Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8279_Tese_Clara Fernanda Barbirato.pdf: 794712 bytes, checksum: 13290894bcf3053215336989ea116592 (MD5) Previous issue date: 2015-02-13 / A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença clínica e geneticamente heterogênea caracterizada, predominantemente, por fragilidade e deformidade ósseas e por fraturas recorrentes. A maioria dos casos de OI resulta de mutações autossômicas dominantes nos genes COL1A1 e COL1A2, que codificam as cadeias formadoras do colágeno tipo I, principal proteína dos ossos. Nos últimos anos, um número crescente de casos decorrentes de mutações recessivas vem sendo relatado em genes associados à biossíntese do colágeno tipo I ou à formação e a mineralização óssea, como os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1. Mutações nesses genes, em geral, levam ao desenvolvimento de fenótipos graves e letais de OI. Neste trabalho, foram analisados os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1 de 25 pacientes com OI utilizando-se as técnicas de SSCP e sequenciamento. Ao todo, 29 variações genéticas foram detectadas, entre mutações e polimorfismos. Das onze variações encontradas no gene LEPRE1, estão a já bem descrita c.1080+1G>T e as mutações potencialmente deletérias c.2024G>A / p.Lys363Glu e c.1501C>T / p.Arg501Trp. No gene FKBP10, foi encontrada a também descrita duplicação c.831dupC, além da c.1546G>A / p.Leu516Phe, predita como causadora da doença. Observou-se que os genes FKBP10 e LEPRE1 contêm as principais mutações encontradas neste trabalho e sugere-se que os mesmos sejam preferencialmente analisados em estudos de triagem e identificação de mutações em OI. Até o momento, não existem relatos de mutações nos genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1 em pacientes brasileiros e este trabalho fornece novas informações sobre os aspectos genéticos da OI recessiva / Osteogenesis Imperfecta (OI) is a clinically and genetically heterogeneous disease predominantly characterized by bone fragility and deformity and recurrent fractures. Most cases of OI result of autosomal dominant mutations in COL1A1 and COL1A2 genes that encode the chains forming type I collagen, the main protein in bones. In the past few years, an increasing number of cases due to recessive mutations has been reported in genes associated with the biosynthesis of type I collagen or to the formation and bone mineralization, such as LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1. Mutations in these genes, in general, lead to the development of severe and lethal OI phenotypes. In this work, LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1 of 25 OI patients were analyzed using SSCP and automated sequencing. Altogether, 29 genetic variations were detected, mutations and polymorphisms. Among the eleven variants found in LEPRE1 gene, there are the already well described c.1080 + 1G> T and the potentially deleterious mutations c.2024G> A / p.Lys363Glu and c.1501C> T / p.Arg501Trp . In FKBP10 gene, the previously described duplication c.831dupC, and c.1546G>A / p.Leu516Phe, predicted to be disease causing, were detected. It was observed that FKBP10 and LEPRE1 contain the most important mutations found in the patients studied in this work and it is suggested that LEPRE1 and FKBP10 should be preferably analyzed in studies of screening and identification of mutations in patients with OI. To date, there are no reports of mutations in LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1 genes in Brazilian patients and this study provides new information on the genetic aspects of recessive OI.

Submitted by Edileide Reis (leyde-landy@hotmail.com) on 2015-04-14T22:15:24Z No. of bitstreams: 1 ANDRÉA DO REGO BORGES.pdf: 667290 bytes, checksum: cb33bf70ccc69c3f3aec1378b4bdea72 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T22:15:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANDRÉA DO REGO BORGES.pdf: 667290 bytes, checksum: cb33bf70ccc69c3f3aec1378b4bdea72 (MD5) Previous issue date: 2013 / As fendas labiais, labiopalatinas e palatinas são anomalias craniofaciais resultantes de defeitos na fusão dos processos craniofaciais. Estas alterações apresentam uma incidência variada e são mais comuns na forma não sindrômica. Este manuscrito tem como objetivo a realização de uma revisão da literatura sobre as fendas labiais e/ou palatinas não sindrômicas, com ênfase nos aspectos genéticos. Efetuou-se uma busca de artigos em bases de dados computadorizadas, como Medline, Lilacs e Pub Med. A seleção inicial de estudos potenciais foi determinada pela leitura dos títulos e resumos de cada artigo identificado. A seleção final dos artigos foi realizada pelos autores depois da obtenção e leitura dos artigos completos. Segundo a análise crítica dos artigos selecionados, observou-se que diversos genes e regiões cromossômicas foram associados às fendas orofaciais em estudos de larga associação genômica, a exemplo do IRF6, ABCA4, MAFB e região 8q24. Verificou-se que a etiologia das fissuras é multifatorial, com envolvimento de fatores ambientais e genéticos. Observou-se também forte interferência de fatores étnicos, principalmente em estudos do tipo caso-controle. Alguns polimorfismos identificados em estudos GWAS foram replicados e associados à população brasileira de fissurados, a exemplo dos polimorfismos rs987525, rs1530300 e rs560426. A etiologia das FL/PNS é multifatorial com forte interferência de fatores étnicos, por isso ultimamente, o estudo da ancestralidade genômica tem sido incorporado às pesquisas que associam os polimorfismos genéticos às fissuras.

Submitted by Edileide Reis (leyde-landy@hotmail.com) on 2015-04-15T03:10:02Z No. of bitstreams: 1 RYUICHI HOSHI.pdf: 684684 bytes, checksum: 947371a610bea4cbbb9b14a9b8961cb1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T03:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RYUICHI HOSHI.pdf: 684684 bytes, checksum: 947371a610bea4cbbb9b14a9b8961cb1 (MD5) Previous issue date: 2013 / As fissuras lábio palatinas não sindrômicas (FL/PNS) são defeitos congênitos orofaciais comuns, de etiologia multifatorial com participação de fatores genéticos e nutricionais. A presença de polimorfismos genéticos em enzimas que metabolizam o ácido fólico e o uso suplementar desta vitamina na prevenção das fissuras ainda não foi bem esclarecida pela literatura. Este trabalho teve como objetivo realizar uma revisão da literatura sobre o papel do ácido fólico e de polimorfismos em genes relacionados à rota metabólica do ácido fólico na ocorrência de FL/PNS. Foi realizada uma pesquisa bibliográfica de caráter exploratória e qualitativa visando à busca de material teórico que abordasse dados relativos sobre estes temas. De acordo com as pesquisas analisadas na literatura, não foi observado consenso em relação ao efeito protetor do ácido fólico na prevenção de FL/PNS quando utilizado de forma suplementar no período periconcepcional. Já as pesquisas que avaliaram defeitos em genes relacionados ao metabolismo do ácido fólico, encontraram associação de alguns polimorfismos com as FL/PNS. No entanto, em algumas populações esta associação não foi evidenciada.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2014-12-10T18:32:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação.FernandaZaidan.pdf: 1993203 bytes, checksum: f121a5630a788106b0700f04818f9194 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2014-12-11T18:33:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação.FernandaZaidan.pdf: 1993203 bytes, checksum: f121a5630a788106b0700f04818f9194 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-11T18:33:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação.FernandaZaidan.pdf: 1993203 bytes, checksum: f121a5630a788106b0700f04818f9194 (MD5) Previous issue date: 2014 / Animais híbridos representam um desafio à taxonomia e sistemática, pois correspondem a unidades evolutivas geralmente sem clara delimitação morfológica, comportamental e genética. Híbridos podem ser morfologicamente intermediários aos parentais ou, devido à introgressão e retrocruzamentos, suas características podem se misturar tornando difícil sua identificação. Uma das formas de identificação de híbridos é por meio de ferramentas de biologia molecular, que ao utilizarem marcadores de DNA mitocondrial (herança exclusiva materna) e DNA nuclear (herança materna e paterna), permitem a comparação entre informações genéticas. Além da hibridização existem outras fontes de conflito entre dados moleculares provenientes do DNA mitocondrial e DNA nuclear, como por exemplo a retenção de polimorfismos ancentrais. Em localidades do Espírito Santo, Brasil, foram coletados indivíduos de morfologia distinta de Trachycephalus mesophaeus e T. nigromaculatus, que são as únicas espécies do gênero conhecidas nesse estado. Porém, estudos piloto usando o gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI) agruparam esses espécimes com amostras de T. typhonius. Devido a estas incongruências, foram sequenciados fragmentos de dois genes mitocondriais - COI e Nicotinamida Desidrogenase subunidade 2 (ND2) e um exon nuclear (tirosinase) de 173 indivíduos de Trachycephalus, de forma a esclarecer as identificações taxonômicas e investigar a correspondência entre caracteres morfológicos e genéticos nesta linhagem, na sua área de ocorrência As filogenias moleculares, divergências genéticas, redes de haplótipos e polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) confirmaram as três espécies acima mencionadas como linhagens evolutivas distintas e revelaram mais sete indivíduos potencialmente híbridos, mas morfologicamente assinalados a T. mesophaeus, T. nigromaculatus ou T. typhonius.. Devido à taxa de evolução lenta da tirosinase, as espécies mais recentes T. typhonius e T. nigromaculatus parecem não terem sido sorteadas completamente nesse gene. Já T. mesophaeus, que é a espécie mais antiga das três, foi recuperada inequivocamente em todas as análises. De forma inédita, as análises moleculares evidenciaram a ocorrência de introgressão bidirecional entre T. nigromaculatus e T. typhonius e entre T. nigromaculatus e T. mesophaeus, sendo que há indícios de indivíduos F1 (cruzamentos entre espécies parentais puras gerando híbridos). A utilização do gene ND2 mostrou-se mais eficiente do que o gene COI nas filogenias e, apesar da tirosinase ser um gene nuclear de evolução lenta, contribuiu para a identificação de incongruências citonucleares. Nossos resultados mostram que a história filogenética de Trachycephalus é complexa e que o uso de marcadores nucleares de evolução mais rápida e ampliação dessas análises para outras espécies do gênero podem revelar mais eventos de hibridização. / Hybrids are evolutionary units generally without clear morphological, behavioral and genetic delimitation, thus representing a challenge to taxonomy and systematics. They can morphologically resemble their parents or, due to introgression, their characteristics can be diluted with a prevailing appearance of one of the parental species, which could hinder identification. One way to identify hybrids is through molecular biology tools, such as mitochondrial DNA (maternal inherintance exclusively) and nuclear DNA (maternal and paternal inheritance), allowing genetic comparisons. Besides hybridization, conflicting mtDNA and nDNA identifications may have other explanations, such as Incomplete Lineage Sorting. Some individuals collected in localities of Espírito Santo State, Brazil, presented a mix of morphological characters of T. mesophaeus and T. nigromaculatus, which are the only Trachycephalus species known to the region. However, previous studies using COI sequences grouped theses individuals as T. typhonius. Giving this, we sequenced fragments of two mitochondrial genes (COI and ND2) and part of the nuclear exon of tyrosinase of 173 individuals of Trachycephalus, in order to better clarify the taxonomic uncertainty, and the link between morphological and genetic characters behind the identifications, according to the occurrence area. Results of molecular phylogenies, genetic divergences, haplotype networks, and single nucleotide polymorphisms (SNPs) confirmed .T. mesophaeus, T. nigromaculatus, and T. typhonius as distinct evolutionary lineages and revealed seven more individuals potentially hybrids, but morphologically assigned to one species. Due to the slow mutation rate of tyrosinase, the most recently diverged species (T. typhonius and T. nigromaculatus) have not completely sorted in this gene. Trachycephalus mesophaeus is the oldest species of the three, and it was identified unambiguously in all analysis. Here, for the first time, evidence of bidirectional introgression between T. nigromaculatus and T. typhonius and between T. nigromaculatus and T. mesophaeus, with signs of F1 individuals, is presented. The use of ND2 gene seems to be more efficient than COI to recover the phylogenies in this particular group and, although tyrosinase is a slow evolving gene, it contributed significantly in order to identify cytonuclear incongruences. Our results indicate a complex phylogenetic history of Trachycephalus, and that more introgressive hybrids may be identified with the use of faster nuclear markers and the inclusion of more species of the genus in the analyses..

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:31:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317602.pdf: 1408354 bytes, checksum: 08ca2a83f4296c2d65317ae7c592c2c2 (MD5) Previous issue date: 2013 / A baixa solubilidade de fármacos apresenta-se como um dos aspectos mais desafiadores no desenvolvimento de novas formulações. O nimodipino é um bloqueador de canais de cálcio utilizado para o tratamento da hipertensão arterial e distúrbios neurológicos que apresenta reduzidas solubilidade aquosa e biodisponibilidade. Como um fator agravante, o fármaco apresenta duas formas cristalinas: um racemato metaestável (Mod I) e um conglomerado menos solúvel (Mod II). Nesse sentido, visando contornar as limitações biofarmacêuticas do nimodipino, a obtenção de dispersões sólidas foi proposta. As dispersões sólidas de nimodipino foram divididas em dois grupos, sendo o primeiro (Grupo A) constituído por nove formulações com diferentes proporções de fármaco:PVP K-30 (1:9, 2:8, 3:7, m/m) e obtidas pelas técnicas de moagem em moinho de bolas (M1, M2, M3), evaporação de solvente em spray dryer (S1, S2 e S3) e tecnologia de fluido supercrítico (F1, F2 e F3). A técnica mais adequada foi selecionada para obtenção das dispersões sólidas do segundo grupo (Grupo B), as quais foram compostas pelos carreadores PVP/VA S-630® (VA1, VA2, VA3), Eudragit EPO® (E1, E2, E3) e HPMC (H1, H2, H3), nas mesmas proporções acima mencionadas. Previamente ao desenvolvimento das formulações, estudos de pré-formulação confirmaram a presença de misturas de polimorfos em matérias-primas de nimodipino, sendo seu teor determinado através de um método quantitativo por calorimetria exploratória diferencial. O impacto do polimorfismo no efeito hipotensor do fármaco foi investigado e observou-se atividade significativamente reduzida para Mod II em 30 minutos, correspondente ao tempo de concentração plasmática máxima do fármaco. Ainda, a estabilidade química do nimodipino foi investigada através de degradações forçadas, sendo verificada, através de método indicativo de estabilidade por cromatografia líquida de alta eficiência, a instabilidade do fármaco frente à fotólise e à hidrólise. Para as dispersões sólidas compostas por PVP K-30, observou-se amorfização da maioria das formulações, associada à presença de ligações de hidrogênio estabelecidas entre fármaco e carreador. Entretanto, apenas F2 e F3 apresentaram características semicristalinas, bem como a presença do polimorfo menos solúvel Mod II. Os melhores resultados do Grupo A foram observados para F1, a qual foi capaz de aumentar em até 1300 % a solubilidade do nimodipino, além de promover 100 % de liberação do fármaco em apenas 5 minutos em ensaio de dissolução in vitro. A rápida amorfização do fármaco, associada à facilidade de escalonamento e à ausência da utilização de solventes orgânicos foram determinantes na escolha da técnica de moagem em moinho de bolas para obtenção das dispersões sólidas do Grupo B. Com relação a estas formulações, todas se apresentaram amorfas, porém sem interações químicas entre o nimodipino e os carreadores. Ainda, todas foram capazes de aprimorar as propriedades biofarmacêuticas do fármaco, com aumento da solubilidade do mesmo na faixa de 103 a 1100 %. No ensaio de dissolução in vitro o melhor resultado foi atribuído a VA 1, sendo esta formulação capaz de liberar 100 % de fármaco em até 10 minutos. Devido aos bons resultados obtidos em seus respectivos grupos, F1 e VA1 foram submetidas aos estudos in vivo, apresentando efeito hipotensor pronunciado durante todo o experimento e mínimas alterações da pressão arterial mesmo quando da administração de fenilefrina. Resultados in vivo muito expressivos para F1 foram determinantes na escolha desta como a melhor de todas as formulações obtidas. Ao final, as dispersões sólidas foram submetidas a estudos de estabilidade em dessecador por 90 dias, mantendo-se estáveis química e fisicamente durante todo o tempo analisado. Por outro lado, as formulações H1, H2 e H3, quando submetidas a 40 °C e 75 % de umidade relativa, apresentaram degradação química e recristalização a partir de 30 dias para H2 e H3. Cabe mencionar que todas as formulações apresentaram resultados promissores e inéditos relacionados ao aprimoramento das propriedades biofarmacêuticas do nimodipino, tornando-se sistemas viáveis no tratamento da hipertensão arterial.<br> / Abstract : The solubility of drugs molecules remains one of the most challenging aspects in formulation development. Nimodipine is a calcium channel blocker used for the treatment of hypertension and neurological disorders, which shows poor solubility in water and bioavailability. As an aggravating factor, the drug presents two crystalline phases: a metastable racemate (Mod I) and a less soluble conglomerate (Mod II). In this way, aiming at improving the biopharmaceutical limitations of nimodipine, the obtainment of solid dispersions was proposed. Nimodipine solid dispersions were divided in two groups, the first (Group A) being constituted by nine formulations with different ratios of drug:PVP K-30 (1:9, 2:8, 3:7, m/m), and obtained through ball milling (M1, M2, M3), spray drying (S1, S2, S3) and supercritical fluid technology (F1, F2, F3). The most appropriate technique was selected to obtain the solid dispersions of the second group (Group B), which were composed of the carriers PVP/VA S-630® (VA1, VA2, VA3), Eudragit EPO® (E1, E2, E3) and HPMC (H1, H2, H3), in the same proportions mentioned above. Previously to the development of the formulations, pre-formulation studies confirmed the presence of polymorphic mixtures in nimodipine raw materials, being your content determined through differential scanning calorimetry. The impact of the polymorphism in the hypotensive effect of the drug was investigated and significative lower activity was observed for Mod II, at 30 minutes, which corresponds to the time of nimodipine peak plasma concentration. Also, the chemical stability of nimodipine was investigated through stress conditions, being evidenced, through a stability-indicating high performance liquid chromatography method, the instability of the drug against photolysis and hydrolysis. For solid dispersions composed of PVP K-30, it was observed amorphization for most of formulations, associated with the presence of hydrogen bonds established between drug and carrier. However, only F2 and F3 presented semi-crystalline characteristics, as well as the presence of the less soluble polymorph, Mod II. The best results for Group A were observed for F1, which was able to enhance at up 1300 % the solubility of nimodipine, besides promoting the release of 100 % of the drug within 5 minutes in dissolution studies. The fast amorphization of the drug, associated to the easy scalling up and the absence of organic solvents were decisive in the choice of ball milling as the technique for the obtainment of the Group B solid dispersions. With respect to these formulations, they all showed amorphous, however, without chemical bonds between drug and carriers. Also, all of them were able to enhance the biopharmaceutical properties of the drug, with increases in the solubility of nimodipine ranging from 103 to 1100 %. In the in vitro dissolution assay, the best result was attributed to VA1, which released 100 % of the drug within 10 minutes. Due to the good results obtained, F1 and VA1 were submitted to in vivo studies, presenting pronounced hypotensive effect during all the experiment long and minimum changes in the blood pressure even against the administration of phenylephrine. Very remarkable results at in vivo assay for F1 were decisive in the choice of this formulation as the best one among all of the solid dispersions obtained. Finally, the solid dispersions were submitted to stability studies at a dessicator during 90 days, keeping themselves chemical and physically stable during the period of analysis. On the other hand, formulations H1, H2 and H3, when submitted to 40 °C and 75 % of relative humidity, presented chemical degradation and recrystallization from 30 days, for H2 and H3. It is worth mentioning that all the formulations developed presented promising and unpublished results related to the enhancement of nimodipine biopharmaceutical properties, becoming useful systems for the treatment of hypertension.

A fibrose cística (FC) é a doença autossômica recessiva mais comum em euro-descendentes, com uma incidência estimada de 1 caso a cada 2.500 nascimentos. A FC é uma doença multissistêmica, caracterizada principalmente por doença pulmonar progressiva, disfunção pancreática exócrina e concentração elevada de eletrólitos no suor. O gene associado a essa doença é denominado CFTR e se localiza no cromossomo 7, sendo dividido em 27 éxons. Até o momento, mais de 1.600 variações de sequência foram identificadas no gene CFTR, sendo que a mutação F508del é a mais frequente entre os pacientes de FC. No Brasil, a frequência da F508del não é tão elevada, devido provavelmente à miscigenação e, consequentemente, o locus CFTR apresenta maior heterogeneidade alélica. Este fato dificulta o diagnóstico molecular dos pacientes com FC e metodologias de varredura para a detecção de mutações precisam ser utilizadas. O objetivo deste trabalho foi identificar alterações em regiões codificantes do gene CFTR em pacientes com FC provenientes da região sul do Brasil, através de análise de dissociação em alta resolução (HRM) e sequenciamento de DNA. Onze éxons e regiões adjacentes foram analisados por HRM e 10 alterações de sequência diferentes foram detectadas (R75Q, R334W, F508del, 1717-1G>A, G542X, R553X, 1812-1G>A, A561E, G576A e N1303K). Além disso, uma alteração denominada L453X, ainda não descrita na literatura, foi identificada em um paciente de FC através do sequenciamento do éxon 9 do CFTR. A região polimórfica (TG)nTm presente no íntron 8 foi caracterizada e nenhum paciente apresentou a variante alélica contendo 5T. Através da estratégia utilizada, 30 dos 52 alelos mutantes (57,7%) nos 26 pacientes incluídos nesse estudo foram identificados. O genótipo de 7 (26,9%) pacientes foi definido e alteração em um dos alelos mutantes foi identificada em 16 (61,6%) pacientes. Portanto, a aplicação do método HRM foi eficaz para identificação de variações de sequência em regiões do gene CFTR na amostra estudada. O método pode ser expandido para análise de toda a região codificante desse gene e, posteriormente, ser usado como metodologia de escolha para diagnóstico molecular de pacientes com suspeita clínica de FC, seja em casos sintomáticos como em programas de triagem neonatal. / Cystic fibrosis (CF) is the most common autosomal recessive disease in euro-descendents with an estimated incidence in 1 case in each 2,500 live births. CF is a multisystem disease, characterized mainly by progressive obstructive pulmonary disease, pancreatic insufficiency, and high electrolytes levels of electrolytes in sweat. The gene responsible for CF, named CFTR, is located on chromosome 7 and is organized into 27 exons. Up to date, more than 1,600 sequence variations have been reported in CFTR, and the F508del mutation is the most frequent worldwide. In Brazil, F508del frequency is lower than in other countries probably due to population admixture. This indicates that CFTR locus can be more heterogeneous. Therefore, CF molecular diagnosis can be very hard and new methods for mutation scanning would be useful to improve this task. The aim of this work was to identify allelic variants in CFTR coding regions of CF patients from South Brazil through high-resolution melting (HRM) analysis and DNA sequencing. Eleven exons and adjacent regions were analyzed by HRM, and 10 different sequence variants were identified (R75Q, R334W, F508del, 1717-1G>A, G542X, R553X, 1812-1G>A, A561E, G576A and N1303K). A novel variant (L453X) was detected in CFTR gene through exon 9 DNA sequencing, besides these known mutations. The polyvariant (TG)nTm region at intron 8 was also analyzed and 5T allelic variant was not present in any allele. The strategy described above was able to identify 30 out of 52 CF mutant alleles (57.7%) in 26 patients. Genotype of 7 (26.9%) patients was defined and mutation in one mutant allele was identified in 16 (61.6%) patients. Therefore, application of HRM analysis was efficient to detect sequence variations in specific regions of CFTR gene in this sample population. The methodology can be expanded to cover the whole coding region of this gene. Subsequently, this methodology can be adapted to be applied in the molecular diagnosis of symptomatic CF cases as well as samples from neonatal screening programs.

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-24. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:25:13Z : No. of bitstreams: 1 000854529.pdf: 5405260 bytes, checksum: f6abe18b4e8c7bab484b7a3c27f852c6 (MD5) / A técnica de difração de raios X por policristais (DRXP) é excelente para obter informações sobre o estado sólido cristalino em insumos farmacêuticos ativos (princípios ativos) e inativos (excipientes). Tendo em vista que estes insumos podem apresentar o fenômeno do polimorfismo, esta técnica é eficiente para a diferenciação entre as diferentes formas polimórficas. Além do problema de polimorfismo, também podem ocorrer mudanças na cristalinidade, dimensões e forma dos cristalitos (características físicas), as quais devem ser mantidas com as mesmas características das que foram usadas durante o desenvolvimento e registro do medicamento, pois esses fatores podem alterar a biodisponibilidade do fármaco. Para a análise adequada destes insumos sólidos, alguns métodos fazendo uso dos dados de DRXP são recomendados: o método de Rietveld (MR), método de Le Bail (MLB), método de Pawley (MP) e o método de PONKCS (Partial Or No Known Crystal Structure) que é baseado no MR. O MR pode ser adequadamente aplicado na caracterização e quantificação das formas cristalinas presentes em materiais policristalinos, embora ele seja limitado aos casos onde a estrutura cristalina seja conhecida. Porém, para muitos insumos a literatura ainda dispõe de pouca informação cristalográfica e para os casos em que a estrutura cristalina não seja conhecida ou seja parcialmente conhecida, o método PONKCS pode ser aplicado, conforme mostrado no caso do excipiente lactose monoidratada presente no anti-hipertensivo hidroclorotiazida, tendo sido encontrado de 70,0% lactose e 29,9% de hidroclorotiazida e do estearato de magnésio, presente em 1,4% em massa no comprimido de atenolol. Os métodos de Le Bail e de Pawley são utilizados para a decomposição do padrão e para identificação dos picos em fases com estruturas parcialmente conhecidas, porém não podem ser utilizados para a quantificação... / The x-ray powder diffraction (XPPD) is an excellent technique to obtain information about the crystal solid state on active pharmaceuticals ingredients (active ingredient) and inactive (excipients). Knowing that these ingredients can exhibit the phenomenon of polymorphism, this technique is efficient to differentiate among polymorphic forms. Beyond the problem of polymorphism, also, can occur changes in the crystallinity, dimensions and crystallites forms (physical characteristics), that must be maintained as the same characteristics that were used during the development and registration of medicament, because this factors can affect the farmaco bioavailability. To adequate analysis of these solids ingredients, some methods using DRXP data are recommended: Rietveld method (RM), Le Bail method (MLB), Pawley Method (PM) and the PONKCS method (Partial Or No Known Crystal Structure) which is based on RM. The RM can be adequately applied on characterization and quantification of crystal forms in polycrystalline materials, although the crystalline structure is necessary in this method. However, for many of these ingredients, there are few crystallographic information about, and for the cases that the crystal structure are unknown or partially known, the PONKCS method can be applied. As showed in the case of the excipient α-lactose monohydrate, present in the antihypertensive hydrochlorothiazide, and quantified 70.03wt% of lactose and 29.97wt% of hydrochlorothiazide, and in the case of the magnesium stearate, quantified in 1.4wt% on atenolol tablet. The PONKCS and Le Bail methods are used for profile fitting, and for identification of peaks in partially known crystal phases, but not used for quantification. The LBM and PM were used for profile fitting in the cases that the PONKCS method were applied, and in atenolol tests. The present work aimed identify and characterize excipients and pharmacos...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-25Bitstream added on 2014-06-13T20:54:06Z : No. of bitstreams: 1 zetouni_l_me_jabo.pdf: 337751 bytes, checksum: b21af7c1ec9b43b60d9345d076668d73 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O gene responsável pela codificação do hormônio leptina tem sido associado à produção de leite, e diversos polimorfismos encontrados nesse gene foram associados a características produtivas em bovinos. O objetivo do presente estudo foi a identificação do polimorfismo LEP-1620 (A/G) no gene bubalino da leptina e suas possíveis associações com as produções de leite, gordura, proteína e porcentagens de gordura e proteína. Foram coletadas amostras de pelo da cauda de 200 búfalas, e após a extração do DNA as amostras foram genotipadas pela técnica PCR-RFLP. Três amostras foram sequenciadas e foi encontrado um SNP na posição 70 do íntron 2 do gene da leptina, caracterizado pela substituição de um A por um G. As médias das produções mensais de leite, gordura, proteína e as porcentagens de gordura e proteína foram avaliadas em um modelo misto. Os genótipos encontrados (AA, AG, GG) foram positivamente associados às características porcentagem de gordura e de proteína (p<0,05), sendo que os animais AA apresentaram médias superiores para as características. As curvas de lactação para as características produção de leite e porcentagens de gordura e proteína apresentaram trajetórias semelhantes para os três genótipos. Esses resultados indicam que o polimorfismo LEP-1620 (A/G) pode ser utilizado futuramente como marcador molecular para as características porcentagem de gordura e proteína do leite de búfalas / The gene responsible for encoding the hormone leptin has been associated with milk production, and several polymorphisms of this gene were associated with production traits in cattle. The aim of the present study was to identify the LEP-1620 (A/G) polymorphism in the buffalo leptin gene and its possible associations with milk, fat and protein yield, and fat and protein percentages. Samples of tail hair from 200 buffalo cows were collected, and after DNA extraction the samples were genotyped by PCR-RFLP. Three samples were sequenced and an SNP was found at position 70 of intron 2 in the leptin gene, characterized by the substitution of an A for a G. The means from monthly milk, fat and protein yield and falt and protein percentages were evaluated by a mixed model. The genotypes found (AA, AG, GG) were positively associated with fat and protein percentages (p<0,005), and the AA animals showed the highest means for this traits. The lactation curves for milk yield and fat and protein percentages showed similar trajectories for the three genotypes. These results indicate that the LEP-1620 (A/G) polymorphism can be used in the future as a molecular marker for fat and protein percentages traits of buffalo cow’s milk

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-30Bitstream added on 2014-06-13T19:41:20Z : No. of bitstreams: 1 peresi_e_dr_botfm.pdf: 1052630 bytes, checksum: e59a57f6f635bf2f461011c84b7d7f71 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / It is estimated that one-third of the total world population is latently infected with M. tuberculosis and only 5-10% of the infected individuals will develop active TB disease during their life-time. The reason why some infected individuals develop active disease, while others do not is not yet entirely understood. Given the central role of TLR-2 in the incitement of inflammation, polymorphisms in its gene might be involved in both infectious and inflammatory diseases. The aim of this study was to evaluate the influence of TLR2 - 16934A/T and GT repeat polymorphisms on the immune response of PTB patients undergoing anti-TB treatment at different time points of anti-tuberculosis treatment: T1 (beginning), T2 (3 months) and T3 (end). For this we genotyped TLR2 -16934 and (GT)n repeats polymorphisms and evaluated the immune response of pulmonary tuberculosis patients during the time of anti-tuberculosis treatment. The present study suggests that TLR2 - 16934A/T and GT repeats polymorphisms can influence differential TLR-2, NF-κB and cytokine levels during anti-TB treatment. We also suggest that PTB patients with TLR2 - 16934 AA genotype may have a worst outcome of the disease, since they have a lower IFN-γ, cytokine essential to initiate the protective immunity to active TB. This association could not be made in our study due to the low number of patients evaluated. Since TLR-2 play a major role in initiating immune response against M. tuberculosis other polymorphisms in TLR2 would be crucial to better understand protective immune responses and may serve as biomarkers of protection or susceptibility to TB

Orientadora : Profª Drª Maria da Graça Bicalho / Coorientadora : Profª Drª Sueli Borrelli / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/08/2017 / Inclui referências : f.168-186 / Resumo: O rim é o órgão mais frequentemente transplantado no mundo. O transplante renal está associado a melhorias significativas na qualidade de vida e na longevidade de pacientes com falência irreversível desse órgão. Mesmo havendo histocompatibilidade HLA entre paciente e doador, terapia com imunossupressores é ainda necessária para minimizar os efeitos de anticorpos que teriam como alvo imune antígenos de histocompatibilidade secundários (MiHAs) presentes no órgão transplantado e que poderiam desencadear a rejeição e perda de enxerto. Pouco se conhece sobre o papel destes antígenos MiHAS, especialmente a molécula MICA, como indutor e alvo de resposta imune. Portanto, foi realizado uma revisão sobre o papel de MICA e anticorpos anti-MICA no transplante renal. A continuidade deste estudo se deu com a investigação de MICA e HLA-G, ambas moléculas com função imunomoduladora antagônica na resposta imune. MICA tem sido considerado como um MiHAs e potencial alvo de resposta imune mediada por anticorpos, enquanto HLA-G é descrito como um inibidor da resposta imune. Genótipos MICA, NKG2D e HLA-G de pacientes transplantados foram avaliados. Nosso estudo teve como principal objetivo desenvolver um Modelo de Pontuação de Risco (MPR) para avaliar pacientes que apresentam um risco maior ou menor de desenvolver a disfunção de aloenxerto renal. Outros objetivos foram: avaliar a relevância de genótipos e fenótipos de MICA (sMICA) e HLA-G (sHLA-G) para o prognóstico dos pacientes transplantados e comparar os níveis solúveis de sHLA-G e sMICA entre os grupos de pacientes transplantados (n=67), pacientes renais crônicos (n=32) e controles saudáveis (n=79). As amostras sanguíneas para análise de plasma foram coletadas no pré-transplante e até três meses após o transplante renal. Utilizou-se a técnica ELISA para avaliação dos níveis plasmáticos de sMICA e sHLA-G. As genotipagens de MICA, NKG2D e HLA-G foram realizadas por PCR-SSOP, RT-PCR e SBT, respetivamente. Esses resultados foram relacionados com 40 variáveis clínicas obtidas dos pacientes transplantados. Dos pacientes renais crônicos e controles saudáveis foram avaliados os genótipos e os níveis de sHLA-G e sMICA, os quais foram comparados com aqueles dos pacientes transplantados. Na construção do MPR estruturado a partir de todas as variáveis não invasivas (demográficas, clínicas, genéticas), aquelas que se mostraram mais fortemente associadas ao risco de disfunção do aloenxerto renal foram: presença de anticorpos HLA doador específico (DSAs), transplantes e transfusões sanguíneas precedentes ao transplante monitorado, abortos prévios, uso de ATG em terapia de indução, gênero masculino e idade dos doadores superior à 55 anos. Interessantemente, na criação do MPR os genótipos MICA e HLA-G não se mostraram como variáveis relevantes para o aprimoramento do modelo. No entanto, o papel antagônico anteriormente hipotetizado, entre MICA e HLA-G foi evidenciado quando genótipos portadores do alelo MICA A5.1 mostraram-se associados a fenótipos alto produtores de sMICA e baixa de sHLAG, enquanto aqueles genótipos portadores de HLA-G*01:04P mostraram- se associados com a alta produção de sHLA-G e baixa de sMICA. Estes achados demonstram a presença de potenciais genótipos-fenótipos MICA-HLA-G característicos a serem encontrados em pacientes com maior ou menor risco imunológico em desenvolver rejeição. Palavras chaves: MICA. HLA-G. NKG2D. transplante renal. / Abstract: The kidney is the most frequently transplanted organ in the world, and this treatment is associated to significant improvements in the quality of life and longevity of patients with end-stage renal disease. Even when there's HLA histocompatibility between patient and donor, a standard immunosuppressive therapy is still needed to reduce the antibody effects that target the MiHAs (minor histocompatibility antigens) present in the transplanted organ, which could be responsible for rejection. Very little is known on MiHAs' function, especially in regards to the MICA molecule. This is the reason why a review on MICA and anti-MICA antibodies in renal transplant was written. This review led to a further research to better understand MICA and HLA-G's roles, two molecules with an antagonist immunoregulatory function. From literature it emerged that MICA has been treated as a MiHA and as a possible target of an antibody-mediated immune response. Meanwhile, HLA-G has been described as an inhibitor of the immune response. In our research, MICA, NKG2D and HLA-G genotypes of kidney transplant patients were taken into account. The target of our study was to find a Risk Score Model (RSM) to evaluate patients exhibiting higher or lower risk for allograft dysfunction development. Other focus points of our study were: to investigate the role of MICA (sMICA) and HLA-G (SHLA-G) genotypes and phenotypes in the prognosis of kidney transplanted patients and compare the levels of soluble HLAG and soluble MICA between groups of transplanted patients (n=67), chronic renal patients (n=32) and control group (n=79). Plasma samples were collected in the time that went from before transplant up to 3 months after transplant. Soluble HLA-G and MICA levels were detected by ELISA, while MICA, NKG2D and HLA-G genotyping was performed by PCR-SSOP, RT-PCR and SBT, respectively. Chronic renal disease patients and controls were evaluated for sHLA-G and sMICA plasma levels, comparing them with those of transplanted patients. The Risk Score Model is composed of 40 non-invasive variables (demographic, clinical, treatment, genetic) obtained from transplanted patients. The ones which showed to be more strictly correlated to the risk of malfunctions of the transplanted organ were: total donor-specific antibodies (DSA), DSA positive against selected donors, previous transplant, previous blood transfusion and previous abortion, use of ATG in induction therapy, male gender and donors' age higher than 50 years. It's noteworthy that, during the creation of the RSM, MICA and HLA-G genotypes didn't appear to be especially relevant variables for the model. Nevertheless, the antagonistic role of MICA and HLA-G has resulted in the association of MICA-A5.1 genotypes with high production of soluble MICA and a low one of soluble HLA-G, while the HLA-G*01:04P genotype was connected with a high production of sHLA-G and a low one of sMICA. These results prove the presence of potentially characteristic MICA-HLA genotypes/phenotypes, which can be found in patients with higher/lower risk of rejection. Keywords: MICA. HLA-G. NKG2D. Kidney transplant.