Das Herz ist das zentrale Kreislauforgan in unserem Körper und jede Abweichung seiner Funktion wirkt sich negativ auf die Homöostase des gesamten Körpers aus. Die Herzfunktion beruht auf der Synergie der Zellen, die das Organ bilden. Die detaillierte zelluläre Zusammensetzung sowie die Funktionalität der einzelnen Zellen müssen noch ermittelt werden, und diese Arbeit ist eine wichtige Ergänzung dieser Bemühungen. Dank der jüngsten Entwicklungen in den Einzelzelltechnologien sind wir nun in der Lage, Transkriptome einzelner Zellen aus komplexem Gewebe in beispiellosem Umfang zu charakterisieren. Im ersten Schritt eines solchen Experiments müssen die Zellen und Zellkerne aus dem Gewebe befreit und vereinzelt werden. Herzgewebe wirft in dieser Hinsicht einzigartige Herausforderungen auf, darunter die Knappheit des gesunden menschlichen Herzgewebes für die Forschung, das Vorhandensein von Kardiomyozyten, die aufgrund ihrer Größe nicht durch Microfluid-basierte Standardinstrumente passen und deren Multinukleation, sowie mögliche Voreingenommenheit verschiedener Methoden zur Gewebedissoziation. Hier präsentiere ich den umfassenden Zellatlas des gesunden erwachsenen menschlichen Herzens. Ich beginne mit der Methodenentwicklung zur Isolierung von einzelnen Zellen und Zellkernen aus Mausherzen. Um den Zellatlas des menschlichen Herzens zu erstellen, analysiere ich einen Datensatz von fast einer halben Million Einzelzellen und Zellkerne aus sechs Herzregionen von vierzehn gesunden Menschen. In diesem Atlas definieren wir 11 Hauptzelltypen und 62 Zellzustände des menschlichen Herzens. Ein tieferer Fokus wird auf das Herzgefäßsystem gelegt und die Zellen der arterio-venösen Achse sowie deren Wechselwirkungen und potenzielle Funktionalität werden definiert. Insgesamt präsentiert diese Dissertation einen komplex Datensatz aus menschlichem Herzgewebe und liefert neue Einblicke in die Biologie des gesunden Herzens mit Implikationen für kardiovaskuläre Erkrankungen. / The heart is the central circulatory organ in our bodies and any discrepancies of its function relative to healthy homeostasis negatively impact the whole body. Cardiac function relies on the synergy of all the cells that constitute the organ. The detailed cellular composition as well as the heterogeneity and functionality of the individual cells is yet to be established and this work is a major advance in this effort. Thanks to the recent developments in single cell genomics technologies, we are now able to profile transcriptomes from individual cells of complex tissues at unprecedented scale. In the first step of such an experiment, the single cells and nuclei need to be liberated from the tissue. Heart tissue presents a unique set of challenges in this regard, including the scarcity of healthy human cardiac tissue for research, large cardiomyocytes that do not fit into the standard droplet-based instruments, multinucleation of cardiomyocytes that might skew the proportions of the recovered nuclei as well as potential bias of tissue dissociation methods. Here I present a cell atlas of the free walls, apex and septum of the healthy adult human heart. I start with methods development for the isolation of single cells and single nuclei from mouse heart. Next, I move to the building of the atlas of the human cells and nuclei, where I describe the dataset of close to half a million single cells and nuclei sampled from 14 organ donors, defining 11 major cell types and 62 cell states of the heart. A deeper focus on the cardiac vasculature defined the cells of the arterio-venous axis as well as their interactions and potential functionality. Overall, this thesis presents a joined dataset of single cells and single nuclei from human cardiac tissues and provides new insights into cardiac biology in heath with implications for cardiovascular disease.

Circular RNAs (circRNAs) sind eine große Klasse endogener RNAs, die in Organismen vorkommen, die RNA-Transkripte durch Spleißen prozessieren. Sie sind Produkte des „backsplicing“ – einer Art des alternativen Spleißens, bei der das 3‘-Ende eines Exons mit einer vorgelagerten 5‘-„splice site“ verbunden wird. Trotz ihrer Abundanz und spezifischen Expressionsmustern sind in vivo-Funktionen von circRNAs größtenteils unbekannt. Wir haben den existierenden Kenntnisstand systematisiert und diesen in Form von circBase frei zugänglich gemacht. circBase ist eine Online-Datenbank, in der circRNA-Datensätze abgerufen und im genomischen Kontext durchsucht und visualisiert werden können. Für die Arbeit mit Hochdurchsatz-circRNA-Daten haben wir des Weiteren die Software ciRcus entwickelt. Um mehr bezüglich circRNA-Expression und möglicher Funktionen zu lernen, haben wir die Expressionsmuster im Säugetiergehirn umfassend erforscht. Mithilfe von eigenen und öffentlich zugänglichen RNA-Sequenzierungsdaten haben wir Tausende von neuralen circRNAs in Mensch und Maus entdeckt. circRNAs waren während der neuronalen Differenzierung und Reifung insgesamt hochreguliert, stark angereichert in Synapsen, und oft differentiell exprimiert im Vergleich zu ihren mRNA-Isoformen. Außerdem haben wir gezeigt, dass viele circRNAs zwischen Mensch und Maus konserviert sind. Schließlich haben wir in vivo-Funktionen von Cdr1as erforscht - einer konservierten und im Gehirn hoch exprimierten circRNA, die stark von microRNA (miRNA)-Effektor-Komplexen gebunden ist und zahlreiche miR-7-Bindestellen sowie eine Bindestelle für miR-671 aufweist. „Knockout“-Tiere, bei denen der Cdr1as-Lokus deletiert wurde, zeigten ein gestörtes sensomotorisches „gating“ und dysfunktionale synaptische Übertragung. Die Expression von miR-7 und miR-671 war in verschiedenen Hirnregionen der Tiere dereguliert. Die Expression von „immediate early“-Genen, von denen einige miR-7-Zielgene sind, war erhöht. / circular RNAs (circRNAs) are a large class of endogenous RNAs present in organisms that process RNA transcripts by splicing. They are products of backsplicing - alternative splicing reactions where the 3’ end of an exon is spliced to an upstream 5’ splice site. Despite their abundance and tissue- and developmental-stage-specific expression patterns, their in vivo functions are largely unknown. We systematized the existing knowledge on circRNAs and made it freely available by developing circBase - an online database where circRNA datasets can be accessed, downloaded and browsed within the genomic context. Another technical challenge was addressed by developing ciRcus - a software package for working with high-throughput circRNA data, which allowed us to routinely handle, explore, annotate, quantify and integrate circRNA data with the external sources of biological data. To learn more about circRNA expression and potential functions, we have explored the expression patterns of circRNAs in the mammalian brain. Using own and public RNA-seq data, we discovered thousands of neural circRNAs in human and mouse. circRNAs were upregulated during neuronal differentiation and maturation, enriched in synapses, and often differentially expressed compared to their host mRNAs. Many circRNAs were conserved between human and mouse. Finally, we explored in vivo functions of Cdr1as - a conserved circRNA known to be highly expressed in the brain, heavily bound by microRNA (miRNA) effector complexes, and harbouring many binding sites for miR-7, as well as a single binding site for miR-671. Upon deleting the Cdr1as locus, knockout animals displayed impaired sensorimotor gating and dysfunctional synaptic transmission. Expression of miR-7 and miR-671 was deregulated in different brain regions of Cdr1as knockout animals. Expression of immediate early genes, some of which are miR-7 targets, was increased, providing a possible molecular link to the behavioral phenotype.

Sleeping Beauty (SB) Transposon-basierte Vektoren werden als Alternative zu viralen Vektoren für T-Zell-Gentherapie erforscht und ermöglichen eine schnelle und kostengünstige Genmanipulation von T-Zellen. Die Verwendung von Transposon-Vektoren erfordert jedoch die DNA-Elektroporation von T-Zellen, die sich schädlich auf T-Zellen auswirkt. DNA-elektroporierte T-Zellen weisen eine verringerte Lebensfähigkeit und eine verzögerte Aktivierung nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors (TCR) auf. Um die Nachteile der Transposon-basierten T-Zell-Genmanipulation zu überwinden, haben wir neuartige SB-Vektoren entwickelt. Durch die Kombination von SB Transposon-basierten Minicircle-Vektoren mit SB100X Transposase-mRNA konnten T-Zellen effizient genmodifiziert werden. Unser Ansatz reduzierte die T-Zell-Mortalität und steigerte gleichzeitig die Transfektionseffizienz. Mit diesen neuartigen Vektoren wurde die stabile Expression verschiedener TCRs und CARs in über 50% der eingesetzten T-Zellen erreicht. Gentechnisch manipulierte T-Zellen konnten Antigen-spezifisch stimuliert werden und zeigten effiziente Zytokin-Sekretion und Tumorzell-Lyse. Weiterhin haben wir miRNAs entwickelt, die die Expression der endogenen TCR-Ketten unterdrücken. Der Einbau dieser miRNAs in die TCR-Expressionskassette erhöhte die Oberflächenexpression des therapeutischen TCRs, verringerte die Fehlpaarung mit endogenen TCR-Ketten und erhöhte die T-Zell-Funktionalität. Ein direkter Vergleich von SB- und Virus-modifizierten T-Zellen zeigte sowohl in vitro als auch in vivo eine vergleichbare Wirksamkeit der modifizierten T-Zellen hinsichtlich Zytokin-Sekretion, Tumorzell-Lyse und Tumorkontrolle. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass SB Minicircle-Vektoren die Herstellung von genetisch modifizierten T-Zellen ermöglichen und diese Tumor-spezifische Wirksamkeit aufweisen. Dieser Ansatz könnte die Herstellung therapeutischer T-Zellen für die personalisierte T-Zell-Gentherapie vereinfachen und beschleunigen. / Sleeping Beauty (SB) transposon-based vectors have entered clinical trials as an alternative to viral vectors for T cell gene therapy, offering time- and cost-efficient engineering of therapeutic T cells. However, transposon vectors require DNA electroporation into T cells, which we found to cause adverse effects. T cell viability was decreased, and DNA-transfected T cells showed delayed activation upon T cell receptor (TCR) stimulation regarding blast formation and proliferation. To overcome the limitations of transposon-based T cell engineering, we investigated the effect of DNA electroporation on T cells and developed novel SB vectors. T cells could efficiently be engineered with Sleeping Beauty vectors by combining SB transposon minicircles and SB100X transposase mRNA. Our approach reduced T cell mortality and substantially enhanced transfection efficiency. We achieved stable expression of several TCRs and CARs in more than 50% of the transfected T cells compared to 15% when conventional plasmids were used. T cells engineered to express a tumor-specific TCR mediated effective tumor cell lysis and cytokine secretion upon antigen-specific stimulation. Furthermore, we developed miRNAs to silence the expression of the endogenous TCR chains. Incorporation of these miRNAs into the TCR expression cassette increased surface expression of the therapeutic TCR, diminished mispairing with endogenous TCR chains, and enhanced T cell functionality. Importantly, a direct comparison of SB minicircle- and RV-engineered T cells in vitro as well as in vivo demonstrated equal T cell efficacy with regards to cytokine release, tumor cell lysis and tumor control. We demonstrated that SB minicircles enable the generation of gene-modified T cells with tumor-specific reactivity. Our approach facilitates the manufacturing of therapeutic T cells with superior biosafety and accelerates the generation of patient-specific T cell products for personalized T cell gene therapy.

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer protozoischer Parasit, der Toxoplasmose beim Menschen und bei Warmblütern verursacht. Die Signalübertragung durch zyklische Nukleotide ist entscheidend für das erfolgreiche intrazelluläre Überleben und die Vermehrung der Parasiten. Hier haben wir die physiologische und biochemische Bedeutung der wesentlichen Phosphodiesterasen (PDEs) in Toxoplasma gondii Tachyzoiten untersucht. Durch C-terminale Markierung von 18 PDEs konnten wir die Expression von 11 PDEs nachweisen. Die Immunogold-Färbung zeigte, dass TgPDE1, TgPDE2 und TgPDE9 im gesamten Parasitenkörper verteilt sind, einschließlich des inneren Membrankomplexes, des apikalen Pols, der Plasmamembran, des Zytosols, der dichten Granula und der Rhoptry, was auf eine räumliche Kontrolle der Signalübertragung innerhalb der Tachyzoiten hindeutet. Anschließend stellten wir fest, dass die meisten Enzyme berüchtigte dual-spezifische Phosphodiesterasen sind, wobei TgPDE2 anders als T.gondii cAMP-spezifisch ist, während T.gondii keine cGMP-spezifische Phosphodiesterase besitzt. Unsere enzymkinetischen Daten zeigen, dass TgPDE2 die höchste Affinität zu seinem Substrat aufweist, während die dualen PDEs (TgPDE1, TgPDE7 und TgPDE9) eine höhere Affinität zu cGMP als zu cAMP haben. Ein Screening der Hemmung gängiger PDE-Inhibitoren auf TgPDEs ergab, dass TgPDE1 das Ziel von BIPPO und Zaprinast ist. Darüber hinaus ergab die biologische Bedeutung, dass TgPDE1 und TgPDE2 einzeln für das Wachstum des Parasiten notwendig sind und ihr Verlust zum Tod des Parasiten führt, was auf ihre funktionelle Redundanz hindeutet. Darüber hinaus identifizierten wir Kinasen und Phosphatasen innerhalb der TgPDE1- und TgPDE2-Interaktome, die die enzymatische Aktivität über Protein-Protein-Interaktionen oder posttranslationale Modifikationen steuern könnten. Insgesamt unterstreichen unsere Erkenntnisse über die subzelluläre Lokalisierung, die katalytische Funktion, die medikamentöse Hemmung und die physiologische Bedeutung der wichtigsten Phosphodiesterasen die unvorhersehbare Plastizität und das therapeutische Potenzial der zyklischen Nukleotid-Signalübertragung in T. gondii. Der Datensatz der cAMP-bindenden Interaktoren, den wir in einem anderen Aspekt dieser Studie offengelegt haben, wird wertvolle Einblicke in die allgegenwärtige Natur der cAMP-vermittelten Signalübertragung in T. gondii Tachyzoiten liefern. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite that causes toxoplasmosis in human and warm-blood organisms. Cyclic nucleotide signaling is crucial for the successful intracellular survival and replication of the parasites. Here, we dissected the physiological and biochemical importance of the essential phosphodiesterases (PDEs) in Toxoplasma gondii tachyzoite. By C-terminal tagging of 18 PDEs, we detected the expression of 11 PDEs. Immunogold staining revealed that TgPDE1, TgPDE2 and TgPDE9 are distributed throughout the parasite body, including the inner membrane complex, the apical pole, the plasma membrane, the cytosol, dense granules, and rhoptry, suggesting the spatial control of signaling within tachyzoites. Subsequently, we identified that most enzymes are notorious dual-specific phosphodiesterases, and TgPDE2 is cAMP specific differently, whilst T.gondii lacks of cGMP specific phosphodiesterase. Our enzyme kinetic data demonstrated that the highest affinity to its substrate belongs to TgPDE2, while the dual PDEs (TgPDE1, TgPDE7 and TgPDE9) have higher affinity with cGMP than cAMP. Inhibition screening of commonly-used PDE inhibitors on TgPDEs, signifying TgPDE1 as the target of BIPPO and zaprinast. Furthermore, the biological significance revealed TgPDE1 and TgPDE2 are individually necessary for parasite growth, and their loss associatively results in parasite death, implying their functional redundancy. In addition, we identified kinases and phosphatases within the TgPDE1 and TgPDE2 interactomes, which may operate the enzymatic activity via protein-protein interactions or posttranslational modifications. Collectively, our findings on subcellular localization, catalytic function, drug inhibition, and physiological relevance of major phosphodiesterases highlight the unforeseeable plasticity and therapeutic potential of cyclic nucleotide signaling in T. gondii. The data set of cAMP-binding interactors, which we disclosed in another aspect of this study, will provide valuable insight into the pervasive nature of cAMP-mediated signaling in T. gondii tachyzoites.

Das Protozoon Giardia duodenalis ist eine der Hauptursachen für infektiöse Magen-Darm-Erkrankungen. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind jedoch nach wie vor unklar. Um die Pathogenität G. duodenalis‘ untersuchen zu können, wird ein Modellsystem benötigt, dass die Komplexität des Darmepithels widerspiegelt. Diese Arbeit zeigt die Etablierung eines Zellkultursystems auf der Basis von organoid-abgeleiteten Epithelien unter Verwendung von filter-basierten Zellkultureinsätzen. Wir haben Protokolle für die Etablierung von organoid-basierten Zellkulturen (ODMs) vier verschiedener Wirte zoonotischer Protozoen unter Verwendung eines einzigen Protokolls erstellt. Die Charakterisierung zeigte, dass das Modellsystem erfolgreich die Polarisierung des Darmepithels nachahmt, aus mehreren Zelltypen besteht und eine Infektion ermöglicht. Der Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse der durch G. duodenalis induzierten Barrierestörung in ODMs auf Transkriptions-, Protein- und Funktionsebene. Die Infektion von humanen duodenalen Zellen führte zu einem Verlust der epithelialen Barrierefunktion. Mit Hilfe des transepithelialen elektrischen Widerstandes und Dextran Flux wurde eine Erhöhung der Barrieredurchlässigkeit beobachtet. Die Hemmung von zuvor in immortalisierten Zellmodellen beschriebenen Reaktionswegen konnte die Barrierefunktion nicht wiederherstellen. Stattdessen konnten Veränderungen der Ionenhomöostase sowie den Zusammenbruch der zonula occludens nachgewiesen werden. Der beobachtete Phänotyp konnte auf die Aktivierung des cAMP/PKA/CREB-Signalwegs, als einen von mehreren kausalen Faktoren, zurückgeführt werden. Hier zeigen wir die Etablierung eines aus Organoiden abgeleiteten Modells, das die Untersuchung von G. duodenalis Infektionen in vitro ermöglicht. Mit unserem Modell konnten wir eine neue Reihenfolge von Ereignissen entschlüsseln, die einen der Faktoren während symptomatischer Giardiasis darstellt. / The protozoan Giardia duodenalis is a one of the major causes of gastrointestinal illness. Underlying pathomechanisms remain unclear. An in vitro model system that also mimics the complexity of intestinal epithelium is needed to allow pathogenicity studies. This thesis shows the establishment of a cell culture system based on organoid-derived epithelia using permeable cell culture inserts. We have provided guidelines on the establishment of organoid-derived monolayers (ODMs) of four different hosts of zoonotic protozoa using a single protocol. Characterization showed that the model system successfully mimics intestinal polarization, is composed of multiple cell types and allows for infection with multiple protozoan parasites. As the main focus of the thesis, analysis of G. duodenalis-induced barrier breakdown in ODMs was performed on transcriptional, protein and functional level. Infection of human duodenal, organoid-derived monolayers resulted in a time- and dose-dependent breakdown of epithelial barrier function. Barrier permeability increases were observed ranging from ions to macromolecules as measured by transepithelial electrical resistance and Dextran flux. Inhibition of previously proposed key pathogen-induced pathways observed in immortalized cell models did not rescue barrier dysfunction. We could instead show changes in ion homeostasis, and tight junctional breakdown. While none of the previously proposed effector pathways appeared to be responsible, we could pin-point the observed phenotype to activation of the cAMP/PKA/CREB signaling pathway, as one of the factors of the multifactorial barrier breakdown. The establishment of an organoid-derived infection model is shown, allowing the study of in vitro Giardia duodenalis infections. Using this model, we could decipher a new series of events that may be one of the factors causing the intestinal barrier breakdown observed in symptomatic Giardiasis.

Die Grundlage der Entwicklung multizellulärer Lebewesen bildet die Herausbildung stabiler Zelllinien aus einer einzelnen Zygote. Die Expression spezifischer Kombinationen von Transkriptionsfaktoren ist von zentraler Bedeutung für diesen Prozess. Des Weiteren sind epigenetische Veränderungen des Genoms von Bedeutung, über deren Verhältnis zu Änderungen der Zell-Identitäten weniger bekannt ist. In dieser Arbeit nutze ich Daten aus scATAC-seq und scRNA-seq (mit metabolischer Markierung; scSLAM-seq) um die regulierenden Elemente im Seeigel zu charakterisieren – vom 4-Zell-Stadium, über die Aktivierung des zygotischen Genoms, bis hin zu den Strukturen der frühen Pluteus-Larve. Die Schicksale der einzelnen Zellen des Seeigels sind gut erforscht und ab der vierten Zellteilung etabliert (auch wenn einzelne Veränderungen bis zum 128-Zell Stadium induziert werden können), wonach die Keimblätter fest verankert sind. Plastizität innerhalb der Keimblätter ist mindestens bis zum Ende der Gastrulation möglich. Mithilfe dieser Daten, sowie den bekannten Ergebnissen der Erforschung der Zellschicksale vergangener Jahrzehnte, ist eine Diversifizierung von Zelltypen ersichtlich, die beim 128-Zell-Stadium mit der großen Welle der zygotischen Genomaktivierung (ZGA), einer Veränderung des Chromatinzustandes und dem Verlust der Entwicklungsplastizität einhergeht. Ein kleiner Teil von Genen, im Allgemeinen zelltypspezifische Transkriptionsfaktoren, wird schon vor der großen Welle der ZGA exprimiert, während sich gut offene Chromatinstrukturen auf wenige, distinkte regulatorische Sequenzen beschränken. Von diesem Zeitpunkt an, wird die Genexpression zelltypspezifisch, auch wenn viele Chromatinelemente weiterhin zelltypübergreifend offen sind. Insgesamt sind die Chromatinelemente recht kompakt und Elemente innerhalb der Gene häufig. Danach porträtiere ich noch die regulatorischen Veränderungen die mit der neuralen Entwicklung, sowie der Diversität von skelettbildenden Zellen im Seeigel einhergehen. Zuletzt identifiziere ich ~ 100 Gene, die in die Kalzifizierung des Skelettes des Seeigels involviert sind. / The emergence of multiple, stable cell lineages from a single-cell zygote is the essence of multicellular development. Combinatorial transcription factor expression is central to this process, as well as epigenetic changes whose relationship to changes in cell-identity are far less well understood. In this thesis, I use data from scATAC-seq and scRNA-seq (with metabolic labeling; scSLAM-seq) to characterize the regulatory landscapes of sea urchin development spanning from the 4-cell embryo through maternal zygotic transition (MZT), gastrulation, and the early pluteus larvae with its ecologically relevant structures (~72h). The early fate-map in sea urchins is well understood, providing an ideal model for this analysis; the basic fate-map is established by the fourth cleavage (though inducible lineage changes are possible up to the 128-cell stage) after which germ-layer identity is locked, though there remains considerable plasticity within lineages at least through gastrulation. Using these data, along-side classic research into cell fate maps in the early embryo, I find that cell-type diversification and a loss of plasticity at 128-cell stage corresponds to a major wave of zygotic genome activation (ZGA) and a clear resolution of the chromatin landscape in the sea urchin. However, a subset of genes, often cell-type-specific transcription factors, shows evidence of pre-MZT zygotic expression with early chromatin accessibility limited to few sites with distinct regulatory sequences. From this time, gene expression profiles become highly cell-type-specific, though many regulatory elements remain ubiquitously accessible, suggesting differential transcription factor occupancy at broadly accessible sites. Overall, the regulatory landscape is fairly compact with accessible intragenic elements being frequent. Subsequently, I profile the regulatory changes underlying neurodevelopment and the diversity of skeletogenic cells in the sea urchin. Finally, I also identify ~ 100 genes that are associated with calcification of the sea urchin skeleton.

Der Transkriptionsfaktor CEBPA reguliert Differenzierung und Proliferation in verschiedenen Zelltypen und spielt eine herausragende Rolle in der Hämatopoese. Die CEBPA RNA kann in die lange P42-Isoform oder die N-terminal verkürzte P30-Isoform translatiert werden. Während P42-CEBPA differenzierungsinduzierend wirkt, ist P30 als Inhibitor von P42 und als Onkogen in akuter myeloider Leukämie beschrieben. Die Modularität und Multifunktionalität von CEBPA, die ihn zahlreichen Studien beobachtet wurde, lässt sich möglicherweise durch differentielle Protein–Protein-Interaktionen erklären. Zahlreiche post-translationale Modifikationen (PTMs) und die intrinsisch ungeordnete, flexible Struktur von CEBPA stellen jedoch eine Herausforderung für traditionelle Ansätze in Proteininteraktionsstudien dar. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer, alternativer Ansatz präsentiert, der auf einem in vitro Proteininteraktions-screen auf einer Peptidmatrix (PRISMA) und Biotinligase proximity labelling (BioID) in lebenden Zellen basiert. In einem PRISMA-screen wurden 120 CEBPA Peptide auf Proteininteraktionen mit Proteinextrakt aus myeloiden Zellen untersucht. Im Screen wurden 40 verschiedene CEBPA PTMs inkludiert, unter anderem auch die hier erstmals neu beschriebenen Methylierungen der CEBPA Argininreste R12 und R142. Daten aus dem PRISMA-screen wurden mit BioID Experimenten in myeloiden Zellen validiert, um eine Proteininteraktionslandkarte von CEBPA zu generieren, die 52 bekannte und 68 neue CEBPA Proteininteraktoren umfasst. Hotspots für Proteininteraktionen fallen in evolutionär konservierte CEBPA Regionen und der Vergleich des Bindungsprofils mit publizierten Daten zeigt Ähnlichkeiten zu verwandten Transkriptionsfaktoren der CEBP Familie. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Multifunktionalität von CEBPA von multivalenten Proteininteraktionen in Abhängigkeit von PTMs koordiniert wird, um CEBPA mit dem epigenetischen und transkriptionellen Apparat der Zelle verknüpfen. / The pioneering transcription factor CEBPA plays a lineage-instructing role during haematopoiesis and also regulates proliferation and differentiation in many other cell types. The CEBPA RNA can be translated into a full length (P42-CEBPA) or N-terminally truncated isoform (P30-CEBPA). While P42 induces differentiation in various cell types, the P30 isoform is mostly regarded as a dominant inhibitor of P42-CEBPA and acts as an oncogene in acute myeloid leukaemia. Protein interactions may be the key to explaining the functional plasticity and modularity of CEBPA that has been demonstrated in diverse experimental settings. However, the disordered structure and the numerous post-translational modification sites (PTMs) of CEBPA pose a challenge to traditional protein interaction studies. In the present work, a novel alternative approach is presented that combines an in vitro protein interaction screen on a peptide matrix (PRISMA) with biotin ligase proximity labelling (BioID) in living cells. To this end, 120 CEBPA peptides were probed for protein interactions with PRISMA. The screen comprised 40 different PTMs, including newly identified CEBPA arginine methylation sites. PRISMA data was validated with BioID experiments and generated a detailed CEBPA protein interaction map in myeloid cells. The interactome presented here contains 52 known and 68 novel CEBPA interactors that can now be mapped across the CEBPA sequence in a PTM dependent fashion. Hotspots of protein interaction correlated with conserved regions and comparison with previously published data revealed related binding profiles of homologous CEBP regions. Taken together, the data indicates that the functional plasticity of CEBPs is orchestrated by multivalent protein interactions and PTMs to configure a dynamic CEBP hub that interacts with many partners of the transcriptional and epigenetic machinery.

Zirkadiane Uhren sind Zell-autonome Oszillatoren. Aus diesem Grund ist deren interzelluläre Kopplung essentiell, um die Synchronität zirkadianer Oszillatornetzwerke zu erhalten und die Störung zirkadianer Gewebsfunktionen zu verhindern. Neuronale Oszillatoren des Nucleus suprachiasmaticus (SCN), der Schrittmacher-Uhr im Zentralnervensystem der Säugetiere, koppeln interzellulär und über den Austausch sekretierter Neurotransmitter. Die Fähigkeit zirkadianen Oszillatoren peripherer Gewebe interzellulär zu koppeln ist hingegen stark umstritten und molekulare Mechanismen sind unbekannt. In dieser Dissertation zeigen wir, dass periphere Oszillatoren in der Tat interzellulär über den Austausch sekretierter Signalmoleküle koppeln und identifizieren TGF-b als peripheren Kopplungsfaktor. Weiterhin zeigen wir, dass TGF-b die cAMP Enhancer-Motiv abhängige, als auch Immediate Early Expression des Uhr-Gens PER2 induziert und folglich die Phasenanpassung molekularer zirkadianer Oszillationen reguliert. Genetische und pharmakologische Störeinflüsse verursachen die Dysregulation des TGF-b Signalweges und begünstigen die Desynchronisierung zellulärer Oszillatoren, welche sich in Amplitudenreduktion und verstärkter Sensitivität gegenüber Zeitgeber-Signalen äußert. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse, legen einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus intrazellulärer Kopplung peripherer zirkadianer Oszillatoren dar und eröffnen neue Perspektiven auf die Bedeutung der Synchronität peripher zirkadianer Uhren für rhythmische Organfunktionen und zirkadiane Gesundheit. / Circadian clocks are cell-autonomous oscillators. Intercellular coupling is crucial to prevent desynchronization of oscillator networks and thus, the disruption of circadian tissue functions. While neuronal oscillators within the mammalian central clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN), couple intercellularly via the exchange of secreted neurotransmitters, intercellular coupling among peripheral oscillators is highly debated and molecular mechanisms are unknown. Here, we show that peripheral circadian oscillators couple intercellularly via exchange of secreted signaling molecules and identify TGF-ß as peripheral coupling factor. TGF-ß signaling induces the cAMP response element dependent, immediate-early expression of the clock gene PER2, thereby phase-adjusting the molecular circadian oscillator. Genetic or pharmacologic disruption of TGF-ß signaling causes desynchronization of cellular oscillators resulting in amplitude reduction and increased sensitivity towards Zeitgeber cues. Our findings reveal a previously unknown mechanism of peripheral coupling and open new perspectives on the importance of peripheral clock synchrony for rhythmic organ functions and circadian health.

Genetisch bedingte Veränderungen im Wnt-Signalweg sind in der Tumorigenese des Darms von zentraler Bedeutung. Mutationen des Wnt-Effektormoleküls β-Catenin in den adulten Stammzellen des Darmepithels führen zu unkontrollierter Proliferation und Expansion der Darmstammzellen und initiieren die Tumorentstehung. Auch in fortgeschrittenen Darmtumoren unterstützt die Wnt-Signalgebung maßgeblich das Tumorwachstum und den Erhalt von Tumorstammzellen. Nach erfolgreicher chemotherapeutischer Behandlung treten oftmals Tumorrezidive auf, für deren Entstehung therapieresistente Tumorstammzellen verantwortlich gemacht werden. Trotz intensiver Forschung fehlen in der Darmkrebstherapie nach wie vor Behandlungsansätze zur gezielten Therapie der Tumorstammzellen. Ziel dieser Dissertation ist es, unser Verständnis der molekularen Regulationsmechanismen in Kolonkarzinomen zu erweitern und die Entwicklung rationaler Behandlungsstrategien zu fördern. Ich konnte die Histonmethyltransferase Mll1 als entscheidenden Faktor in der epigenetischen Regulation humaner und muriner Darmkrebsstammzellen und -tumore identifizieren. Humane Kolonkarzinome weisen eine erhöhte Mll1-Expression auf, die mit dem Level an nukleärem β-Catenin korreliert. Im adulten Darmepithel ist Mll1 insbesondere in den Lgr5+ Stammzellen exprimiert und maßgeblich an der Wnt/β-Catenin-induzierten Stammzellexpansion sowie der Tumorentstehung beteiligt. Der konditionelle Verlust von Mll1 im murinen Darmkrebsmodell verhindert die β-Catenin-induzierte Tumorigenese. Mll1 unterstützt die Selbsterneuerungsfähigkeit und Proliferation der Tumorstammzellen, indem es die Expression von essentiellen Stammzellgenen wie dem Wnt-abhängigen Stammzellmarker Lgr5 aufrechterhält. Eine Inhibition der Mll1-Funktion in der Darmkrebstherapie kann eine gezielte Eliminierung der Tumorstammzellen ermöglichen, wodurch das fortschreitende Tumorwachstum unterbunden und die Bildung von Rezidiven verhindert werden kann. / Genetic mutations inducing aberrant activity of Wnt signalling are causative for intestinal tumorigenesis. Mutations of the Wnt effector molecule β-catenin in adult stem cells of the intestinal epithelium drive uncontrolled proliferation, expand the stem cell pool and initiate tumor formation. In advanced tumors, aberrant Wnt signalling promotes tumor growth and maintains cancer stem cells. The cancer stem cells are highly resistant to conventional chemotherapy and frequently initiate tumor relapse after completion of treatment. Despite extensive research, we are still lacking efficient therapies for colon cancer that specifically eliminate the cancer stem cells. This dissertation aims to expand our knowledge on molecular gene regulatory mechanisms in colon cancer cells to promote the identification and future development of rational therapies for colon cancer patients. I identified the histone methyltransferase Mll1 as an epigenetic regulator in human and mouse intestinal cancer stem cells and tumors. Human colon carcinomas with nuclear β-catenin exhibit high levels of Mll1. In the adult intestinal epithelium of mice, Mll1 is highly expressed in the Lgr5+ stem cells and is a prerequisite for the oncogenic Wnt/β-catenin-mediated stem cell expansion and tumorigenesis. Conditional knockout of Mll1 in an intestinal mouse tumor model prevents the β-catenin-driven intestinal tumorigenesis. Knockdown of Mll1 impairs the self-renewal and proliferation of colon cancer sphere cultures and halts tumor growth in xenografts. Mechanistically, Mll1 sustains the expression of intestinal stem cell genes including the Wnt/β-catenin target gene Lgr5 by antagonizing gene silencing through polycomb repressive complex 2-mediated H3K27 tri-methylation. Interfering with Mll1 function can efficiently eliminate colon cancer stem cells, and has potential as a rational therapy for colon cancer.

Die Entdeckung der Kanalrhodopsine (ChRs) C1 und C2 aus der Grünalge Chlamydomonas reinhartii vor 10 Jahren brachte die neue Proteinfamilie der lichtgesteuerten Ionenkanäle hervor. Diese 7-Transmembranproteine verwenden all-trans Retinal, um Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. Bei Lichtabsorption isomerisiert das Retinal und das Protein öffnet daraufhin seine Pore, die es Ionen wie H+, Na+ und Ca2+ erlaubt, abhängig von ihrem elektrochemischen Gradienten, die Membran zu passieren. Insbesondere in der Neurophysiologie findet seit kurzem das C2 eine breite Anwendung, da seine Expression in Nervenzellen es erlaubt, mittels kurzer Lichtpulse die elektrische Aktivität dieser Zellen zu kontrollieren. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die beiden neuen ChRs V1 und V2 aus der mehrzelligen Grünalge Volvox carteri elektrophysiologisch charakterisiert. Hierbei zeigte sich, dass V2, ähnlich wie C2, im blauen Spektralbereich absorbiert und auch, dass sich die kinetischen Eigenschaften stark ähneln. Dagegen besitzt V1 eine um 70 nm längerwellig verschobene Absorption auf 535 nm bei einer ~ 10 x langsameren Abklingkinetik als C2. Durch die schlechte Membranintegration von V1 in eukaryotischen Zellen ist der Photostrom gering und die Anwendungen in Neuronen stark eingeschränkt. Um die Membranintegration zu verbessern, wurden einzelne Helices von V1 gegen die entsprechenden Helices der anderen ChRs ausgetauscht. Hierbei wurde eine Chimäre C1V1-25, die aus den ersten 2 Helices von C1 und den restlichen 5 Helices von V1 besteht, entwickelt. Die Chimäre besitzt weiterhin eine rotverschobene Absorption bei 539 nm, einen 4 x höheren Photostrom als V1 und der doppelt so hoch ist wie der von C2. / The discovery of the channelrhodopsins (ChRs), C1 and C2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii 10 years ago, created the new protein family of light-gated ion channels. Those 7-Transmembranproteins are utilizing all-trans retinal to absorb light at specific wavelength. Upon light absorption the retinal isomerizes which leads to opening of a protein pore allowing ions such as H+, Na+ and Ca2+ to pass the membrane depending on their electrochemical gradient. In the last years C2 attracted a lot of attention in neuroscience since its expression in neurons allows to control their electrical properties with short light pulses. This work presents the electrophysiological characterization of two new ChRs V1 and V2 from the multicellular agla Volvox carteri for the first time . V2 absorbs light in the blue visible range like C2 and almost identical kinetic properties. In contrast, V1 exhibit a 70 nm redshifted absorption towards 535 nm and a ~ 10 x slower off-kinetic than C2. Since V1 displays only weak membrane targeting the resulting overall small photocurrent in eukaryotic cells significantly hampered its application in neuronal cells. To improve membrane targeting and to retain redshifted absorbance helices from V1 were exchanged with the corresponding helices from the other ChRs. A chimera called C1V1-25, which consists out of the first 2 helices from C1 and the last 5 helices from V1 showed a absorbance maximum at 539 nm and exhibit a 4 times higher photocurrent even beeing 2 times higher then the one of C2.