Ökomorphologische Konvergenz tritt auf, wenn Arten mit demselben Lebensstil unabhängig voneinander ähnliche morphologische Merkmale evolvieren. Neue Fallstudien können dabei helfen, die diesem Prozess zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären. Diese Arbeit befasst sich mit einigen konvergent evolvierten, langsamen, baumbewohnenden Säugetieren, d. h. zwei Linien baumlebender Faultieren, dem Zwergameisenbär, den Lorisiden, zwei Kladen ausgestorbener Lemuren, d. h. Paläopropithekiden und Megaladapis, und dem Koala. Es werden funktionsmorphologische Konvergenzen in diesen Taxa erforscht, indem ihr Humerus und ihr Femur sowie jene ihrer nah verwandten, aber ökologisch unterschiedlichen Taxa untersucht werden. Erstmals werden Knochen mittels phylogenetisch vergleichender Methoden auf vier anatomischen Ebenen, d.h. äußere Form, diaphysäre Mikrostruktur und Anatomie sowie epiphysäre Trabekelarchitektur, analysiert. Viele langsame, baumbewohnende Säugetiere teilen eine geringe kortikale Kompaktheit, was wahrscheinlich mit ihrer extrem niedrigen Stoffwechselrate und ihren biomechanischen Anforderungen zusammenhängt. Langsame, arboreale Xenarthra, d. h. baumbewohnende Faultiere und der Zwergameisenbär, weisen ein Muster unvollständiger Konvergenz für eine Reihe äußerer und innerer anatomischer Merkmale auf, was möglicherweise durch die relativ unterschiedliche Ökologie des Zwergameisenbären erklärt wird. Auf einer breiteren Säugetierskala konvergieren andere Merkmale, die möglicherweise mit der Ökologie der langsamen baumbewohnenden Lebensweise in einigen der untersuchten Taxa zusammenhängen, obwohl komplexe Muster auch durch andere evolutionäre Prozesse erklärt werden können. Nur suspensorisch lebende Taxa tragen signifikant zur Konvergenz bei. Diese Arbeit hebt die stärkere Konvergenz hervor, die sich in der inneren Struktur des Knochens widerspiegelt. / Ecomorphological convergence occurs when similar morphological traits are independently evolved by species with the same lifestyle. Novel case studies can help to elucidate the underlying mechanisms of this process. This work addresses some convergent slow arboreal mammals, i.e. two lineages of ‘tree sloths’, the silky anteater, ‘Lorisidae’, two clades of extinct lemurs, i.e. palaeopropithecids and Megaladapis, and the koala. Functional morphological convergences are searched in these taxa, studying their humerus and femur as well as those of their closely related ecologically distinct taxa. For the first time, bones are analyzed at four anatomical levels, i.e. external shape, diaphyseal microstructure and anatomy and epiphyseal trabecular architecture, through phylogenetic comparative methods. Many slow arboreal mammals share a low cortical compactness, probably related to their extremely low metabolic rate and biomechanical demands. Slow arboreal xenarthrans, i.e. ‘tree sloths’ and the silky anteater, exhibit a pattern of incomplete convergence for a set of external and internal anatomical features, possibly explained by the relatively distinct ecology of the silky anteater. On a wider mammalian scale, other traits possibly related to slow arboreal ecology converge in some of the studied taxa, although with complex patterns also explained by other evolutionary processes. Only suspensory taxa significantly contribute to convergence. This thesis highlights the stronger convergence reflected by bone internal structure. By providing potential explanations for convergence in slow arboreal mammals, the inherent complexity of this process is here emphasized.

Die Alkoholsucht ist ein global verbreitetes Phänomen und kennzeichnet sich durch eine Transition von kontrolliertem zu zwanghaftem Alkoholkonsum.Die Tendenz, einem neutralen Reiz eine Anreizwirkung zuzuschreiben, ist individuell unterschiedlich und stellt einen Risikofaktor für die Entwicklung einer Abhängigkeit dar.Zur Entwicklung spezifischer Präventionsstrategien ist ein besseres Verständnis der Zusammenhänge zwischen der Anreizsalienz und Alkoholabhängigkeit erforderlich.Der Übergang von mäßigem zu zwanghaftem Alkoholkonsum wurde durch das Modell des Alkoholentzugseffekts simuliert, das den menschlichen Alkoholrückfall nachahmt.Die Ratten erhielten freiwilligen Zugang zu verschieden Alkohollösungen mit wiederholten Deprivations- und Alkoholphasen.Die Ratten durchliefen zusätzlich den Pavlovian Conditioned Approach getestet, welcher die individuellen Tendenzen auf einen bedingten Reiz/Belohnung quantifiziert.Während des letzten ADE-Zyklus wurde mit Geschmacksverfälschung zwanghaftes Trinken ermittelt.Nach der Identifizierung zuverlässiger Prädiktoren für Suchtverhalten wurde präventive Neurostimulation durchgeführt, um die Tendenz der Tiere alkoholbezogenen Reizen eine motivationale Bedeutung beizumessen, zu beeinflussen, und die Manifestation eines Abhängigkeitsverhaltens zu verhindern. Weibchen tranken mehr Alkohol als Männchen und zeigten ST Verhalten im PavCA, während Männchen GT aufwiesen.Die Anwendung von transkranieller Gleichstromstimulation während PavCA führte zu mehr GT-Verhalten bei stimulierten Ratten.Frühe tDCS während des Trinkens hatte keinen Einfluss auf das akute und das Langzeit-Trinken. Die Ergebnisse zeigen eine komplexere Beziehung zwischen Anreizsalienz und Alkoholsucht und unterstreichen,individuelle Unterschiede und beide Geschlechter in der präklinischen Forschung zu berücksichtigen. / The consequences of alcohol dependence cause the global deaths of million people yearly.The ability of the environment can trigger dependent behavior and promote drinking.The tendency to attribute incentive salience to cues differs between subjects.By forming a cue-alcohol association, neutral cues receive motivational value,thereby predicting the likelihood of alcohol reward occurrence,known as Pavlovian learning.Understanding the relationship between incentive salience and alcohol addiction help inform treatment strategies.We study the relationship between incentive salience and alcohol addiction.The transition from moderate to compulsive alcohol intake can be captured by the alcohol deprivation effect rat model (mimics alcohol relapse in humans).Rats were given voluntary access to alcohol solutions with repeated abstinence/reintroduction phases.Further,rats were tested in the PavCA,which quantifies individual tendency toward a conditional cue and the reward, thus allowing to trace the process of attributing incentive salience to rewardcues.During the final ADE cycle,rats underwent a bitter taste adulteration test to assess for compulsive-like behavior.After identifying reliable predictors of addictive behavior,preventive tDCS was performed to influence the tendency of animals to attach motivational importance to alcohol-related stimuli,and to prevent the manifestation of alcohol addictive behavior.Females drank more alcohol than males and exhibited more ST behavior in the PavCA, whereas males showed GT behavior.PavCA phenotypes emerged early and remained stable.The application of tDCS during PavCA results in high GT numbers in stimulated rats.Early tDCS on drinking does not affect acute or long-term drinking.Our findings indicate a complex relationship between incentive salience and alcohol addiction and emphasize the importance of considering individual differences and both sexes in preclinical research.

Es wird vermutet, dass das Zusammenspiel von NF-κB-Signalen und Autophagie die Entzündung in verschiedenen zellulären Kontexten und als Reaktion auf unterschiedliche Stimuli reguliert. Der molekulare Mechanismus, durch den diese beiden Signalwege bei der Regulierung der Entzündungsreaktion zusammenwirken, ist jedoch noch nicht bekannt. Mithilfe biochemischer Analysen und bildgebender Verfahren haben wir zum ersten Mal die Interaktion zwischen dem autophagischen Marker LC3 und der NF-κB/p65-Untereinheit als Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen charakterisiert. Wir konnten zeigen, dass die Anhäufung von LC3 im Zellkern nach der NF-κB-Aktivierung mit p65 interagiert, was durch die Ubiquitinierung des p65-Proteins gefördert und durch den Cargo-Rezeptor p62 erkannt wird. Zusammengenommen weisen diese Daten auf eine neue Rolle von p62 beim Transport von im Kern ubiquitiniertem p65 zu Autophagosomen hin, wo es abgebaut wird, um die entzündungsbedingte NF-κB-Hyperaktivierung zu kontrollieren. Diese Erkenntnisse sind wichtig für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen Krankheiten, die mit einer gestörten Autophagie und einer konstitutiven NF-κB-Aktivität einhergehen. Die NF-κB-Signalübertragung spielt nicht nur eine entscheidende Rolle bei Entzündungen und der Tumorbildung, sondern ist auch für Entwicklungsprozesse wichtig. Durch die Etablierung von 3D-Organoid-Kulturen aus dem Dünndarm und unter Verwendung verschiedener Mauslinien weisen wir im zweiten Teil der Arbeit nach, dass NF-κB eine wichtige Funktion bei der Zelldifferenzierung und der Erhaltung von Stammzellen in vivo und ex-vivo spielt. Wir konnten zeigen, dass die Proliferation und das Absterben von Darmepithelzellen (IEC) bei Mäusen mit ubiquitärer Unterdrückung der NF-κB-Aktivität unverändert sind, während die Zahl der Becherzellen auf Kosten der Paneth-Zellen zunimmt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Ergebnisse eine neue IEC-immanente Rolle von NF-κB bei Entscheidungen über das Zellschicksal und die Differenzierung aufzeigen, die über die Regulierung der Wnt-Signale und der Sox9-Expression stromabwärts von NF-κB erfolgt. Die hier beschriebenen Erkenntnisse verbessern unser Verständnis der NF-κB-Funktionen in der Stammzellbiologie, die, wenn sie dereguliert sind, auch Auswirkungen auf die Entzündung des Darms und die Tumorentstehung haben. / The interplay between NF-κB signaling and autophagy has been suggested to regulate inflammation in different cellular contexts and in response to different stimuli. However, the molecular mechanism by which these two pathways interact to regulate the inflammatory response remains elusive. By using biochemical analysis and imaging techniques, we characterized for the first time the interaction of autophagic marker LC3 and NF-κB/p65 subunit in response to different stress conditions. We demonstrated that the accumulation of LC3 within the nucleus interacts with p65 following NF-κB activation, which is promoted by ubiquitination of p65 protein and recognized by the cargo receptor p62. Together, these data identify a novel role for p62 in trafficking nuclear-ubiquitinated p65 to autophagosomes for degradation to control inflammation-driven NF-κB hyperactivation. These findings are important for developing novel therapeutic strategies against diseases involving defective autophagy and constitutive NF-κB activity. In addition to its critical role in inflammation and tumor formation, NF-κB signaling is essential in developmental processes. Establishing 3D organoid culture from the small intestine and using different mouse lines, we prove in the second part of the thesis that NF-kB plays an important function in cell differentiation and stem cell maintenance in vivo and in ex-vivo. We demonstrated that while intestinal epithelial cell (IEC) proliferation and death are unaltered in mice with ubiquitous suppression of NF-κB activity, goblet cell numbers increase at the expense of Paneth cells. In summary, our results revealed a novel IEC-intrinsic role of NF-κB in cell fate decisions and differentiation which occur via regulation of Wnt signaling and Sox9 expression downstream of NF-κB. The findings described here improve our understanding of NF-κB functions in stem cell biology which, when deregulated, also have an impact on intestinal inflammation and tumorigenesis.

Neuroendokrine Neoplasmen der Bauchspeicheldrüse (PanNEN) sind eine seltene und vielfältige Form von Krebs. PanNENs umfassen hochgradige PanNECs und NETG3 PanNETs, sowie die öfter diagnostizierten NETG1 und NETG2 PanNETs. Hochgradige PanNENs weisen eine schlechte Prognose auf, und sind histologisch schwierig zu diagnostizieren. In dieser Studie wird eine auf Methylierung basierende Klassifizierung vorgestellt, die PanNETs von PanNECs unterscheidet und die zugrunde liegende Komplexität in Bezug auf molekularen Merkmalen und den Ursprungszellen der PanNENs aufzeigt. Zuerst wurden PanNENs auf Grundlage ihrer Methylierungsprofile gruppiert, wodurch sich die PanNETs und PanNECs in zwei Gruppen A und B aufteilten. Während Tumore der Gruppe B häufig Veränderungen in KRAS, TP53 und SMAD4 aufweisen, umfasst das Mutationsspektrum von Gruppe A Veränderungen in klassischen PanNEN-Genen wie MEN1, DAXX, ATRX und VHL. Darüber hinaus ist Gruppe A durch chromosomale Aberrationen geprägt, während Gruppe B eine signifikante fokale Deletion des RB1-Lokus aufweist. Anhand von Methylierungsprofilen von alpha-, beta-, duktalen und azinären Pankreaszellen sowie von Expressionsmustern normaler Zelltyp Markergene innerhalb der Tumore folgt, dass die PanNETs alpha-, beta- und intermediär-ähnliche Tumore endokrinen Ursprungs sind, während die PanNECs azinäre Tumore vermutlich exokrinen Ursprungs sind. Ausprägung des Azinuszellenprofils und Expression des SOX9-Proteins in Gruppe B sind vergleichbar mit denen des duktalen Adenokarzinoms der Pankreas (PDAC), einer Tumorentität mit nachgewiesen exokrinen Zellursprung. Insgesamt ergeben die neuen Erkenntnisse dieser Arbeit ein umfassendes Profil, das PanNET- und PanNEC-Tumore genetisch und epigenetisch eindeutig charakterisiert. Weiterhin liefert diese Arbeit starke Beweise für die aufkommende, aber unbewiesene Theorie des exokrinen Ursprungs von PanNECs und somit einen neuen Ansatz für die Behandlung dieser seltenen, aber oft tödlichen Krankheit. / Pancreatic Neuroendocrine Neoplasm (PanNEN) is a rare form of cancer comprising a heterogeneous set of high-grade tumors PanNECs and NETG3, in addition to the more commonly diagnosed NETG1 and NETG2 PanNETs. High-grade PanNENs display poor prognosis among patients and remains challenging to diagnose histologically. This study presents a methylation-based classification, which precisely distinguishes PanNETs and PanNECs, exposing the complexity evident in molecular and tumor cell-of-origin features of PanNENs. My work establishes distinct PanNEN subgroups based on methylation profiles. The PanNETs and PanNECs were separated into two groups: Group A and Group B, respectively. While Group B tumors are enriched for recurring alterations in KRAS, TP53 and SMAD4, the mutational spectrum of Group A encompasses alterations in classical PanNEN genes including MEN1, DAXX, ATRX and VHL. Recurring whole chromosomal aberrations are evident in Group A tumors, in contrast to Group B tumors, which reveal a significant focal deletion of the RB1 locus. Using methylation profiles of normal pancreatic cell types, in addition to expression patterns of normal cell type marker genes within tumors, the study concluded that the PanNET tumors are alpha-like, beta-like, and intermediate-like tumors of endocrine origin, while PanNECs of Group B are acinar-like tumors with a potential exocrine origin. The proportion of acinar-cell methylation profile and expression of SOX9 protein in Group B tumors are comparable to Pancreatic Ductal adenocarcinoma (PDAC), a tumor entity of exocrine cell-of-origin. Together, the novel findings of this thesis establish a comprehensive profile distinctly characterizing PanNET and PanNEC tumors at the genetic and epigenetic molecular level. Importantly, this work provides strong evidence for the emerging yet unproven theory of an exocrine origin of PanNECs, offering a new approach for treating patients with this rare but often fatal disease.

RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.

Malaria ist eine Krankheit, die durch den Protozoen Plasmodium verursacht und von Anopheles Moskitos durch infektiöse Stiche übertragen wird. Diese ̈Übertragung kann durch verschiedene Interventionsstrategien blockiert werden. Eine relativ neue Strategie, die bisher nur im Labor getestet wurde, ist der Einsatz genetisch veränderter Moskitos, die den Parasiten nicht auf einen neuen menschlichen Wirt übertragen können. Ein Ansatz ist die Entwicklung von Moskitos, die mit murinen Antikoepern ausgestattet sind, die gegen relevante Oberflächenproteine des Parasiten, dem Circumsporozoite Protein (CSP) gerichtet sind. Es ist jedoch nach wie vor unklar, welches Entwicklungsstadium angegriffen werden soll und welche Antikörper für diesen Ansatz effizient sind. Hier zeige ich, dass in Stechmücken, die mit einem humanen Anti-CSP-Antikörper ausgestattet sind, die Sporogonie der Oozysten in Abhängigkeit von der Parasiten-dichte blockiert wird und somit die Sporozoitenlast in den Mücken signifikant verringern. Insbesondere Antikörper, die sich an die ’Repeat Region’ des CSP binden, können die Sporozoitenlast in der Stechmücke verringern. Des Weitern, zeigen diese Stechmücken kaum Defekte in der Entwicklung und im Überleben. Diese Ergebnisse bestätigen die zuvor beschriebene Bedeutung von CSP während der Sporogonie und unterstreichen die Effizienz von humanen, ’Repeat Region’ bindenden Anti-CSP-Antikörpern bei der Beeinträchtigung der Parasitenentwicklung in dem Vektor. Darüber hinaus ist in Stechmücken, die mit humanen Anti-CSP Antikörpern ausgestattet sind, die Entwicklung von Sporozoiten teils limitiert und teils komplett verhindert. Dies macht sie zu einem vielversprechenden Instrument für Maßnahmen zum Malaria Kontrolle. In dieser Arbeit habe ich weitere Einblicke in den Mechanismus , durch den Anti-CSP-Antikörper die Parasitenentwicklung in der Mücke stören, und gezeigt, dass Oozysten ein effizientes Ziel für diesen Ansatz sind. / Malaria is a disease caused by the protozoan parasite Plasmodium and transmitted by Anopheles mosquitoes trough infectious bites, these transmission events can potentially be blocked by different intervention strategies. A relatively new strategy which has been only tested in the laboratory is the use of genetically modified mosquitoes unable to transmit the parasite to a new human host. In the past, murine derived antibodies directed against relevant parasite surface proteins were used with limited success. It remains unclear which developmental stage is targeted, and which antibodies are useful. Here, I show that in mosquitoes equipped with a human derived anti-CSP repeat binding antibody, oocyst sporogony is blocked in a parasite density dependent manner. Only repeat binding antibodies could decrease sporozoite loads in the mosquito. These results confirm the previously described importance of CSP during sporogony and highlight the efficiency of human derived repeat binding anti-CSP antibodies in interfering with parasite development even in a different host. Additionally, mosquitoes equipped with human derived anti-CSP antibodies show little (in high density infections) to no (in low density infections) sporogonic development, making them a promising tool for malaria transmission blocking interventions. I provided additional insights into the mechanism by which anti-CSP antibodies interfere with parasite development in the mosquito showing that oocysts are an efficient target for this approach. Therefore, the mosquitoes used here are potentially resistant in a more natural setting. Additionally, I provided a new tool allowing a faster screening of antibodies in a mosquito context by injection of single chain Fabs into the mosquito hemolymph. Taken together, this approach could one day give rise to alternative strategies in tackling malaria transmissions.

QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.

Die Menge an RNA in Eukaryonten wird durch ihre kinetischen Transkriptions-, Verarbeitungs- und Abbauraten bestimmt. Diese kinetischen Raten wurden bereits ausführlich in Zellpopulationen untersucht, allerdings unter der Annahme, dass diese in verschiedenen Zelltypen identisch sind. Die Genexpression ist jedoch während biologischer Prozesse wie z.B der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Zellteilung hochdynamisch. Die Untersuchung der RNA- Kinetikraten in Einzelzellen, die sich in verschiedenen Phasen desselben dynamischen Prozesses befinden, kann uns ein umfangreicheres Bild davon geben, wie RNA-Kinetikraten die Genexpression zeitabhängig koordinieren. In diesem Projekt, Wir haben die Methode der RNA- Stoffwechselmarkierung und der biochemischen Nukleosidkonversion mit der Einzelzell-RNA- Sequenzierung kombiniert. Wir leiteten ein zeitabhängiges kinetisches Geschwindigkeitsmodell ab und schätzten RNA-Transkriptions- und - Abbauraten über den zeitlichen Verlauf des Zellzyklus ab. Dabeiverwendeten wir Näherungen basierend auf der Lösung des resultierenden Differentialgleichungssystems. Wir fanden heraus, dass Transkriptions- und Abbauraten der meisten zyklischen Gene hochdynamisch sind. Unterschiedliche kinetische Regulationsmuster formen spezifische Genexpressionsprofile. Etwa 89 % der 377 von uns analysierten zyklischen Gene werden durch dynamische Transkriptions- und Abbauraten reguliert. Während der dynamischen Transkriptionsrate beobachteten wir auch, dass einige zyklische Gene durch dynamische Zerfallsraten angetrieben wurden. Unsere Studie bekräftigt die Bedeutung der zeitlichen Regulation von der Genexpression durch Produktion und Zerfall. Darüber hinaus hat die von uns entwickelte Methode das Potenzial, an verschiedene biologische Prozesse angepasst zu werden. Unser Ansatz in dieser Studie kann die Untersuchung der zeitlichen Genexpressionsregulation und der RNS- Kinetikraten voranbringen. / RNA abundance in eukaryotes is determined by its kinetic rates of transcription, processing and degradation. Each of the kinetic rates has been extensively studied in bulk cell populations assuming they are equal in different cells. However, gene expression is highly dynamic during biological processes such as cell proliferation, cell differentiation, and cell division. Investigation of RNA kinetic rates in individual cells which are in different phases of the same dynamic process can give us a more comprehensive picture of how RNA kinetic rates coordinate gene expression in a time-dependent manner. In this project, we adapted the RNA metabolic labeling and biochemical nucleoside conversion method to droplet- based single-cell RNA sequencing. We derived a time- dependent kinetic rate model and estimated RNA transcription and degradation rates over the time course of the cell cycle using approximations based on the solution of the resulting system of differential equations. We found that transcription and degradation rates of most cycling genes are highly dynamic. Different kinetic regulation patterns shape specific gene expression profiles. Around 89% of the 377 cycling genes we analyzed are regulated by dynamic transcription and degradation rates. While dynamic transcription rate was prevalent, we also observed some cycling genes were driven by dynamic decay rates. Our study underscores the importance of temporal gene expression regulation by both production and decay. Moreover, the method we developed has the potential to be adapted to different biological processes. We suggest that our approach can advance the study of temporal gene expression regulation and RNA kinetic rates.

Jedes Jahr infizieren sich mehr als 200 Millionen Menschen mit Malaria. Eine halbe Millionen von ihnen verstirbt. Die Mehrzahl der Krankheits- und Todesfälle wird durch den Parasiten Plasmodium falciparum verursacht, einen von sechs Stämmen von Malariaparasiten, der Menschen infizieren kann. Der P. falciparum-Parasit hat in unterschiedlichem Maße Resistenzen gegen die meisten derzeit verwendeten Malariamittel entwickelt, und es besteht ein ständiger Bedarf an der Entwicklung neuer Malariamedikamente. Zwei Wirkstoffe, die sich derzeit in der klinischen Erprobung gegen Malaria befinden, zielen auf ’Ionenpumpen’ in der Oberflächenmembran des Malariaparasiten ab. Die Ionenregulation im Parasiten P. falciparum war in den letzten Jahrzehnten Gegenstand umfangreicher Forschung, welche zu einem allgemeinen Verständnis darüber geführt, wie der Parasit seine interne Ionenhaushalt reguliert. Es wurde jedoch noch nicht versucht, diese Erkenntnisse in ein quantitatives Modell zu integrieren. In dieser Arbeit habe ich ein mathematisches Modell für die Ionenhomöostase im asexuellen, intra-erythrozytären Stadium des Parasiten P. falciparum entwickelt. Das Modell bietet neue Einblicke in bisher unerklärte, experimentelle Beobachtungen und sagt die Wechselwirkungen von Ionentransport-Inhibitoren voraus. Das neu entwickelte Modell der Ionenregulation im Parasiten wurde in ein bereits bestehendes mathematisches Modell der Ionenregulation im Wirtserythrozyten integriert, um ein vorläufiges "kombiniertes Modell" des parasiteninfizierten Erythrozyten als Ganzes zu erstellen. Die Ergebnisse dieses kombinierten Modells wurden mit den Ergebnissen einer begrenzten Anzahl von Experimenten verglichen, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden. In diesen Experimenten wurde die Veränderung der infizierten Erythrozyten nach verschiedenen osmotischen Störungen gemessen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte mathematische Modellierung trägt zum Verständnis der gegenseitigen Abhängigkeiten bei, die bei der Ionenregulierung des Malariaparasiten eine Rolle spielen, und bietet einen Rahmen für das Verständnis der Auswirkungen von "Ionentransport-hemmenden" Malariamitteln. / Malaria is currently responsible for more than 200 million estimated cases and half a million deaths annually, with the majority of cases and deaths attributable to Plasmodium falciparum, one of six strains of malaria parasite able to infect humans. The P. falciparum parasite has developed varying degrees of resistance against most, if not all, of the antimalarial drugs currently available and there is an ongoing need to develop new antimalarial agents. Two compounds, which are currently in clinical trials against malaria target an ’ion pump’ on the surface membrane of the malaria parasite. Ion regulation in the P. falciparum parasite has been the subject of extensive studies over recent decades. This research has led to a general understanding of how the parasite regulates its internal ionic composition. However, there has not yet been any attempt to integrate these findings into a quantitative model. In the work presented in this thesis, I have developed a mathematical model for ion homeostasis in the asexual intra-erythrocytic blood-stage of the P. falciparum parasite. The model provides new insights into formerly unexplained in vitro observations and predicts interactions of ion transport inhibitors. The newly formulated model of ion regulation in the parasite was integrated with a pre-existing mathematical model for ion regulation in the host erythrocyte to generate a preliminary ’combined model’ of the parasite-infected erythrocyte as a whole. Outputs from this combined model were compared to the results from a limited number of experiments conducted in the course of this thesis. These experiments entailed measuring the change of infected erythrocytes following different osmotic perturbations. The mathematical modelling conducted in the course of this work adds to the understanding of the interdependencies involved in malaria parasite ion regulation and provides a framework to help understand the effects of ’ion-transport-inhibiting’ antimalarial agents.

Die Durchführung von Experimenten und das mathematische Modellieren von zellulären Prozessen gehören in der Systembiologie untrennbar zusammen. Das gemeinsame Ziel ist die Aufklärung des Zusammenspiels intrazellulärer Prozesse wie Metabolismus, Genexpression oder Signaltransduktion. Während sich molekularbiologische Untersuchungen mit den molekularen Mechanismen einzelner isolierter Systeme beschäftigen, zielt die Systembiologie auf die Aufklärung der Zusammenhänge ganzer Prozesse und schließlich auch ganzer Zellen ab. Die Verfügbarkeit von umfangreichen Datensätzen und die steigenden Möglichkeiten im Bereich der Computersimulation haben in den letzten Jahren den Weg geebnet, um auch Ganzzellsimulationen nicht mehr unmöglich erscheinen zu lassen. Diese Arbeit stellt das erste eukaryotische Ganzzellmodell der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae vor. Hefe als eukaryotischer Modellorganismus ist hierbei der perfekte Kandidat für die Erstellung eines solchen Modells. Er bietet, als wohl meist erforschter eukaryotischer Einzeller in Verbindung mit der Verfügbarkeit einer großen Menge experimenteller Daten, beste Voraussetzungen zur Erstellung eines solchen Modells. Das Projekt ist hierbei in drei Teile gegliedert: i) Die Erstellung eines modularen Ganzzellmodells das alle zellulären Funktionen wie Zellzyklus, Genexpression, Metabolismus, Transport und Wachstum abbildet. ii) Die Implementation einer spezialisierten Simulationsumgebung in Verbindung mit einer Datenbank, um die Erstellung, Simulation und Parametrisierung von Modulen zu ermöglichen. iii) Die Durchführung von Experimenten, um einen ganzheitlichen Datensatz zu erlangen, der Wachstum, Genexpression und Metabolismus abbildet. Die hier vorgestellte Arbeit liefert nicht nur ein mathematisches Modell, sondern benennt auch die Herausforderungen, die während der Arbeit an einem Ganzzellmodell auftreten und stellt mögliche Lösungsansätze vor. / In systems biology experiments and mathematical modeling are going hand in hand to gain and increase understanding of cellular processes like metabolism, gene expression, or signaling pathways. While molecular biology investigates single isolated parts and molecular mechanisms of cellular processes, systems biology aims at unraveling the whole process and ultimately whole organisms. Today the availability of comprehensive high-throughput data and computational power paved the way to increase the size of analyzed systems to reach the cellular level. This thesis presents the first whole-cell model (WCM) of a eukaryotic cell, the yeast Saccharomyces cerevisiae. This established model organism is the perfect candidate for the implementation of a holistic model based on the available experimental data and the accumulated biological knowledge. The project is split into three parts: i) The creation of a modular functional-complete whole-cell model, combining the processes cell cycle, gene expression, metabolism, transport, and growth. ii) The implementation of a specialized simulation environment and a database to support module creation, simulation, and parameterization. iii) The elicitation of experimental data by conducting an experiment to achieve a comprehensive data set for parameterization, combining growth, metabolic, proteomic, and transcriptomic data. The presented work provides not only a simple mathematical model but also addresses challenges occurring during the development of whole-cell models and names possible solutions and new methodologies required for the creation of WCMs.