein family is composed of three proteins: PA28a, PA28b and PA28b. Based on kinetic modelling approaches, mutagenesis of activator proteins, protein-protein interaction studies and investigation of MHC class I antigen presentation in PA28-transfected cell lines a evaluation of functions of these three proteins has been performed. In vitro investigations revealed that the recombinant PA28 proteins are activators of peptidase activities of the proteasome. Heteromeric PA28ab complexes are stronger activators than homomeric PA28a o PA28b complexes. Recombinant PA28g is a weak activator of several peptidase activities. Nevertheless, in PA28g transfected B8-fibroblasts preliminary results indicate an improved MHC class I presentation. Based on kinetic evidence, a model has been presented indicating that PA28a and PA28b proteins act as peptide translocases, performing the import of substrates or the export of products into the catalytic chamber of the 20S proteasome. Finally, as examplified with the HBx protein of Hepatitis B virus, the opportunity is presented to use an in vitro reconstitution system of proteasomal activation to examine viral proteins interfering with proteasomal activation.

Heterocyclen mit einer a-Hydroxycarbonyl-Einheit wie 3-Hydroxy-[1,5]-benzothiazepin-4-one oder 3-Hydroxychroman-4-one sind von Interesse, da sie Bestandteil von Pharmazeutika (z. B. Diltiazem®) oder Naturstoffen (z.B. die Flavonoide) sind. Ringtransformationen von optisch aktiven Glycidaten mit Binucleophilen stellen eine nützliche Synthesemethode zur Darstellung solcher Produkte dar. In Abhängigkeit von der Position des Angriffes des Nucleophiles am Oxiranring (a- oder b-Angriff) werden zwei Produkttypen mit verschiedenen Ringgrößen gebildet. Der Ablauf der Reaktion hängt vom Binucleophil, von den Substituenten am Oxiran und von den Reaktionsbedingungen ab. 4-Hydroxypyrazolidin-3-one werden bei der Reaktion von Glycidaten mit Hydrazinen gebildet. Reaktionen mit 1-Amino-2-mercapto-Verbindungen geben ausschließlich [1,4]-Thiazin-3-one. Gelenkt durch die Substituenten am Oxiran reagieren Glycidate mit o-Phenylendiaminen entweder zu Tetrahydro-chinoxalin-2-onen oder zu 3-Hydroxy-[1,5]-benzodiazepin-2-onen. Bei der Bildung der Tetrahydro-chinoxalin-2-one aus unsymmetrisch substituierten o-Phenylendiaminen wird eine hohe Regioselektivität beobachtet. Epoxyamide, gebildet aus Glycidsäuren und o-Aminophenol, cyclisieren unter basischen Bedingungen zu 1,4-Benzoxazin-3-onen, während in Gegenwart einer Lewis-Säure 3-Hydroxy-[1,5]-oxazepin-4-one gebildet werden. Reaktionen von Oxiran-carbonsäureamiden mit o-lithiierten Phenolderivaten führen zu Epoxyketonen, die zu 2-Alkyliden-cumaranonen oder 3-Hydroxychroman-4-onen transformiert werden können. Ohne Inanspruchnahme der Carbonylgruppe sind [1,4]-Benzoxazine durch die Reaktion von Glycidaten mit o-Aminophenolen erhältlich. Alle Ringtransformationen verlaufen stereoselektiv, so daß enantiomerenreine Produkte erhalten werden. / Heterocycles with an a-hydroxycarbonyl moiety such as 3-hydroxy-[1,5]-benzothiazepin-4-ones or 3-hydroxychroman-4-ones are of interest because they are frequently encountered in pharmaceuticals (e.g. Diltiazem®) or natural products (e.g. flavonoids). Ring transformation of optically active oxirane carboxylic acid derivatives with ambident nucleophiles provide a useful synthetic method for such type of products. Depending on the position of attack on the oxirane ring by the nucleophile (a- or b-attack) two types of products with different ring sizes are formed. The mode of reaction depends on the type of binucleophile, the substituents at the oxirane, and the reaction conditions. 4-Hydroxypyrazolidin-3-ones are formed in the reaction of glycidates with hydrazines. Reaction of 1-amino-2-mercapto nucleophiles exclusively afforded [1,4]-thiazin-3-ones. Governed by the substituents at the oxirane on the reaction of glycidates with o-phenylendiamines result either in tetrahydroquinoxalin-2-ones or 3-hydroxy-[1,5]-benzodiazepin-2-ones. In the formation of tetrahydroquinoxalin-2-ones from asymmetrically substituted o-phenylendiamines, high stereoselectivity was observed. Epoxyamides, formed from glycidic acids and o-aminophenols, cyclize to [1,4]-benzoxazin-3-ones under basic conditions while 3-hydroxy-[1,5]-oxazepin-4-ones are formed in the presence of a Lewis acid. Reaction of oxirane carboxylic acid amides with o-lithiated phenol derivatives afforded epoxyketones that could be transformed to 2-alkyliden-coumaranones and 3-hydroxychroman-4-ones. Without the use of the carbonyl group [1,4]-benzoxazines are available in the reaction of glycidates with o-aminophenols. All ring transformations were highly stereoselective giving enantiomerically pure products.

Die genetischen Polymorphismen der humanen Biotransformationsenzyme Glutathion-S-Transferase Theta 1 (GSTT1-1) und Arylamin-N-Acetyltransferase 1 (NAT1) wurden zu Beginn der neunziger Jahre entdeckt. Es besteht derzeit ein großes Interesse an Untersuchungen zur Häufigkeit der Allele, zu deren phänotypischen Konsequenzen und pharmakologisch-toxikologischer Relevanz. Für die Untersuchungen in dieser Arbeit standen die Blutproben von 314 gesunden, deutschen Probanden mit bekanntem GSTT1- und/oder NAT1-Genotyp zur Verfügung. Es wurden Methoden etabliert und validiert, um im Hämolysat die Reaktionsgeschwindigkeiten bei der Umsetzung des GSTT1-1-spezifischen Substrats Dichlormethan sowie des NAT1-spezifischen Substrats p-Aminobenzoesäure mit vertretbarem Laboraufwand zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine vollständige Übereinstimmung zwischen der homozygoten GSTT1-Gendeletion und dem defizienten Phänotyp bei 19,3% der Individuen gefunden. Bei 80,7% der Probanden war durch Genotypisierung mindestens ein GSTT1*A-Allel identifiziert worden. Mit Hilfe der Phänotypisierung konnten in dieser Gruppe zwei Phänotypen, der intermediäre und der hoch aktive Phänotyp, voneinander abgegrenzt werden. Damit bestand der Vorteil der Phänotypisierung darin, eine trimodale Verteilung der GSTT1-1-Aktivität nachweisen zu können. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig in einer größeren deutschen Population gezeigt. Weiterhin wurden in dieser Arbeit untersucht, ob zwei Phosphonsäurediester des Glutathions, die sich als kompetitive bzw. nicht-kompetitive Hemmstoffe anderer GST-Isoenzyme erwiesen hatten, sowie der Arzneistoff Tactin, ein Medikament zur Behandlung des Mobus Alzheimer eine Hemmwirkung auf die GSTT1-1-vermittelte Umsetzung von Dichlormethan besitzen. Gegenwärtig sind 24 verschiedene NAT1-Allele bekannt, wobei einige davon sehr selten auftreten. In der hier verwendeten deutschen Population waren sechs NAT1-Allele identifiziert worden. In den Blutproben der 105 Probanden wurde die funktionelle Konsequenz dieser Allele bestimmt. In vorliegender Arbeit wurde erstmalig für einen homozygoten Träger des NAT1*15-Allels das Fehlen jeglicher Enzymaktivität nachgewiesen. Bezüglich der Häufigkeit der GSTT1-Gendefizienz sowie des NAT1*11-Allels wurden in vorliegender Arbeit zwischen europäischen, d.h. einander ethnisch nahestehenden Bevölkerungsgruppen statistisch signifikante Unterschiede gefunden. / The genetic polymorphisms of the glutathione S-transferase theta 1-1 (GSTT1-1) and the arylamine N-acetyltransferase 1 (NAT1) were found in the beginning of the 90's. There is a great interest in genotype-phenotype relations in individuals and in pharmacological and toxicological consequences of the polymorphisms. In this work, hemolysate of 314 healthy German volunteers was used for several genotyping and phenotyping methods. A concordance between the homozygous GSTT1 gene deletion and the enzyme deficiency in 27 of 140 individuals (19,3%)was found. In 80,7% of the volunteers a discrimination between intermediate and rapid metabolizers was possible in a German population for the first time. In addition it was proved, if the ex-vivo metabolism of dichloromethane, catalyzed by GSTT1-1, is inhibited by phosphono-analoga of glutathione or tacrine, a drug for treatment of Alzheimers' disease. The NAT1 polymorphism is characterized by several point mutations and deletions or insertions of oligonucleotides. 24 NAT1 alleles are known so far. In this work, the functional consequences of various NAT1 allele combinations in the genotypes of 105 individuals were determinated. There were found interethnic differences in the frequency of the NAT1*11 allele and the frequency of the homozygous gene deletion between the German and other Caucasien populations.

Mittels NMR-Spektroskopie werden Störungen in Struktur und Dynamik von DNA untersucht, die durch den Einbau jeweils eines der beiden Fluorophore 2- Aminopurin (2AP) und 2-Hydroxy-7-nitrofluoren (HNF) hervorgerufen werden. Zu diesem Zweck werden die NMR-Strukturen der modifizierten Duplexe mit der Sequenz 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ berechnet. Im Fall X=2AP (13mer2AP) ist die Partnerbase im Komplementärstrang ein T, während gegenüber X=HNF (13mer- HNF) eine abasische Stelle eingeführt wird. Durch den Vergleich der Ergebnisse zum 13mer2AP mit denjenigen des entsprechenden unmodifizierten DNA Doppelstranges (13merRef, X=A) konnte jegliche Änderung eindeutig dem Einbau von 2AP zugordnet werden. Für die NMR-Strukturen von 13merRef und 13mer2AP können kleine aber signifikante, über die gesamte Helix verteilte Strukturstörungen nachgewiesen werden. Experimente zum Iminoprotonenaustausch mit Wasser ergeben, daß der Einbau von 2AP die Basenpaarlebensdauern der 7 zentralen Basenpaare erniedrigt. Die kürzere Lebensdauer des 2AP:T Basenpaares kann jedoch nicht den schnellen Wasseraustausch im Sättigungstransfer- Experiment ohne Zugabe von Basenkatalysator erklären. Als Erklärung für diese Diskrepanz wird eine effizientere intrinsische Katalyse vermutet. Als mögliche, katalytisch aktive Stelle wird das T O4 Atom diskutiert, welches über die große Furche leicht zugänglich ist und das keine Wasserstoffbrückenbindung innerhalb des Basenpaares ausbilden kann. Die übergeordnete Struktur des 13merHNF ist eine B-Form DNA Helix. Die NOE Kreuzpeaks zu den Protonen im HNF können jedoch nur durch zwei verschiedene Orientierungen des HNFs in der helikalen Anordnung beschrieben werden. Das Verhältnis der beiden Orientierungen untereinander wird als 1:1 abgeschätzt. Störungen in der Basenpaardynamik werden durch die höhere Linienbreite und die starke Hochfeldverschiebung des T auf der 5’-Seite ausgehend von der abasischen Stelle angedeutet. / Structural and dynamic perturbations in DNA upon incorporation of either fluorophore, 2-Aminopurine (2AP) or 2-Hydroxy-7-nitrofluorene (HNF), are characterized by NMR spectroscopy. For this purpose the NMR solution structures of the modified DNA duplexes with the sequence 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ are solved. For X=2AP (13mer2AP) the partner base in the complementary strand is T, while for X=HNF (13merHNF) an abasic site is introduced to avoid steric strain. By comparing results on 13mer2AP with the corresponding unmodified DNA duplex (13merRef, X=A), any perturbation can be unambiguously assigned to 2AP incorporation. For the NMR solution structure of 13merRef and 13mer2AP small but significant changes in helical parameters are found throughout the helix. Imino proton exchange measurements reveal an extended, distributed effect of 2AP incorporation on the lifetimes of the central seven base pair. However, the reduced base pair lifetime of 2AP:T cannot fully account for the rapid water exchange observed with saturation transfer experiments in the absence of base catalyst. This indicates enhanced intrinsic catalysis. As a possible catalytic site the T O4 atom opposite 2AP is discussed, which is easily accessible through the major groove and lacks a hydrogen bonding partner within the base pair. The overall NMR solution structure is found to be B-DNA. However the NOE cross-peaks involving the HNF residue can only be accounted for by two different orientations of the HNF inside the DNA helical stack. Their population ratio is estimated to be 1:1. Dynamical perturbation is indicated by the increased linewidth and strong upfield shift of the T residue to the 5’-side of the abasic site.

Das fundamentale Verständnis von Ladungsträgern in molekularen Halbleitern, die typischerweise als Polaronen bezeichnet werden, ist unverzichtbar, wenn es um das Design besonders leistungsfähiger (opto)elektronischer Bauelemente geht. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel ein umfangreiches Bild der Energetik von Polaronen in organischen Halbleitern zu erhalten. Zunächst geht es darum einen Probenaufbau zu finden, der es nicht nur ermöglicht Ladungsträger zu generieren, sondern auch ihre elektronische Struktur unter Verwendung von komplementären Photoemissionstechniken – Rötngen-, Ultraviolett- und inverse Photoelektronenspektroskopie - aufzuklären. Das Probenkonzept basiert darauf, dass molekulare Filme, die eine niedrigere Ionisierungsenergie als die Austrittsarbeit des zugrunde liegenden Substrates aufweisen, Fermi-level Pinning zeigen. In diesem Fall wären die höchsten besetzten Zustände der neutralen molekularen Schicht energetisch oberhalb des Substrat-Fermi-Levels angeordnet, wodurch zum Erhalt des elektronischen Gleichgewichts die Notwendigkeit für einen Ladungstransfer gegeben ist. Da die starke elektronische Kopplung zwischen Molekülen und Metallen die spektrale Information der Überschussladungsträger verändern könnte, wird die Metalloberfläche durch eine ultradünne Zwischenschicht passiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass es durch die vorliegende starke on-site Coulomb Repulsion zur Aufspaltung des höchsten besetzen molekularen Niveaus in ein besetztes und ein unbesetztes Sub-niveau kommt. Dies widerspricht der seit Jahren etablierten Vorstellung von einem einfach besetzten Niveau in der Bandlücke des neutralen molekularen Halbleiters. Unter zusätzlicher Berücksichtigung der inter-site Coulomb Repulsion zwischen Molekülionen und neutralen Molekülen, sowie der Energieniveau Verbiegung kann schließlich ein vollständiges Bild entwickelt werden, das die etablierte Vorstellung der Energieniveaus von Ladungsträgern in molekularen Halbleitern ersetzen soll. / Understanding the nature of charge carriers in molecular semiconductors, typically termed "polarons", is indispensable for rational material design targeting future superior (opto-)electronic device performance. The present work addresses this fundamental issue to derive a comprehensive picture of polarons in organic semiconductors. Conceptual work is dedicated to identifying a sample structure, which allows both, deliberately generating charged molecules and applying the complementary photoemission techniques X-ray, ultraviolet and inverse photoelectron spectroscopy in order to assess the polaron energetics. The sample concept is based on the fact that molecular layers exhibiting an ionization energy lower than the work function of the supporting substrate show Fermi-level pinning. There, as the substrate Fermi-level is moved into the occupied density of states of the molecular adsorbate, electron transfer occurs from the molecules to the substrate. Because strong electron coupling between molecules and eg. metal surfaces might mask or alter the spectral information of excess charge carriers, such interaction needs to be inhibited by implementation of an ultrathin passivating interlayer. The comprehensive results provide evidence that the highest occupied molecular orbital level is split into an upper unoccupied and a lower occupied sub-level due to strong on-site Coulomb interaction. This finding is in marked contrast to what has been assumed for decades, where a singly occupied level was proposed to lie within the gap of the neutral molecular semiconductor. Moreover, taking into account the inter-site Coulomb interaction between molecular cations and surrounding neutral molecules, as well as energy-level bending, finally, a complete picture of the energetics associated with polarons in molecular semiconductors could be derived, which aims at replacing common perceptions.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer allgemein anwendbaren Methode für die Simulation von ultraschnellen Prozessen und experimentellen Observablen. Hierfür wurden die Berechnung der elektronischen Struktur mit der zeitabhängigen Dichtefunktionaltheorie (TDDFT) und das Tully-Surface-Hopping-Verfahren für die nichtadiabatische Kerndynamik auf der Basis klassischer Trajektorien miteinander kombiniert. Insbesondere wurde eine Beschreibung der nichtadiabatischen Kopplungen für TDDFT entwickelt. Diese Methode wurde für die Simulation noch komplexerer Systeme durch die Tight-Binding-Näherung für TDDFT erweitert. Da die zeitaufgelöste Photoelektronenspektroskopie (TRPES) ein exzellentes experimentelles Verfahren für die Echtzeitbeobachtung von ultraschnellen Prozessen darstellt, wurde eine TDDFT-basierte Methode für die Simulation von TRPES entwickelt. Der Methode liegt die Idee zu Grunde, das System aus Kation und Photoelektron näherungsweise durch angeregte Zustände des neutralen Moleküls oberhalb der Ionisierungsgrenze zu beschreiben. Um diese Zustände mit TDDFT berechnen zu können wurde eine Beschreibung der Übergangsdipolmomente zwischen angeregten TDDFT-Zuständen entwickelt. Des Weiteren wurden Simulationen im Rahmen des Stieltjes-Imaging-Verfahrens, das eine Möglichkeit der Rekonstruktion des Photoelektronenspektrums aus den spektralen Momenten bietet, durchgeführt. Diese spektralen Momente wurden aus den diskreten TDDFT-Zuständen berechnet. Die breite Anwendbarkeit der entwickelten theoretischen Methoden für die Simulation von komplexen Systemen wurde an der Photoisomerisierung in Benzylidenanilin sowie der ultraschnellen Photodynamik in Furan, Pyrazin und mikrosolvatisiertem Adenin illustriert. Die dargestellten Beispiele demonstrieren, dass die nichtadiabatische Dynamik im Rahmen von TDDFT bzw. TDDFTB sehr gut für die Untersuchung und Interpretation der ultraschnellen photoinduzierten Prozesse in komplexen Molekülen geeignet ist. / The goal of this thesis was the development of a generally applicable theoretical framework for the simulation of ultrafast processes and experimental observables in complex molecular systems. For this purpose, a combination of the time-dependent density functional theory (TDDFT) for the description of the electronic structure with the Tully''s surface hopping procedure for the treatment of nonadiabatic nuclear dynamics based on classical trajectories was employed. In particular, a new approach for the calculation of nonadiabatic couplings within TDDFT was devised. The method was advanced for the description of more complex systems such as chromophores in a solvation shell by employing the tight binding approximation to TDDFT. Since the time-resolved photoelectron spectroscopy (TRPES) represents a powerful experimental technique for real-time observation of ultrafast processes, a TDDFT based approach for the simulation of TRPES was developed. The basic idea is the approximate representation of the combined system of cation and photoelectron by excited states of the neutral species above the ionization threshold. In order to calculate these states with TDDFT, a formulation of the transition dipole moments between excited states within TDDFT was devised. Moreover, simulations employing the Stieltjes imaging (SI) procedure were carried out providing the possibility to reconstruct photoelectron spectra from spectral moments. In this work, the spectral moments were calculated from discrete TDDFT states. The scope of the developed theoretical methods was illustrated on the photoisomerization in benzylideneaniline as well as on the ultrafast photodynamics in furan, pyrazine, and microsolvated adenine. The examples demonstrate that the nonadiabatic dynamics simulations based on TDDFT and TDDFTB are particularly suitable for the investigation and interpretation of ultrafast photoinduced processes in complex molecules.

Die von der caprotec bioanalytics GmbH entwickelte und vermarktete Capture Compounds Mass SpectrometryTM (CCMS-Technologie) ermöglicht die spezifische Isolierung und Identifizierung von Proteinen, basierend auf ihre gezielte Wechselwirkung mit kleinen trifunktionalen Moleküle (sog. Capture CompoundsTM). Dadurch wird sowohl eine Reduzierung der Komplexität zellulärer Proteingemische als auch eine Anreicherung niedrig abundanter Proteine erreicht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Synthese von neuartigen Capture Compounds, die dazu dienen sollen, unterschiedliche biochemische Fragestellungen zu beantworten und das Anwendungsspektrum der CCMS-Technologie stark erweitern. / The Capture Compound Mass SpectrometryTM (CCMS-Technology) is a novel technology developed and marketed by caprotec bioanalytics GmbH. CCMS allows the isolation of sub-proteomes based on specific interactions of target proteins with synthetic small molecules, called Capture Compounds (CCs). In this way, CCMS affords the functional reduction of complex protein mixtures that derived from e.g. cell lysates, and the enrichment and identification of low abundant proteins. In the present work, the synthesis of different novel Capture Compounds that helps studying different biological problems and overcoming present technological limitations of CCMS is described.

Um die Korrelation zwischen Partikelgröße und Reaktivität von Pd Nanopartikeln auf Eisenoxid zu untersuchen wurde die experimentelle Methode Einkristalladsorptionskalorimetrie mit der Präparation von Modellsystemen kombiniert. Da diese Systeme mit mikroskopischen Methoden untersucht wurden, liegen detaillierte strukturelle Informationen vor. Es konnte gezeigt werden, dass die Adsorptionsenergie auf 3.4 nm großen Pd Nanopartikeln um 69 kJ/mol höher ist als auf Pd(111). Dieser Effekt resultiert aus der Änderung des Adsorptionsplatzes von Facettenplätzen auf Pd(111) zu Kantenplätzen auf Pd Nanopartikeln. Die Änderung der Partikelgröße im Bereich 3.4 nm - 1.9 nm führt zu einer Verringerung der Adsorptionsenergie um 70 kJ/mol. Eine Reduktion der Adsorptionsenergie auf kleineren Nanopartikeln wurde auch für CO gemessen. Die Differenz in der Pd-O Bindungsenergie zwischen den verschiedenen Systemen verringert sich bei erhöhter Adsorbatbedeckung. Die Anzahl adsorbierter Sauerstoffatome auf frisch präparierten Pd Nanopartikeln bei 300 K ist um drei bis vier mal höher als die Anzahl an Sauerstoffatomen welche Pd Oberflächenplätze sättigen können. Diese Beobachtung kann mit Sauerstoffdiffusion in die Nanopartikel oder in den Träger erklärt werden. Die Wechselwirkung zwischen Sauerstoff und CO auf Pd(111) und Pd Nanopartikeln verschiedener Größen wurde als Funktion der Bedeckung studiert. Aufgrund der CO-O Wechselwirkung verringert sich die CO Adsorptionsenergie um ~40 kJ/mol auf sauerstoffvorbedeckten Pd(111) und Pd Nanopartikeln der Größen 2.9 nm und 3.4 nm. / To determine the correlation between the particle size and the reactivity of Pd nanoparticles, which are supported on iron oxide, the experimental method single crystal adsorption calorimetry has been combined with the preparation of model systems. Detailed structural information on the supported systems is available from previous structural studies. It was found that the oxygen adsorption energy is 69 kJ/mol higher on 3.4 nm sized Pd nanoparticles compared to Pd(111) due to a change of the local adsorption site from threefold hollow to low coordinated sites. A reduction of the particle size in the range 3.4 nm - 1.9 nm was found to lead to a decrease of the adsorption energy by 70 kJ/mol. A reduction of the adsorbate binding energy has also been found for CO. The difference in the Pd-O binding energy between the different systems decreases with increasing coverage. It was demonstrated that the number of adsorbed oxygen atoms on freshly prepared Pd nanoparticles at 300 K is three to four times higher than the amount of oxygen atoms which saturate the Pd surface sites. This observation can be explained with oxygen diffusion either into the nanoparticles or into the support. The interaction between oxygen and CO has been studied on Pd(111) and Pd nanoparticles of different sizes as a function of the coverage. Due to CO-O interaction, the CO adsorption energy is reduced by ~40 kJ/mol on oxygen precovered Pd(111) and Pd nanoparticles of 2.9 nm and 3.4 nm.

Die im Jahre 1963 von Robert Bruce Merrifield vorgestellte festphasengebundene Peptidsynthese beeinflusste in hohem Maße verschiedene Bereiche der Naturwissenschaften. Doch trotz zahlreicher neuer Entwicklungen hat sich in der das Prinzip der eingesetzten Trägermaterialien nicht grundlegend geändert. Geringfügig quervernetzte Polystyrol-Harze sind immer noch die meist verwendeten Trägermaterialien in der standardisierten Peptidsynthese. In dieser Arbeit wurden superparamagnetische Kern-Schale-Nanopartikel entwickelt und erstmals deren Einsatz als neues Trägermaterial für die Synthese von Peptiden, Peptid-Polymer-Konjugaten und Oligonucleotiden demonstriert. Unter Verwendung einer mikrowellenunterstützten Syntheseroute gelang es zunächst superparamagnetische Magnetitpartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich 6 nm darzustellen. Anschließend wurde ein neu entwickelter mikrowellenunterstützter Stöber-Prozess zur Herstellung von Magnetit-Silica-Kern-Schale-Nanopartikel angewendet, welche im dritten Schritt mit Aminopropyltrimethoxysilan funktionalisiert wurden. Es wurden hochpräzise, monodisperse Kern-Schale-Nanopartikel mit einem Durchmesser von durchschnittlich 69 nm und einem Beladungswert von 0.11 mmol/g erhalten, welche in durchgeführten Stabilitätstests hervorragende Ergebnisse zeigten und als neue Trägermaterialien für festphasengebundenen Synthesen getestet wurden. Die erforderliche Produktaufreinigung erfolgte durch ein externes Magnetfeld, durch welches die Partikel reversibel sedimentierbar sind. Erste Studien der Synthese einer 4-mer-Peptidsequenz zeigten Ausbeuten von über 70% und mit herausragender Reinheit von über 95%. Besonders eindrucksvolle Ergebnisse erzielten die Partikel bei der Synthese von Peptid-Polymer-Konjugaten, bei denen die Ligationsreaktionen mit vorher nicht dokumentierten Umsatzraten verliefen. Außerdem konnte die Anwendbarkeit bei der Synthese eines Trinucleotids nachgewiesen werden. / In 1963 Merrifield introduced the method of solid-phase supported synthesis and thus revolutionized peptide synthesis. In spite of several new developments, the main principle of established solid supports has not changed much. Still lightly cross linked poly(styrene) resins dominate the used supports. This work reports on surface amino functionalized, superparamagnetic nanoparticles with a protective silica shell to be applicable as colloidal supports for organic synthesis of peptides, peptide polymer conjugates and oligonucleotides. A microwave supported synthesis route lead to superparamagnetic magnetite particles with an average particle diameter of 6 nm. Subsequently a new developed microwave assisted Stöber process was used to build up magnetite-silica-core-shell-nanoparticles, which were functionalized in a third step with aminopropyltrimethoxysilane. Defined monodisperse core-shell nanoparticles were obtained with an average diameter of 69 nm and a concentration of free amino groups of 0.11 mmol/g, which showed excellent results in conducted stability tests and were used as new support materials for solid-supported syntheses. Convenient magnetic sedimentation proved to ensure ease of purification after each reaction step. Initial studies of a synthesis of a tetramer peptide sequence showed yields of more than 70% and an outstanding purity of more than 95%. The particles also showed impressive results in the synthesis of peptide-polymer conjugates, in which the ligation reactions proceeded conversion rates, which had not been published before. In addition, the applicability of the particles was demonstrated in the synthesis of a trinucleotide.

Die Einbrennsilikonisierung wird schon lange verwendet, um spezielle Eigenschaften bei pharmazeutischen Glasbehältnissen zu erzielen. Üblicherweise werden Silikonöle verwendet um Gleitfilme auf den Oberflächen vorgefüllter Glasspritzen zu erzeugen oder die Glaswand zu hydrophobieren damit wäßrige Inhalte sauber ablaufen können. Weiterhin kann durch die hydrophobe Deaktivierung der Glaswände eine Reduktion der Adsorption von Wirk- und Hilfsstoffen sowie eine Erhöhung der hydrolytischen Resistenz erreicht werden. Wegen des parenteralen Verwendungszweckes werden meistens Gläser der Glasart 1 entsprechend dem europäischen Arzneibuch eingesetzt. Die Silikonölfilme (Trimethylsiloxy-endgeblockte Polydimethylsiloxane, PDMS) werden aus verdünnter wäßriger Emulsion auf der inneren Behältnisoberfläche gespreitet und anschließend bei Temperaturen oberhalb von 300°C für ca. 10-30 min hitzebehandelt. Neben der Sterilisation und Entpyrogenisierung wird der Silikonfilm durch das Einbrennen verändert. In der Literatur wurde dieser Prozeß bisher als Hitzefixierung oder -härtung bezeichnet in der Annahme, daß das Silikonöl durch Glasbindung oder Quervernetzung immobilisiert wird. Es wurden weitere Effekte wie Verdampfung oder Zersetzungsreaktionen als Folge der Hitzebehandlung angenommen. Die Dissertation hatte daher zum Ziel diese Vorstellungen analytisch zu belegen. Die Eigenschaften einbrennsilikonisierter Gläser lassen sich durch einfache Experimente beschreiben. Durch organische Extraktion der Gläser (z.B. Toluol, Dichlormethan) läßt sich der überwiegende Silikonanteil (ca. 80%) wiederfinden. Nach erschöpfender Extraktion zeigt sich eine beständige Hydrophobie z.B. durch die Ausbildung hoher Randwinkel von Wasser oder das veränderte Ablaufverhalten von Flüssigkeiten in diesen Behältnissen festgestellt werden. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde die Anwesenheit einer gebundenen neben einer löslichen Silikonölfraktion nach dem Einbrennen angenommen. Alle analytischen Studien wurden an dieser zwei Lagen Theorie orientiert und durchgeführt. Dazu wurden einige oberflächensensitive Techniken wie z.B. die kombinierte Röntgenphotoelektronen- und Augerelektronenspektroskopie (XPS/AES) und die Flugzeit-Sekundärionenmassenspektroskopie (TOF-SIMS) eingesetzt. Durch chemische Zustandsdiagramme und massenspektroskopische Strukturanalyse konnte die Ausbildung von Bindungen zwischen Glas und Silikon detektiert werden. Kontaktwinkelmessungen zeigten, daß das gebundene Silikon bis ca. 400°C thermostabil ist und oberhalb von 450°C pyrolysiert wird. Die extrahierbare Silikonfraktion wurde ebenfalls mit einigen analytischen Techniken im Vergleich mit den jeweiligen unbehandelten Ausgangsmaterialien untersucht. Chromatographische Studien mittels Größenausschluß- und Hochtemperatur-Gaschromatographie (SEC,GC) zeigten signifikante Unterschiede in der polymeren Zusammensetzung des PDMS. Die Molekulargewichtsmittel stiegen als Folge von Verlusten von niedermolekularen Siloxanen einer Größe zwischen 0-100 Siloxaneinheiten (SU) an. Diese Defizite können auf Verdampfungs- (0-50 SU) und Zersetzungsreaktionen (50-100 SU) zurückgeführt werden. Die Untersuchung des extrahierbaren eingebrannten Silikonöls mit der Fourier Transform Infrarot Spektroskopie (FTIR) zeigte keine strukturelle Veränderung der PDMS Moleküle, z.B. durch Hydrolyse, Oxidation oder Verzweigung an. Die Emulgatoren werden durch das Einbrennen zerstört. Dies wurde durch die 1H-Kernresonanz Spektroskopie (1H-NMR) nachgewiesen. Die Thermostabilität des PDMS wird durch katalytische Effekte der Emulsionshilfsstoffe und durch die Anwesenheit von Sauerstoff erniedrigt, wie aus thermogravimetrische Analysen (TGA) mit kommerziellen Silikonölen und Ölemulsionen modellhaft abgeleitet wurde. Um die Migration von Silikonölspuren in Arzneimittel in silikonisierten Glasbehältnissen zu bewerten wurde eine Atom Absorptions spektroskopische (AAS) Methode entwickelt und entsprechend den ICH-Richtlinien validiert (Bestimmungsgrenze in Liquida 10 mg/L). Die Schlußfolgerung aus den Analysen ist, daß nach der Einbrennsilikonisierung zwei differenzierbare Silikonfraktionen an der Glasoberfläche anwesend sind. Die kovalent gebundene Dünnschicht ist unlöslich und verliert ihren Ölcharakter, ist aber für die Hydrophobisierung ausreichend. In der löslichen Fraktion, werden die mittleren Molekulargewichte durch den Verlust von niedermolekularen Anteilen erhöht. Der Anteil dieser Schicht hängt von der eingesetzten Ausgangsmenge an Silikonöl ab. Durch die Entfernung der niedermolekularen Anteile und die Zerstörung der Emulgatoren können toxikologische Bedenken zurückgestellt werden. / Heat Curing Siliconization of Pharmaceutical Glass Containers The heat curing siliconization has long since been used to introduce special properties to pharmaceutical glass containers. Silicone oils are usually applied to the containers to form lubricating films on the inner surface of prefilled syringes or to gain hydrophobic container walls for clear draining aqueous solutions, e.g. in injection vials. Furthermore the deactivation of the glass wall reduces adsorption of hydrophilic drug compounds and increases the hydrolytic stability of the glass surface. Due to the parenteral targeting the glass containers are made from glass type 1 according to the European Pharmacopoeia. The silicone oil films (= trimethylsiloxy endcapped polydimethylsiloxane, PDMS) are spread from diluted aqueous silicone oil emulsions on the inner surface and successively heat treated above 300°C for 10-30 minutes. Apart from sterilization and depyrogenation, the silicone layer is changed by the burning-in treatment. In literature the process has previously been designated as heat fixing or heat curing assuming that silicone oil is immobilized by bonding to the glass or branching. Further effects such as vaporization or degradation were suggested along with the heating. Proving these suggestions analytically was therefore the aim of the dissertation. The properties of siliconized glass containers can be characterized by simple experiments. Extraction of the glasses with suitable organic solvents (e.g. toluene, dichloromethane) recovers most of the silicone (approximately 80%) after a typical heat curing process. Still, after exhaustive solvent extraction there are persisting hydrophobic properties of the glasses evidenced by high contact angles of water and changed draining behaviour of fluids in the containers. From this observations it was assumed that a bound and a soluble silicone species is present after the heat curing siliconization. All analytical studies were based on the two-layer hypothesis and thus divided in two parts. Several surface analysis techniques were employed to detect and characterize the fixed silicone layer among them the combined X-ray photoelectron and augerelectron spectroscopy (XPS/AES) and time-of-flight secondary ion mass spectroscopy (TOF-SIMS). The formation of new bonds between silicone and glass was evidenced by chemical state plots and mass spectroscopic structural analysis. Contact angle measurements showed that the bound silicone was thermostable up to 400°C and pyrolyzed at temperatures above 450°C. The extractable silicone was also studied with several analytical techniques in comparison with the respective uncured starting materials. Chromatographic studies using size exclusion (SEC) and high temperature gas chromatography (GC) revealed significant changes in the composition of the silicone polymer. The molecular weight averages increase because low molecular weight siloxanes (LMWS) with 0-100 dimethylsiloxane units are removed through the heat curing process. These deficits can be related to vaporization (molecules from 0-50 units) and degradation (molecules from 0-100 units) effects. A Fourier transform infrared spectroscopic (FTIR) investigation of the molecular structure of the extractable PDMS after heat treatment showed no chemical changes e.g. by hydrolysis, branching or oxidation. The emulsifiers are destroyed in the heating process which was proved by a proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) study. The thermostability of the silicones is decreased by katalytic effects of auxiliary substances in the emulsions and the presence of oxygen. This was concluded from model thermogravimetric studies (TGA) with commercial medical grade silicone oils and emulsions. To evaluate migration of silicone traces to drug formulations in siliconized glass containers a trace analytical method by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS) was developed and validated according to the ICH guidelines. In liquid formulations levels of 10µg/L can be properly quantified. It was concluded that two main species of silicone can be differentiated on the glass surface after heat curing siliconization. The bonded thin layer is insoluble and sufficient for hydrophobic deactivation. The oil properties are lost. The extractable fraction is altered by removal of LMWS which increases molecular weight and viscosity and determines the lubricating properties. Its amount depends on the used silicone mass. No toxicological concern has to be made about LMWS and emulsifiers in the drug product due to their removal in the curing step.