Orientador: Jose Francisco Figueiredo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:40:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bertels_IvoneMedeirosVieira_D.pdf: 6733194 bytes, checksum: c8a7c3bcca8ad5732334627b49957dcc (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: A qualidade da conservação obtida em um órgão e a duração do armazenamento seguro são dependentes do tipo de solução e tempo de conservação, estando sujeitas a intercorrências imprevisíveis. Em virtude disso, o parênquima renal e, particularmente, o túbulo contornado proximal (TCP), local onde ocorre necrose tubular aguda (NTA), são susceptíveis às mudanças na homeostase funcional do órgão, durante a conservação e durante a reperfusão pós-implante. O TCP reabsorve cerca de 70% de Na+ e H2O filtrados; sua membrana apical tem células especializadas com microvilosidades para aumentar a área de transporte unidirecional de solutos do lúmen para o sangue. O principal componente estrutural da bordadura em escova, filamentos de F-actina, interage com uma variedade de proteínas transmembranas, inclusive moléculas transportadoras de íons. Esta função é regulada por parâmetros fisiológicos e hormonais, sendo a Angiotensina II (AII) uma das principais envolvidas com o citoesqueleto de actina e proteínas associadas, mediada principalmente por seus receptores AT1. Métodos: Neste trabalho, túbulos isolados de fragmentos frescos e de fragmentos conservados por períodos de 1 e 24h nas soluções de Euro - Collins (ECO) e de Belzer (UW) foram tratados com AII, losartan e AII+losartan, para medida do volume de absorção de fluido (Jv=nl. min_1. mm-1 (microperfusão in vitro), e medida da intensidade (média) de pixel da fluorescência dos receptores AT1 e do citoesqueleto de actina (imunoistoquímica). Resultados: a) Demonstrou-se que AII (10-12M) estimula absorção fluida (Jv), que é diminuída com losartan (10-6M) em TCP frescos e também em TCP conservados em soluções de ECO 1h e UW 1-24h. Em túbulos conservados 24h em ECO, não houve absorção de fluidos. b) A média da intensidade de pixel de fluorescência dos receptores AT1 em túbulos frescos (sem conservação) apresentou discreta variação entre os grupos não estatisticamente significante. Em túbulos conservados 1h com ECO e UW, a média da intensidade de pixel de receptores AT1 estava aumentada no grupo sem drogas, quando comparados aos tratados com AII, losartan e AII+losartan. Entretanto, em túbulos conservados 24h, ambas as soluções, houve aumento na média de intensidade do pixel de receptores AT1, no grupo tratado com AII, quando comparados aos demais grupos. c) O citoesqueleto de actina em túbulos frescos (sem conservação) não mostrou variação estatisticamente significante na média de intensidade de pixel entre os grupos (AII, losartan ou AII+losartan). No entanto, verificamos uma maior coesão entre os filamentos de actina de túbulos tratados com AII. A distribuição dos filamentos de actina em túbulos conservados em ECO 1h e UW 1 e 24h, mostrou-se uniforme, sem diferenças entre os grupos. Entretanto, em túbulos conservados em ECO 24h (tratamentos AII, losartan, AII+losartan) foi verificada alteração do citoesqueleto de actina. Conclusão: Baseados nestes dados, verificamos que, na conservação do TCP realizada por tempo reduzido, as diferenças na composição das soluções escolhidas não acarretaram alterações estatisticamente significantes na capacidade de absorção de fluidos, na distribuição dos receptores AT1 e no citoesqueleto de actina. Porém, quando o tempo de conservação é estendido, a composição da solução utilizada no processo, interfere na qualidade da conservação, acarretando alterações no citoesqueleto de actina, determinando alterações que poderiam implicar em mudanças na função absortiva, sendo que a solução de UW mostrou o melhor desempenho nestas condições experimentais / Abstract: Introduction: Depending on the preservation quality and duration, considering the solution composition and the preservation method, unexpected intercurrences may occur. In consequence, the renal parenchyma and particularly the proximal convoluted tubule (PCT), site where the acute tubular necrosis (NTA) occurs, are susceptible to changes in the organ functional homeostasis during preservation in the post implantation reperfusion period. The PCT reabsorbs approximately 70% of filtered Na+ and H2O, and its apical membrane has specialized cells with microvilli to increase the area of unidirectional solute transport from the lumen to the blood. The major structural component of brush border microvilli is the filamentous F-actin, which has been shown to interact with a variety of transmembrane proteins, including ion transport molecules. This function is regulated by physiological and hormonal parameters, such as angiotensin II (AII) interacting with actin cytoskeleton and associated proteins, mediated mainly through type I receptors (AT1R). After via different signaling pathways having been triggered, the varied functions are started, including fluid absorption (Jv), which is directly related to the actin cytoskeleton. Methods: Fresh (no preserved) and tubules preserved for 1h and 24hrs in Euro-Collins (EC) and Belzer (UW) solutions, treated with AII, losartan and AII+losartan, evaluated by "in vitro" microperfusion technique (fluid absorption (Jv=nl. min-1. mm-1), and by immunohistochemical technique (AT1 receptor measurement and actin cytoskeleton). Results: a) Our results showed that AII (10-12M) (physiological concentration) stimulates fluid absorption (Jv), which is reduced with losartan (10-6M) in fresh PCT, such as PCT preserved for 1h in EC and for 1-24hrs in UW solutions. There was no fluid absorption (Jv?0) in tubules preserved for 24hrs in EC solution. b) The mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors in fresh tubules (no preserved) showed discreet changes while using drug treatments; however, these differences were not statistically significant. In tubules preserved for 1h in EC and UW, the mean fluorescence intensity of pixel of AT1 receptors increased in the group with no drug treatment, when compared with tubules treated with AII, losartan and AII+losartan. However, the mean pixel intensity of AT1 receptors in tubules preserved for 24hrs in both solutions increased in those treated with AII, when compared with other groups, control group, losartan and AII+losartan. c) When we examined actin cytoskeleton of fresh tubules (no preserved), comparing groups with no drug treatment and those treated with AII, losartan or AII+losartan, we verified that the variation in the mean pixel intensity of actin cytoskeleton, there was no difference statistically significant. However, we verified a greater cohesion in the actin filaments in tubules treated with AII. In tubules preserved in EC for 1h and UW for 1-24hrs there was a uniform distribution of actin filaments. However, it was verified disorganization in all groups (AII, losartan, AII+losartan) in tubules preserved for 24hrs in EC solution, showing that the organ preservation in this solution was not adjusted. Conclusion: Based on these data, we verified that when PCT preservation was carried out for a reduced time (1h), the differences in the composition of the chosen solutions were not significant; however, when the preservation time was extended, the composition of the solution used in the process affected the preservation quality and altered the actin cytoskeleton, determining alterations that could imply in changes in its absorptive functions. The UW solution showed better performance in these experimental conditions / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

A gestação é um período em que a fêmea é transitoriamente submetida a uma série de alterações em todo o organismo, resultando num quadro semelhante à síndrome metabólica, mas que são cuidadosamente reguladas de modo a fornecer o suprimento adequado de substratos para a mãe e para o feto. A gravidez caracteriza-se como modelo fisiológico e temporalmente definido de resistência à insulina. Já durante a lactação, observa-se hipersensibilidade sistêmica à ação da insulina. A ativação de vias de sinalização da insulina no cérebro, em particular no núcleo arqueado do hipotálamo (ARC), tem importante papel na regulação da homeostasia glicêmica. Já está bem estabelecido que a Ang-II é capaz de induzir a fosforilação em serina do IR, do IRS e da subunidade regulatória p85 da PI3K. No entanto, ainda não foi esclarecido se ocorrem alterações na via de sinalização da insulina em áreas do sistema nervoso central (SNC) responsáveis pelo controle da homeostasia glicêmica, como é o caso do ARC, do núcleo hipotalâmico ventromedial (VMH) e do núcleo paraventricular (PVN) durante a gestação, que poderia contribuir para o quadro de resistência à insulina nesta situação. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão das proteínas de sinalização intracelular da insulina IRS1-2, PI3K (p85<font face=\"Symbol\">&#945;, p55<font face=\"Symbol\">&#945;, p50<font face=\"Symbol\">&#945;), AKT, p-Ser473 AKT e dos receptores IR, e AT1a no hipotálamo total e no ARC, VMH e PVN na gravidez e na lactação. Investigou-se também o possível cross-talk da via de sinalização da insulina e da Angiotensina-II (Ang-II) no hipotálamo. Observou-se a redução da expressão do IRS-2, da AKT e da p-Ser473 AKT, concomitante com o aumento da expressão das subunidades regulatórias p85<font face=\"Symbol\">&#945;, p55<font face=\"Symbol\">&#945;, p50<font face=\"Symbol\">&#945; da PI3K e do receptor AT1a no hipotálamo na gravidez. No ARC, VMH e PVN observou-se co-localização da p85<font face=\"Symbol\">&#945; e do receptor AT1a, bem como aumento da expressão de ambos nessas regiões, nas ratas grávidas. O tratamento crônico com antagonista AT1 (losartan) produziu, nas grávidas redução significativa da expressão deste receptor, sem causar alteração na expressão da p85<font face=\"Symbol\">&#945;. A disfunção das vias da Ang-II e da insulina em graus variados pode levar a duas condições patológicas de alta prevalência e que muitas vezes são concomitantes: diabetes mellitus e hipertensão arterial. A melhor compreensão das alterações hipotalâmicas nas vias de sinalização da insulina e da Ang-II, bem como a caracterização molecular dessa interação, tanto nas situações fisiológicas (por exemplo na gravidez) como nas situações patológicas, poderá revelar alvos para futuras intervenções terapêuticas para diversas condições clínicas como a obesidade, o diabetes, a hipertensão arterial, a pré-eclâmpsia/eclâmpsia, etc... / Pregnancy is a period in which the female is temporarily exposed to a series of changes throughout the body, resulting in a condition similar to the metabolic syndrome, but that are carefully regulated to provide an adequate supply of substrates for the mother and the fetus. Pregnancy is characterized as defined in time and a physiological model of insulin resistance. Although during lactation, there is a systemic hypersensitivity to insulin. Activation of the insulin signaling pathways in the brain, particularly in the arcuate nucleus of the hypothalamus (ARC), plays an important role in glucose homeostasis. It is well established that angiotensin II (Ang-II) cross-talking to the insuling signaling pathway is capable of inducing serine phosphorylation of IR, IRS and the p85 regulatory subunit of PI3K. However, it is not clear whether there are changes in the insulin signaling pathway in areas of the central nervous system (CNS) responsible for homeostasis and glycemic control, such as the ARC, the ventromedial hypothalamic nucleus (VMH) and the paraventricular nucleus (PVN) during pregnancy, which could contribute to the symptoms of insulin resistance in this situation. The objective of this study was to evaluate the expression of intracellular insulin signaling proteins such as IRS1-2, PI3K (p85<font face=\"Symbol\">&#945;, p55<font face=\"Symbol\">&#945;, p50<font face=\"Symbol\">&#945;), AKT, p-Ser473 AKT and the expression of IR and AT1a receptors in the hypothalamus, and also specifically in the ARC, VMH and PVN during pregnancy and lactation. We also investigated the possible cross-talk of the insulin and Ang II signaling pathways within the hypothalamus. There was a reduction in IRS-2, AKT and p-Ser473AKT expression concomitant with increased expression of regulatory subunits p85<font face=\"Symbol\">&#945;, p55<font face=\"Symbol\">&#945;, PI3K p50<font face=\"Symbol\">&#945; and AT1a receptor in the hypothalamus in late pregnant rats. In the ARC, VMH and PVN it was observed co-localization of p85<font face=\"Symbol\">&#945; and AT1a receptor, and increased expression of both in these regions in pregnant rats. Chronic treatment with AT1 antagonist (losartan) produced a significant reduced expression of this receptor, without causing any changes in the expression of p85<font face=\"Symbol\">&#945;. The dysfunction of the Ang-II and insulin pathways can lead in different degrees to two conditions of high prevalence and often concomitant diseases such as diabetes mellitus and hypertension. A better understanding of the hypothalamic changes in insulin signaling pathways, the cross-talk with Ang-II and the molecular characterization of this interaction both in physiological (for example in pregnancy) and pathological situations may provide targets for future therapeutic intervention for various clinical conditions such as obesity, diabetes, hypertension, pre-eclampsia/eclampsia, etc...

Uma atividade funcional para uma via alternativa de geração de angiotensina II, como a elastase-2 foi sugerida em estudos realizados anteriormente em nosso laboratório no leito arterial mesentérico isolado de rato. No presente estudo, caracterizamos com o uso de substratos e inibidores seletivos a presença de via alternativa de geração de Ang II, independente da ECA, em carótida de ratos. Determinamos ainda a expressão do RNAm da elastase-2 nesta preparação arterial. Em anéis isolados de carótida de ratos analisamos o efeito vasoconstritor dos peptídeos Ang II, Ang I, TDP, [Pro11-D-Ala12]-Ang I (um substrato resistente a ECA) na ausência e presença de inibidores de proteases. Ang II e seus precursores produziram efeito vasoconstritor dependente da concentração em carótidas de ratos, de forma sensível ao losartan (1 M). Na presença de captopril (10 M) a resposta vasoconstritora produzida pela Ang I foi inibida, mas a resposta contrátil induzida pelo TDP e [Pro11-D-Ala12]-Ang I não foi alterada. Na presença de quimostatina (100 M) o efeito produzido pelo TDP e [Pro11-D-Ala12]-Ang I foi abolido enquanto que a curva cumulativa de Ang I foi significativamente deslocada para a direita. Inibidor Ac-AAPL-CK (seletivo para elastase-2) aboliu completamente a resposta contrátil induzida pelo PDA e não alterou o efeito vasoconstritor da Ang II. Na presença de captopril e quimostatina a resposta vasoconstritora dos peptídeos Ang I, TDP e [Pro11-D-Ala12]-Ang I foram inibidas, enquanto a resposta contrátil da Ang II não foi alterada em artéria carótida. A presença de RNAm da elastase-2 na carótida, juntamente com os dados funcionais apresentados aqui sugerem a participação desta enzima na via alternativa de geração de Ang II em carótidas de ratos. Embora a formação de Ang II a partir Ang I seja descrita como essencialmente dependente da ECA, nossos resultados sugerem a existência de vias alternativas de geração de Ang II sensível a quimostatina e Ac-AAPL-CK em artéria carótida de ratos. Muito provavelmente a elastase-2 seja a enzima responsável pela geração de Ang II nessa preparação. / We have recently described a chymostatin-sensitive elastase-2 as the major angiotensin (Ang) II-forming enzyme in the perfusate of rat mesenteric arterial bed (MAB). In the present study we investigated the role of this enzyme in generating Ang II in the isolated rat carotid artery rings by analyzing the vasoconstrictor effect of Ang II, Ang I, tetradecapetide renin-substrate (TDP), [Pro11-D-Ala12]-Ang I (an ACE-resistant substrate) in the absence and presence of proteases inhibitors. Ang II and its precursors produced a dose-dependent vasoconstrictor effect in vascular preparation that was blocked by losartan (1 M). In carotid rings, captopril (10M) abolished the responses induced by Ang I but did not affect those induced by TDP and [Pro11-D-Ala12]-Ang I. In the presence of chymostatin (100 M) alone, the effects induced by [Pro11-D-Ala12]-Ang I and TDP were abolished while the concentration-response curve to Ang I was shifted to the right. Ac-AAPL-CK (selective elastase-2 inhibitor) inhibited the responses induced by [Pro11-D-Ala12]-Ang I but did not affect Ang II-induced effects. In the presence of captopril and chymostatin, the vasoconstrictor effects of Ang I, TDP, and PDA were completely blocked while those induced by Ang II were not affected in rat artery carotid. Although Ang II formation from Ang I is essentially dependent on ACE in carotid artery, our results suggest the existence of an alternative chymostatin-sensitive pathway in rat arteries, most probably involving elastase-2.

O sistema renina angiotensina (SRA) é descrito como uma complexa cascata hormonal que participa de inúmeros processos fisiológicos. Além da enzima conversora de angiotensina (ECA), outras vias independentes da ECA têm sido descritas como geradoras alternativas de angiotensina II (ANG II), por exemplo, a elastase-2 (ELA-2). A deleção do gene que expressa a ELA-2 é capaz de influenciar o balanço simpatovagal. Sabe-se que existe estreita relação entre a atividade do SRA e a expectativa de vida. Tendo em vista a participação da ELA-2 no perfil autonômico e hemodinâmico de camundongos, e as alterações do sistema cardiovascular na senescência, seria interessante a avaliação do perfil cardiovascular de camundongos idosos nocautes para ELA-2 (ELA-2 KO). O aumento da atividade parassimpática, característica dos camundongos ELA-2 KO, poderia ser um fator protetivo em relação às alterações deletérias características do envelhecimento. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da ELA-2, com relação ao fenótipo cardiovascular e autonômico, no envelhecimento, e avaliar a participação da ECA, também no envelhecimento, nos camundongos ELA-2 KO. Foram estudados camundongos ELA-2 KO machos, jovens (3-4 meses) tratados com salina, e idosos (10-12 meses), tratados com salina ou enalapril. O tratamento teve duração de 10 dias, e foi realizado por meio de gavagem. No quinto dia de tratamento, os camundongos foram submetidos à cirurgia para canulação da artéria femoral e veia jugular. A seguir, cinco dias após a cirurgia procedeu-se o registro hemodinâmico dos animais acordados. A variabilidade da pressão arterial sistólica (PAS) e intervalo de pulso (IP) foi avaliada no domínio do tempo, e da frequência, enquanto a sensibilidade do barorreflexo espontâneo foi avaliada por meio do método de sequência. Não foram observadas diferenças no fenótipo hemodinâmico e autonômico de camundongos ELA-2 KO jovens e idosos; exceto a redução da eficácia barorreflexa no grupo idoso. O tratamento com enalapril reduziu a pressão arterial média (PAM), e promoveu taquicardia, em camundongos ELA-2 KO idosos, quando comparados com os tratados com salina. Entre os grupos idosos não foram observadas diferenças entre os parâmetros referentes à variabilidade da FC. O tratamento com enalapril não promoveu alterações nos índices de sensibilidade barorreflexa. Portanto, sugere-se que a ELA-2 possa contribuir para os efeitos deletérios relacionados à atividade do SRA no envelhecimento. Embora a inibição da ECA tenha alterado os parâmetros hemodinâmicos avaliados entre os camundongos idosos, a mesma não alterou, significativamente, a variabilidade da FC e da PAS / The renin angiotensin system (RAS) is described as a complex hormonal cascade that participates in numerous physiological processes. In addition to the angiotensin converting enzyme (ACE), other ACE-independent pathways have been described as alternative generators of angiotensin II (ANG II), such as elastase-2 (ELA-2). The deletion of the ELA-2 is able to influence the sympathovagal balance. Furthermore, a close relationship between RAS activity and life span has been established. Considering the participation of ELA-2, in the autonomic and hemodynamic profile of mice, and changes in the cardiovascular system in senescence, it would be pertinent to evaluate the cardiovascular profile of elderly knockout mice for ELA-2 (ELA-2 KO). The increase in parasympathetic activity, characteristic of ELA-2 KO, could be a protective factor in relation to deleterious changes characteristic of aging. The aim of the present study was to investigate the role of ELA-2 in the cardiovascular and autonomic phenotype in aging, and to evaluate the participation of ACE in the aging of ELA-2 KO mice. Male ELA-2 KO mice, young (3-4 months, treated with saline) and elderly (10-12 months, treated with saline or enalapril) were studied. The treatment lasted 10 days and was performed by gavage. On the fifth day of treatment, the mice underwent surgery for cannulation of the femoral artery and jugular. Subsequently, five days after surgery hemodynamic recording of the awake animals was performed. The variability of systolic blood pressure (SBP) and pulse interval (PI) was evaluated in the time and frequency domain and the sensitivity of the spontaneous baroreflex, evaluated by the sequencing method. No differences were observed in the hemodynamic and autonomic phenotype of young and elderly ELA-2 KO mice, except for the reduction of baroreflex effectiveness in the elderly group. Treatment with enalapril reduced mean arterial pressure (MAP) and promoted tachycardia in elderly ELA-2 KO mice when compared to saline treated. Among the elderly groups, no differences were observed between the parameters referring to HR variability. Treatment with enalapril did not promote changes in baroreflex sensitivity indexes. Therefore, it is suggested that ELA-2 may contribute to the deleterious effects related to RAS activity in aging, since elderly ELA-2 KO mice have hemodynamic and autonomic phenotypes similar to that of young mice. Although the inhibition of ACE altered the hemodynamic parameters evaluated among the elderly mice, it did not alter the HR and SBP variability

Este trabalho objetivou avaliar como a expressão de WNK4 (With No Lysine Kinase 4) é modulada por NFAT através da modulação por AngII (Angiotensina II) e Ciclosporina A (CsA). WNK4 é uma cinase que tem papel fundamental na regulação do transporte iônico ao longo do néfron distal, pois fosforila outras cinases (SPAK Proline Alanine-Rich Kinase e OSR1 Oxidative Stress Responsive 1) que fosforilam, e assim ativam, o co-transportador sódio-cloreto sensível aos tiazídicos (NCC), o que acarreta no aumento da reabsorção de sódio, cloreto e água, transporte esse sabidamente regulado pelo hormônio Angiotensina II. O estudo genético que revelou que mutações no gene de WNK geravam um quadro de hipertensão, hipercalemia e hipercalcemia, denominado de pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHAII) ou Sídrome de Gordon, foi crucial para a descoberta da importância das WNKs. Este quadro é revertido quando se utiliza diuréticos tiazídicos, mostrando a relação com o NCC. Interessantemente, um quadro similar ocorre quando pacientes transplantados recebem tratamento com CsA. Estudos comprovam que AngII interfere agudamente no conteúdo da proteína de WNK4, por ativação da PKC e fosforilação da Kelchl3 (Kelh-like 3), culminando com inibição do complexo Ubiquitina-Ligase-E3, importante no processo de degradação da WNK4. Ainda não se sabe qual o papel do NFAT sobre a regulação de WNK4 e como AngII e CsA modulação a transcrição gênica de WNK4. Através dos métodos de westernblotting verificamos que CsA aumenta o conteúdo de WNK4. Por RT-PCR observamos também que AngII e CsA são capazes de aumentar significativamente o mRNA-WNK4 após 24h de incubação. Por ensaio da atividade da luciferase utilizando um vetor que apresenta o gene da luciferase sob o controle de promotor contendo elementos para ligação com NFAT, observamos que AngII parece aumentar atividade de NFAT. Observamos que CsA inibe significativamente a atividade da calcineurina através de ensaio enzimático e AngII não teve efeito significativo. Além disso, amplificamos o promotor do gene de WNK4 por PCR do DNA genômico e seguimos com a clonagem deste fragmento no vetor pGL4.10 (que apresenta o gene de luciferase como gene repórter). Neste constructo, vimos que tanto AngII como CsA são capazes de estimular o promotor do gene de WNK4. Após mutações pontuais para elementos NFAT no promotor de WNK4, observamos que o NFAT pode se ligar em diferentes elementos e essa diversidade gera efeitos estimulatórios e inibitórios na síntese proteica de WNK4, pois os elementos apresentam comportamentos diferentes na regulação da transcrição do gene repórter regulado pelo promotor do gene de WNK4. Assim, concluímos que AngII é capaz de estimular a síntese proteica de WNK4 por via dependente de NFAT. / This work aimed to understand how WNK4 expression is modulated by NFAT through AngII and CsA. Wnk4 is a kinase which plays a significant role in ionic transport regulation in distal nephron by inducing phosphorylation of other kinases such SPAK and OSR1, which ultimately lead to NCC phosphorylation. WNK4 activation increases sodium, water and chloride reabsorption in this segment and it´s already know that AngII can modulate this pathway. Genetic mapping studies showed that mutations in WNK gene lead to a hypertension, hyperkalemia and hypercalcemia condition, called Pseudohypoaldosteronism type II (PAH II) or Gordons Syndrome. This finding was crucial for WNKs discovery. Interestingly, this disease is controlled with thiazide diuretics treatment, showing that NCC participates in its pathogenesis. Curiously, a similar condition occurs when transplant recipient are treated with cyclosporine A. AngII changes the WNK4 protein content, thought PKC activation and KLHL3 phosphorylation, leading to an inhibition of ubiquitin-ligase E3 complex, which is important to WNK4 degradation. It is still unclear how NFAT may modulate WNK4 gene expression. We show, by western blotting technique, that CsA increased WNK4 expression, but AngII had not significant effect. After 24h, AngII and CsA increased mRNA-WNK4 by RT-PCR. Using luciferase assay, we observed that AngII increases NFAT activity and CsA decreases NFAT activity, both significantly. AngII did not show effect on calcineurin activity but CsA was able to decrease it, after incubation during 4h. WNK4 gene promoter was amplified by PCR using genomic DNA as a template, and the sequence obtained was cloned in a recombinant vector which has a luciferase gene reporter. Using this recombinant vector cloned with WNK4 gene promoter, we observed that both AngII and CsA increase WNK4 expression. We made a mapping of genome sites for NFAT binding at WNK4 promoter and we identified four elements for NFAT binding. Point mutations in these sites were engineered in order to evaluate the NFAT action in WNK4 promoter activity. We could see that NFAT had an ambiguous behavior and this effect is dependent on which element NFAT is bounded. In summary, we conclude that AngII may increase WNK4 expression through activation of NFAT.

A expressão dos receptores AT1 e AT2 da Angiotensina II (Ang II) em astrocitomas humanos está associada a um pior prognóstico. Para investigar os mecanismos moleculares da ação da Ang II em gliomas, foi analisado por DNA microarray o transcriptoma da linhagem celular C6 tratada com Ang II e antagonistas de AT1 e AT2 nos intervalos de 3 e 6 horas. Os genes diferencialmente expressos obtidos foram submetidos a análises de enriquecimento funcional, diagramas de Venn e interatomas. As alterações observadas no transcriptoma a partir do tratamento com Ang II revelaram genes envolvidos em funções biológicas e vias de sinalização pró-tumorais tais como ciclo celular, migração, ErbB, MAPK e mTOR. Além disso, a identificação das proteínas centrais nos interatomas avaliados forneceu evidências para estudos futuros com foco nesses alvos. Embora a transdução de sinal de AT2 seja distinta da observada em AT1, ambas apresentaram categorias funcionais em comum que podem estar relacionadas ao pior prognóstico observado em pacientes cujos gliomas expressam esses receptores. / The expression of AT1 and AT2 receptors of Angiotensin II (Ang II) in human astrocytomas was associated with a worse prognosis. To investigate the molecular mechanisms of Ang II actions in gliomas, the transcriptomic profile of C6 cells treated with Ang II and antagonists of AT1 and AT2 was evaluated. The differentially expressed genes obtained were submitted to functional enrichment, Venn diagram and transcriptome network analyzes. Ang II treatment caused gene expression changes involved in pro-tumor functions and signaling pathways such as cell cycle, migration, ErbB, mTOR and MAPK. Furthermore, the identification of central proteins in the interactomes provided evidences for future studies focused on these targets. Taken together, these results provided insights into how the transcriptome of glioma cells is affected by Ang II. Moreover, although the signal transduction of AT2 is distinct from the observed for AT1, they present functional categories in common that may be underlying the worst prognosis observed in gliomas expressing Ang II receptors.

O controle neural da pressão arterial é essencial para a manutenção da homeostase do organismo. Este controle é realizado principalmente por núcleos bulbares e hipotalâmicos. Um dos principais sistemas de neurotransmissão envolvidos no controle da pressão arterial é o catecolaminérgico. Células noradrenérgicas e adrenérgicas estão presentes em todos os centros bulbares reguladores da pressão arterial, enquanto seus receptores, principalmente o receptor &alpha;2 adrenérgico (&alpha;2r), estão presentes nas mesmas regiões além de estarem presentes também nos núcleos hipotalâmicos. Estes receptores, quando ativados nestes núcleos, geram respostas cardiovasculares e atuam em conjunto com outros sistemas de neurotransmissão neste controle. Dentre estes sistemas de neurotransmissão, merecem destaque os sistemas angiotensinérgico e glutamatérgico, não apenas por estarem presentes nestes núcleos, mas também por atuarem no controle da pressão arterial. Contudo, pouco se sabe sobre como o sistema catecolaminérgico interage com estes sistemas. Desta forma, estudamos neste projeto a influência do sistema glutamatérgico e angiotensinérgico sobre o sistema catecolaminérgico no bulbo de ratos. Através de culturas de células bulbares, demonstramos que a ativação de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA é capaz de elevar os níveis proteicos do &alpha;2R e que os receptores ionotrópicos do tipo não-NMDA precisam estar desbloqueados para tal. Em ratos adultos, microinjeções repetidas inibem a resposta bradicárdica induzida pela ativação dos &alpha;2rR no NTS. Contudo, o knockdown dos receptores AT1 de angiotensina restaura a resposta bradicárdica. A partir destes resultados, foi demonstrado que o sistema glutamatérgico é capaz de modular o sistema catecolaminérgico, enquanto o knockdown do receptor AT1 de angiotensina no NTS acentua a resposta bradicárdica dos &alpha;2R do NTS. Estes resultados sugerem que os sistemas de neurotransmissão bulbares interagem de diferentes formas e a compreensão deste controle pode vir a ser de grande valia para a compreensão de como se dá o controle da pressão arterial pelo sistema nervoso / The neural control of blood pressure is essential for the maintenance of the homeostasis of the organism. This control is performed mainly by nuclei in the medulla oblongata and in the hypothalamus. One of the main neurotransmitter system involved in this control is the catecholaminergic. Noradrenergic and adrenergic cells are present in all medullary nuclei involved in the arterial pressure regulation, while its receptors, especially the &alpha;2 adrenoceptor, are present in the same region plus hypothalamic nuclei. These receptors, upon activation in these nuclei, generate cardiovascular response, and act with other neurotransmission systems in this control. Among these systems, the glutamatergic and angiotensinergic deserve attention not only for also being present in the same nuclei, but for also acting in the control of the arterial pressure. Both angiotensinergic and glutamatergic systems interact with the catecholaminergic system throughout the nervous system. However, little is known about how the catecholaminergic system interacts with these systems in the modulation of blood pressure. Therefore, we studied in this project the influence of the glutamatergic and angiotensinergic systems over the catecholaminergic system in the medulla oblongata of rats. Through cell cultures of the medulla oblongata, we demonstrated that the activation of glutamatergic NMDA receptors is capable of elevating the proteic levels of &alpha;2-adrenoceptors, and that non-NMDA receptors need to be unblocked for such. In adult rats, repeated microinjections inhibit the bradycardic response elicited by the &alpha;2 adrenoceptors in the NTS. However, the angiotensin AT1 receptors knockdown restored the bradycardic response. Through the chronic knockout of angiotensinergic AT1 receptors in the NTS, we observed bradycardic response elicited by the activation of &alpha;2 adrenoceptors in the NTS of the knock-down rats. These results suggest that the medullary neurotransmission systems interact in different ways, and the comprehension of this control may be of great value for the comprehension of how the neural control of the blood pressure works

Neste estudo, avaliamos e caracterizamos o efeito de Ang II em leito venular mesentérico (LVM) e anéis de veia porta (AVP) de wistar e SHR. A reatividade vascular para Ang II foi estudada na presença e ausência de diferentes antagonistas para elucidar os mecanismos envolvidos na venoconstrição induzida por Ang II. Nossos resultados sugerem que a Ang II induz venoconstrição através da ativação de receptores AT1 e AT2 em Wistar e receptor AT1 em SHR. Essa venoconstrição parece ser contrabalanceada pelo receptor B2 em ambas as espécies. NO contribue para este efeito em wistar e metabólitos da COX em SHR. Há redução da venoconstrição induzida por Ang II em AVP de SHR que pode estar relacionado a redução da expressão protéica de receptores AT2. Esses resultados indicam diferentes mecanismos de regulação do tônus venoso de ratos wistar e SHR em resposta a Ang II que podem ter relevância no controle do retorno venoso e débito cardíaco. / In this study we have evaluated and characterized the effect of Ang II in the isolated perfused mesenteric venular bed (MVB) and portal vein rings (PVR) of SHR and wistar rats. Vascular reactivity to Ang II was studied in the absence and presence of different antagonists to elucidate the mechanisms involved in Ang II-induced venoconstriction. Our results suggest that Ang II induces venoconstriction by activation of AT1 and AT2 receptors in wistar and AT1 receptor in SHR. These venoconstriction seems to be counterbalanced by B2 receptor in both species. NO might contribute to this effect in wistar and COX metabolites in SHR. There is a decrease in Ang II induced venoconstriction in PVR of SHR that might be related to the decrease of protein expression of AT2 receptor. These results indicate different mechanisms of regulation of venous tonus of the SHR and wistar rats induced by Ang II that can be relevant in the control of the venous return and cardiac output.

Ratos expostos a antagonistas da angiotensina II no período da lactação apresentam alterações no desenvolvimento renal que persistem na vida adulta promovendo distúrbios progressivos da estrutura e função renal. Esse estudo caracteriza-se por analisar a influência da 1,25-(OH)2-D3 (Vitamina D3) (calcitriol) nas alterações da nefrogênese induzidas pelo bloqueio dos receptores de angiotensina AT1 no período da lactação. Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: 1- controle, filhotes de mães que receberam solução de sacarose a 2%; 2- controle+Vit. D, filhotes de mães que receberam solução sacarose a 2% e após o período de lactação (25 dias incluindo o período adaptativo) receberam Vit.D (6ng/dia, calcitriol-abbott); 3- losartan, filhotes de mães que receberam losartan (100 mg/kg/dia) diluído em sacarose 2%; 4- losartan+Vit.D, filhotes de mães que receberam losartan (100 mg/kg/dia) diluído em sacarose 2% e após a lactação (25 dias incluindo o período adaptativo) receberam calcitriol (6ng/dia). O losartan foi diluído em uma solução de sacarose a 2% e administrado em substituição a água (no bebedouro) durante a lactação, enquanto que a Vit. D foi administrada através de mini-osmotic pump (Model 2004 alzet) implantados na região dorsal subctânea 4 dias após o final do período de lactação e mantido durante 28 dias. A pressão arterial sistólica foi aferida 28 dias após a introdução da Vit. D. Em seguida, foram coletadas amostras de sangue e urina das proles para avaliação da função renal e os rins removidos para estudos histológicos, imunoistoquímicos, morfométricos e ELISA. Os ratos expostos ao losartan durante a lactação apresentaram aumento da pressão arterial sistólica (PAS) e alterações de função e estrutura renal caracterizada por aumento do volume urinário, da fração de excreção de sódio e potássio, proteinúria, aumento da área intersticial relativa do córtex renal, atrofia dos túbulos renais, fibrose, inflamação intersticial e diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) e osmolalidade urinária. O tratamento com Vit.D após o período de lactação atenuou as alterações da pressão arterial sistólica, taxa de filtração glomerular, fração de excreção de sódio e potássio, proteinúria, área intersticial relativa e área glomerular relativa, evidenciando efeito protetor nos distúrbios da formação renal e na inflamação. Concluindo, o tratamento com Vit.D introduzido após o término da lactação reduziu as alterações da PAS, da estrutura e função renal induzidas pelo losartan, essas alterações estavam associadas aos distúrbios na diferenciação celular e inflamação que persistiram durante a vida adulta. / Rats exposed to angiotensin II (AII) antagonists during lactation present progressive disturbances in renal development leading to alterations in function and structure that persist and progresses in adult life. This study evaluated the effect of Vitamin D (1,25- (OH) 2-D3) (calcitriol) in the disturbances of renal development provoked by losartan, a AT1 antagonist of AII, exposure during lactation in renal function and structure as well in systolic blood pressure (SBP). Male Wistar rats were divided into four groups: Group 1: control, pups from dams that received 2% sucrose solution; Group 2: control+Vit. D, pups from dams that received sucrose solution 2% and Vit.D (6ng / day) after lactation period (25 days including adaptation period); Group 3: losartan, pups from mothers that received losartan (100 mg / kg / day) diluted in sucrose 2% and Group 4: losartan+Vit.D, pups from mothers who received losartan (100 mg / kg / day) diluted in sucrose 2% and calcitriol (6 ng/ day) after lactation period (25 days including adaptation period). Losartan was administered diluted in drinking water in sucrose solution 2% and Vit. D administered by mini-osmotic pump. Treatment with losartan was conducted during all lactation, while Vit.D was introduced after lactation and maintained during the next 28 days. Then SBP was measured and blood and urine samples were collected of the offspring for the evaluation of renal function and kidney removed for histological, immunohistochemical, morphometric, and ELISA studies. Rats exposed to losartan during lactation showed higher SBP in adulthood life. They also had disturbances in renal function and structure in adulthood. These alterations were characterized by increased urinary volume, fractional sodium and potassium excretion, proteinuria, interstitial area from the renal cortex, renal tubule atrophy, fibrosis, interstitial inflammation and decrease glomerular filtration rate and (GFR) urinary osmolality. In conclusion, treatment with Vit.D after lactation attenuated the increase in SBP and the reduction in sodium and potassium fractional excretion and GFR, of interstitial area. The protector effect of this vitamin D was associated to the reduction of the disturbances in inflammation, cell differentiation and proliferation that persist in adulthood life.

La acumulación leucocitaria es una característica de los primeros estadios de la lesión aterosclerótica, de infarto agudo de miocardio y de enfermedades renales de diversa etiología. Receptores para Angiotensina-II (Ang-II) han sido hallados en monocitos y Ang-II puede promover la activación y adhesión de estas células. Este proceso podría desencadenar o perpetuar el daño endotelial asociado a aterosclerosis e hipertensión. Los resultados de nuestro estudio demuestran que Ang-II, a dosis subvasoconstrictoras y fisiológicas, presenta propiedades proinflamatorias in vivo a nivel agudo; en concreto, produce acumulación leucocitaria en vénulas de la microcirculación mesentérica de la rata a través del aumento de expresión de P-selectina endotelial, efecto mediado mediante interacción con sus receptores específicos AT1 y AT2. Sin embargo, el hecho más relevante de este trabajo es que al administrar Ang-II de forma subaguda se produce adhesión leucocitaria no sólo a nivel venular sino también a nivel arteriolar, hecho que podría relacionarla directamente con el inicio de la lesión aterosclerótica. Las respuestas leucocitarias inducidas por Ang-II a nivel agudo pueden ser moduladas por antioxidantes, por compuestos capaces de aumentar los niveles de AMPc, GMPc y por estrógenos. Además, en circunstancias de disfunción endotelial producida por falta de vasodilatadores como NO o PGI2, se produce una rápida respuesta inflamatoria la cual está mediada por Ang-II ya que el tratamiento con el antagonista selectivo frente al receptor AT1 inhibió la infiltración leucocitaria y los cambios hemodinámicos debidos a la carencia de estos vasodilatadores. / Leukocyte accumulation in the vascular wall is a hallmark of the early stages of atherosclerotic lesions, myocardial infarction and several renal diseases. Ang-II receptors have been detected on human monocytes and are capable of promoting monocyte adhesion and activation in vitro. Therefore, Ang-II may be the stimulus for the subendothelial infiltration of leukocytes observed in hypertension and atherosclerosis, in both of which conditions plasma levels of this peptide are elevated. In this study, we show that subvasoconstrictor and physiologically relevant doses of Ang-II (0.1 to 1 nmol/L) elicit leukocyte-endothelial cell interactions within the rat mesenteric microvenules. This effect is both AT1 and AT2 receptor-mediated and is dependent on endotelial P-selectin expression. However, the most relevant finding of the present work is that subacute Ang-II administration induces arteriolar leukocyte adhesion, which may directly implicate Ang-II in the onset of atherosclerotic lesions. Acute leukocyte responses induced by Ang-II are modulated by antioxidants, estrogens and compounds that increase the levels of AMPc and GMPc. Eventually, when the vascular balance is disrupted by falling levels of vasodilators such as NO or PGI2, there is a rapid arterial leukocyte adhesion. This adhesion is predominantly Ang-II dependent, as pretreatment with a selective AT1-antagonist receptor inhibits leukocyte infiltration and haemodynamic changes.