La lipolyse est une réaction enzymatique qui influence négativement les qualités organoleptiques et technologiques du lait. La lipolyse spontanée (LS) correspond à la part de la lipolyse qui dépend de l’animal et du système d’élevage. La LS résulte de l’action de la lipoprotéine lipase (LPL) et de ses cofacteurs sur les globules gras (GG). L’objectif de la thèse a été de comprendre les variations de LS à l’échelle zootechnique et à l’échelle du lait. Les vaches (VL) ont pu être classées en 2 groupes selon leur phénotype : « susceptible » et « non susceptible » à la LS, confirmant l’importance de l’effet individu. Chez les VL susceptibles, nous avons confirmé un effet de la race/génétique, de la parité, du stade physiologique, du moment de la traite, de la fréquence de traite et de l’alimentation.La LS était plus élevée dans les laits issus de la traite du soir, chez les VL Holstein, génotypées KK au locus de DGAT-1. Elle l’était également en fin de lactation et en début de lactation uniquement chez les multipares hautes productrices. Un bilan énergétique négatif pourrait expliquer ces variations. L’augmentation de la fréquence de traite, la restriction alimentaire, l’alimentation à base d’ensilage de maïs comparé à l’herbe conservée/fraîche et la supplémentation lipidique ont également augmenté la LS. Le mécanisme d’action implique probablement une inhibition de la LS par la protéose peptone 5. La membrane des GG semblerait avoir un rôle crucial dans le maintien de l’intégrité du GG, l’interaction avec la LPL et l’équilibre des cofacteurs. L’impact des facteurs zootechniq / Lipolysis is an enzymatic reaction which leads to off-flavor in milk and impairs technological properties of milk. Spontaneous lipolysis (SL) is the fraction of lipolysis which depends on cows and breeding systems. SP corresponds to the hydrolysis of milk fat in milk fat globules (MFG) by the lipoprotein lipase (LPL) and its cofactors. The aim of the PhD was to understand SL variations at both zootechnical and biochemical levels. Cows were sorted in two groups according their phenotype: “susceptible” and “non-susceptible” to SL, confirming the strong impact of the individual effect. Among cows “susceptible” to SL, we confirmed the effects of breed/genetics, parity, physiological stage, milking moment, milking frequency and feeding systems. SL was higher in evening milks of Holstein cows and of cows having the KK genotype at the DGAT-1 locus. SL was higher in late lactation and, in early lactation only for high merit multiparous cows, probably in relation to negative energy balanceAn increase in milking frequency, feeding restriction, maize silage based diets compared to fresh grass and conserved grass based diets and lipid supplementation enhanced SL. At a biochemical level, LS might be inhibited by proteose peptone 5. The MFG membrane might play an important role on MFG integrity, LPL and MFG interactions, and cofactors balance. The impact of zootechnical and biochemical factors on SL is still difficult to hierarchize

L’utilisation de molécules issues d’une synthèse maîtrisée est une approche très intéressante pour les biologistes car elle met à leur disposition des molécules bien caractérisées et d’une grande pureté. Dans un premier temps, nous avons synthétisé des triglycérides structurés. Ce sont des molécules lipidiques dans lesquelles les acides gras d’intérêt sont estérifiés sur le squelette glycérol en position connue. Les acides gras introduits appartiennent à la série oméga 3 (acides linolénique (ALA), eicosapentaènoique (EPA) et docosahexaènoique (DHA). Ils sont estérifiés spécifiquement en position interne ou externes car la biodisponibilité des lipides alimentaires, apportés sous forme de triglycérides, varie en fonction de la position de l’acide gras sur le squelette glycérol. L’utilisation de ces lipides structurés a été validée par des études de biodisponibilité, in vivo, chez le rat, qui ont montré que l’ALA était très bien assimilé quelle que soit sa position sur le glycérol. Dans un deuxième temps, nous avons synthétisé un acide a-linolénique fluorescent, sous forme d’ester méthylique, pour obtenir in fine un TG fluorescent. Celui-ci nous permettra suivre, par imagerie, le devenir de l’ALA dans des cellules en culture, modèles de la barrière intestinale. Les différentes molécules synthétisées sont apparues comme un outil fondamental permettant de mieux connaître le devenir métabolique des triglycérides dans l’organisme. / Biologists are very interested in the use of molecules obtained by a well-controlled synthesis because such molecules are well characterized and of high purity. First, we synthesized pure structured triglycerides in other words lipid molecules in which fatty acids are esterified onto a known position of the glycerol backbone. The introduced polyunsaturated fatty acids belong to the omega 3 series (linolenic (LNA),eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA acids). As the bioavailability of lipids depends upon their position on the glycerol skeleton , we prepared triglycerides esterified with omega 3 fatty acids either qt one of the external positions or at the internal one. The use of these structured lipids was validated byr in vivo studies on rats that showed a good assimilation of LNA whatever its position was. Secondly, we synthesized an ? linolenic acid as methyl ester labeled with a fluorophore To obtain in fine a fluorescent triglyceride. This last one will be use for the spatio-temporal follow-up, in culture cell, of the LNA. The synthesized molecules are a promising tool to better understand the triglycerides’ metabolism in the human being.

L’accumulation de lipides chez une espèce levurienne Yarrowia lipolytica souche sauvage a été caractérisée par l’analyse dynamique et systémique des différents états métaboliques identifiés lors des cultures sous conditions environnementales parfaitement maitrisées, à hautes densités cellulaires selon deux stratégies bien distinctes. En premier lieu sur substrat osidique avec le phosphore comme élément inducteur de l’accumulation de lipides, stratégie originale pour déclencher l’accumulation de lipides chez cette souche. Et deuxièmement sur co-susbtrats glucose et oléate et sans aucune limitation nutritionnelle.Ces stratégies de conduites ont permis de dégager les points suivants :- La limitation phosphore déclenche une accumulation en lipides mais aussi en polysaccharides de réserves mobilisables mais non transitoire contrairement à la limitation azote.- La teneur en phosphore de la biomasse catalytique est très variable. De ce fait, le taux de croissance de la biomasse catalytique n’est pas contrôlable par le débit en phosphore.- Le phosphore joue un rôle dans la régulation de l’entrée de glucose dans la cellule, et permet d’éviter la production de citrate lorsque les voies de production de biomasse et de lipides sont en débordement sur une large gamme de rapport C/P (de 0 à 8000 Cmole.mole-1).- La capacité maximale d’accumulation en réserves carbonées chez Y. lipolytica wT est identique quelle que soit la méthode d’accumulation (limitation azote, limitation phosphore, co-substrats glucose / oléate) et est égale à 0,5 Cmole/CmoleX-1. Il existe donc un phénomène de régulation de la levure encore inconnu et limitant l’accumulation en réserves carbonées chez cette souche.Ces résultats ont permis d’identifier des points clés dans l’accumulation en réserves carbonées de cette espèce levurienne et de proposer un mode de conduite original faisant l’objet d’un dépôt de brevet / Lipid accumulation by the yeast Yarrowia lipolytica wT was characterized by dynamic and systemic analysis of different metabolic states in a microbial culture under fully controlled environmental conditions with high cell concentration and under two different strategies:Glucose as the substrate and phosphorus limitation as an inducer of lipid accumulation, an original strategy for lipid accumulation in Y. lipolytica wT.A co-substrate strategy with glucose and oleic acid and without any nutritional limitation.These strategies allowed showing the following points:- Phosphorus limitation triggers a lipid accumulation and a non-transient accumulation of reserve polysaccharide that can be consumed by biomass when necessary, contrary to nitrogen limitation- Phosphorus rate in catalytic biomass shows great variations. Catalytic growth rate cannot be governed by phosphorus input. - Phosphorus has a role in regulating cellular glucose uptake and allows avoiding citric acid production due to overflow of carbon input over a large range of C/P ratios (0 to 8000 Cmol.mol-1)- Maximum capacity of reserve carbon accumulation in Y. lipolytica wT is similar for any culture strategy tested (under nitrogen limitation, phosphorus limitation or with glucose and oleic acid co-substrates) and is equal to 0,5 Cmol/CmolX-1. There is an unknown phenomenon of carbon regulation limiting reserve carbon accumulation in Y. lipolytica wT. Results allowed identifying key points in reserve carbon accumulation in this particular yeast strain and suggesting an original process, claim of a patent

La neurogenèse est présente, dans le cerveau adulte, dans la zone sous-ventriculaire (ZSV) encadrant les ventricules latéraux et dans le gyrus dentelé (GD) de l’hippocampe, permettant l’apprentissage, la mémoire et la fonction olfactive. Ces micro-environnements possèdent des signaux contrôlant l’auto-renouvellement des cellules souches neurales (CSN), leur prolifération, leur destin et leur différenciation. Or, lors du vieillissement, les capacités régénératives et homéostatiques et la neurogenèse déclinent. Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA), comme le modèle animal reproduisant cette maladie (3xTg-AD), montrent une accélération des phénotypes liés au vieillissement dont une diminution de la neurogenèse. Notre hypothèse est que la découverte des mécanismes affectant la neurogenèse, lors du vieillissement et de la MA, pourrait fournir de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le déclin cognitif. Les études sur l’âge d’apparition et les mécanismes altérant la neurogenèse dans la MA sont contrastées et nous ont guidé vers deux études. L’examen des changements dans les étapes de la neurogenèse lors du vieillissement et du développement de la neuropathologie. Nous avons étudié la ZSV, les bulbes olfactifs et le GD de souris femelles de 11 et 18 mois, et l’apparition des deux pathologies associées à la MA : les plaques amyloïdes et les enchevêtrements neurofibrillaires. Nous avons découvert que les souris 3xTg-AD possèdent moins de cellules en prolifération, de progéniteurs et de neuroblastes, induisant une diminution de l’intégration de nouvelles cellules dans le GD et les bulbes olfactifs. Notons que le taux de neurogenèse chez ces souris de 11 mois est similaire à celui des souris de phénotype sauvage de 18 mois, indiquant une accélération des changements liés au vieillissement dans la MA. Dans la ZSV, nous avons aussi démontré une accumulation de gouttelettes lipidiques, suggérant des changements dans l’organisation et le métabolisme de la niche. Enfin, nous avons démontré que le déficit de la neurogenèse apparait lors des premières étapes de la MA, avant l’apparition des plaques amyloïdes et des enchevêtrements neurofibrillaires. A l’examen des mécanismes inhibant la neurogenèse lors de la MA, nous voyons que chez des souris de 5 mois, le déficit de la neurogenèse dans la ZSV et le GD est corrélé avec l’accumulation de lipides, qui coïncide avec l’apparition du déclin cognitif. Nous avons aussi découvert que dans le cerveau humain de patients atteints de la MA et dans les 3xTg-AD, des gouttelettes lipidiques s’accumulaient dans les cellules épendymaires, représentant le principal soutien des CSN de la niche. Ces lipides sont des triglycérides enrichis en acide oléique qui proviennent de la niche et pas d’une défaillance du système périphérique. De plus, l’infusion locale d’acide oléique chez des souris de phénotype sauvage permet de reproduire l’accumulation de triglycérides dans les cellules épendymaires, comme dans la MA. Ces gouttelettes induisent un dérèglement de la voie de signalisation Akt-FoxO3 dans les CSN, menant à l’inhibition de leur activation in vitro et in vivo. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la régulation de la neurogenèse par le métabolisme lipidique. Nous avons démontré un nouveau mécanisme par lequel l’accumulation des lipides dans la ZSV induit une inhibition des capacités de prolifération et de régénération des CSN lors de la MA. Les travaux futurs permettront de comprendre comment et pourquoi le métabolisme lipidique du cerveau est altéré dans la MA, ce qui pourrait offrir de nouvelles voies thérapeutiques pour la prévention et la régénération. / In the adult brain, neurogenesis continues in the subventricular zone (SVZ) surrounding the lateral ventricles and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus where it plays a critical role in learning, memory, and olfactory function. Within these microenvironments, combinatorial signals control neural stem cell (NSC) self-renewal, proliferation, fate determination and differentiation. Unfortunately, during aging, neurogenesis declines along with many other homeostatic and regenerative capabilities. Furthermore, Alzheimer’s disease (AD) patients and many AD models show an acceleration of several aging related phenotypes including neurogenesis. We hypothesize that uncovering how neurogenesis is affected during aging and in AD will provide novel targets for prevention of cognitive decline. However, conflicting findings including the age of onset and the mechanisms altering neurogenesis in AD propelled us to perform the two following studies. First, we examined the various steps of neurogenesis and how they change as a result of aging, neuropathology development, and neurogenic niches. We studied neurogenesis in the SVZ, olfactory bulb, and DG of 11- and 18-month-old female mice and simultaneously measured the stages of the two major AD-associated pathologies, amyloid plaques and neurofibrillary tangles. We found that, 3xTg-AD mice had fewer proliferating cells, neural progenitors and neuroblasts, resulting in decreased numbers of adult-born cells added to the dentate granule cell layer and the olfactory bulbs. Interestingly, the levels of neurogenesis in 11-month-old 3xTg mice were similar to those in 18-month-old WT mice, indicating an acceleration of aging-related changes in neurogenesis. Interestingly, we found that the deficits in neurogenesis appear at early stages of AD-associated pathologies, before the appearance of the hallmark Aβ plaques and neurofibrillary tangles. Instead, we found a pronounced accumulation of large lipid droplets, suggestive of significant organizational and metabolic changes (Chapter 2). Second, we examined the mechanisms inhibiting neurogenesis in AD. Studying young 5-month-old mice, we found that deficits in SVZ and DG neurogenesis still correlated with extensive lipid accumulation coinciding with the onset of cognitive decline. Importantly, we found that postmortem AD brains and 3xTg-AD mice accumulate neutral lipids within ependymal cells, the main support cell of the SVZ niche. Using novel mass spectrometry techniques, we identified these lipids as oleic acid-enriched triglycerides. Moreover, analysis of plasma, cerebrospinal fluid, and microdissected SVZs showed that these lipids originate from niche-derived rather than peripheral lipid metabolism defects. Remarkably, locally increasing oleic acid in wild-type mice was sufficient to recapitulate the AD-associated ependymal triglyceride phenotype and led to a de-regulation of the Akt-FoxO3 NSC preservation pathway, and inhibition of NSC activation in vitro and in vivo (Chapter 3). Together, this work suggests a novel mechanism of cognitive defects. Specifically, lipid accumulation within SVZ niche cells during early adulthood inhibits the proliferative and regenerative capacity of NSCs in AD. Future work aimed at understanding how and why brain lipid metabolism is altered in AD could provide therapeutic targets for preventative and regenerative strategies for those suffering from AD.

La spectrométrie de masse est une technique analytique permettant de mesurer le ratio masse sur charge d’un ion. Cette technique, très répandue en chimie analytique permet d’élucider la composition moléculaire de mélanges complexes à partir de systèmes homogénéisés. De ce fait, toute l’information sur la distribution spatiale des molécules est perdue. L’imagerie par spectrométrie de masse (IMS) a été inventée afin de résoudre ce problème et permettre d’élucider la distribution spatiale de molécules cibles sur des sections tissulaires minces provenant de tissus biologiques tels que de mammifères ou de plantes. L’un des grands avantages de l’IMS est sa complémentarité à l’histopathologie, technique permettant de révéler la structure ainsi que la localisation de certaines biomolécules à partir de sections tissulaires minces. Cependant, cette dernière se limite principalement aux protéines et aux molécules pouvant avoir une interaction spécifique avec un anticorps. L’IMS permet la détection d’une vaste gamme de biomolécules allant des petits métabolites aux polymères de haut poids moléculaire. Parmi les biomolécules détectables par IMS, les lipides attirent de plus en plus l’attention des analystes. En effet, ils occupent différentes fonctions clés au sein des systèmes biologiques, autant structurales que métaboliques, comme constituants des parois cellulaires, acteurs de la signalisation cellulaires ainsi que dans le stockage d’énergie. Leur intérêt est d’autant plus important qu’aucune technique histologique classique ne permet actuellement de détecter de façon spécifique les différentes classes de lipides. De façon générale, l’IMS de lipides est effectuée en utilisant la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI). Ce procédé permet de révéler l’emplacement de ii différentes classes de molécules en exploitant l’affinité que ces dernières ont pour une matrice particulière. Au-delà du choix de la matrice, d’autres paramètres tels que le mode de déposition de la matrice, le choix des solvants ainsi que le type de lavage utilisé vont également affecter le type de molécules détectés lors d’une analyse MALDI. Malgré les très bonnes performances du MALDI pour l’analyse de lipides, ce mode d’analyse se limite souvent aux lipides polaires facilement ionisables. Les lipides neutres comme le cholestérol (CHO) et les triacylglycérols (TAGs) sont impliqués à différents niveaux de fonctions biologiques fondamentales. Ainsi, nous avons développé trois stratégies permettant l’analyse de ces lipides neutres et de faibles abondances comme les gangliosides, directement à partir de sections tissulaires minces par MALDI ainsi que par désorption-ionisation laser classique (LDI). L’implication du cholestérol en tant que molécule structurale et précurseur de la synthèse de diverses hormones et vitamines, en fait une cible de choix pour l’analyse par IMS. Historiquement, l’analyse du cholestérol par MALDI permettait de le détecter sous sa forme déshydratée. De ce fait, il était impossible de le distinguer des autres métabolites tels que ses esters qui produisaient le même fragment. Afin de permettre l’IMS du cholestérol intact nous avons développé une nouvelle technique de préparation d’échantillons reposant sur le dépôt d’une couche nanométrique d’argent (16±2 nm) sur une section tissulaire mince par pulvérisation. Cette technique permet d’ioniser spécifiquement le cholestérol intact ainsi que divers acides gras sous forme d’adduits d’argent, et ce, avec une haute résolution spatiale (5 µm). iii Au-delà du cholestérol et des acides gras, une autre classe de lipides neutres très abondants, les triglycérides, reste difficilement analysable par MALDI IMS. En effet, les TAGs constituent la principale classe de lipides impliqués dans le stockage énergétique au niveau cellulaire. Ce rôle comme source d’énergie fait des TAGs un acteur incontournable de plusieurs maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique, l’athérosclérose ainsi que la maladie d’Alzheimer. La difficulté d’analyser les TAGs par IMS provient de leur fragilité en milieu acide ainsi que de leur faible tendance à former des adduits sodium nécessaire à leurs analyses. En considérant ces limites, nous avons développé une méthodologie de préparation d’échantillon en deux étapes permettant l’analyse hautement spécifique des TAGs par LDI IMS. Dans un premier temps, les sections tissulaires minces sont initialement exposées à une solution aqueuse contenant un tampon carbonate à base de sodium (pH 10.3, 85 mM) ainsi que d’acétate de sodium (250 mM) afin de facilité la formation d’adduit sodium et de limiter la fragmentation des TAGs en source. Par la suite, une couche nanométrique d’or (28±3 nm) est déposée sur la section afin de permettre l’analyse des TAGs par IMS à haute résolution spatiale (> 10 µm). Lorsque ces derniers ont une abondance réduite dans les sections tissulaires, cette méthode permet aussi l’analyse d’esters de cholestérol (CE). La maladie de Hunter est une maladie génétique caractérisée par l’accumulation de glycosaminoglycanes (GAGs) ainsi que de l’accumulation secondaire de gangliosides. Ce phénomène est dû à l’absence de l’enzyme iduronate-2-sulfatase (IdS) qui permet la dégradation des GAGs. L’accumulation des GAGs et des gangliosides a pour conséquence l’apparition de problèmes fonctionnels et neurologiques majeurs entrainant la mort. Il existe une thérapie de remplacement enzymatique où une forme recombinante de l’enzyme IdS est injectée aux patients. Cette thérapie permet de rétablir le métabolisme normal des GAGs et iv gangliosides dans tous les organes sauf le cerveau où la barrière hémato-encéphalique empêche l’IdS recombinante d’atteindre les zones affectées. L’étude de la composition moléculaire des dépôts de GAGs et gangliosides au niveau cérébral constitue un défi important afin de comprendre la progression des troubles neurologiques engendrés par cette accumulation. À cette fin, nous avons développé une méthode MALDI spécifique à l’analyse des gangliosides à partir de sections tissulaires minces de cerveau de souris simulant la maladie Hunter (IdS-KO). Cette méthode d’analyse par MALDI IMS permet une révélation immuno-histochimique (IHC) des dépôts suivant l’analyse IMS. Nous avons pu visualiser cinq types de gangliosides dont quatre spécifiques au dépôt présent dans les cerveaux révélés par IHC sur la même section tissulaire. Cette étude nous a permis de distinguer pour la première fois des GM3 et GM2 selon la composition de leur chaine latérale et non de leur chaine polysaccharidique révélée par l’analyse IHC. / Mass spectrometry (MS) is an analytical technique that measures the mass-to-charge ratio of ions. This technique is widely used in analytical chemistry to solve the molecular composition of complex homogenized samples. The use of homogenized samples means that all the information with respect to the initial distribution of analytes is lost. Imaging mass spectrometry (IMS) is an MS technique which is able to provide the spatial localization of a given analyte on a surface, such as thin tissue sections from various animal sources. One of the greatest advantages of IMS is its complementarity with histopathology which normally reveals the general structure of thin tissue sections as well as the localization of certain biomolecules such as proteins or of any molecules capable of specific interactions with an antibody. On the other hand, IMS is capable of imaging a wide variety of biomolecules ranging from small metabolites to the high molecular weight proteins and polymers. Among these, lipids are of particular interest for their key involvements in many biological processes. Their interest is even greater when considering that lipid imaging by classical histology is unable to differentiate between all lipid species. IMS of lipids is typically performed using matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI). MALDI IMS can differentiate various classes of lipids and their localization within a thin tissue section by taking advantage of the specific affinity that different classes of lipids have for different matrices. The matrix deposition process, along with the choice of solvents, are key parameters that need to be considered in MALDI IMS. While MALDI offers great coverage of the phospholipidome, it fails miserably for neutral lipid analysis. Indeed, cholesterol and triacylglycerols (TAGs) are two classes of neutral lipids with very important vi biological roles which are extremely difficult to image by MALDI. We have developed three new strategies that enables the detection of neutral lipids, some of which are expressed in low abundance such as gangliosides, directly from thin tissue section using either MALDI or laser desorption/ionization (LDI). Cholesterol is a precursor of many key biomolecules such as vitamins and hormones. It’s also a major component of the cellular membrane. MALDI IMS allows in some cases imaging of the dehydrated form of cholesterol. Unfortunately, detecting cholesterol as such makes it impossible to distinguish some of its metabolites which ionize in a similar fashion and dissociate to produce the same ions. To address this issue, we have developed a new sample preparation method involving the deposition of a nanometer scale silver layer (16±2 nm) over a thin tissue section. This enables the detection by LDI MS of intact cholesterol and some fatty acid species as silver adducts with up to 5 µm in spatial resolution. Beyond cholesterol and fatty acids, TAGs is another class of highly abundant neutral lipids still poorly detected by MALDI IMS. As TAGs are the main molecules involved in energy storage of cells, they have been implicated in many metabolic diseases such as non- alcoholic fatty liver disease, atherosclerosis and even Alzheimer’s disease. The reason why TAGs are poorly detected by MALDI comes from two key factors. First, TAGs are unstable in acidic environments, typical of MALDI matrices. Second, competition effects for the ionizing proton provided by the MALDI matrix prevent TAGs from easily ionizing through this main ionization process. To overcome these limitations, we have developed a new two-step sample preparation method for TAG LDI IMS. We initially deposited a solution of carbonate buffer (pH 10.3, 85 mM) and sodium acetate (250 mM) on the tissue section to increase the amount vii of available sodium for enhanced TAG ionization. The second step consisted of sputtering a nanometer scale UV absorbing gold layer (28±3 nm) that allows for the detection of TAGs by LDI IMS with spatial resolution as low as 10 µm. When TAGs are present in low amounts in the tissue section, this method also enables the detection of cholesterol esters. Hunter’s disease is a genetic disease characterized by the abnormal accumulation of glucoaminoglycans (GAGs) and the secondary accumulation of gangliosides due to the lack of iduronate-2-sulfatase (IdS) enzyme which controls their degradation. The accumulation of both GAGs and gangliosides form deposits which induces various functional issues to different organs as well as neurologic disorders. To minimize these effects, an enzyme replacement therapy has been developed. Unfortunately, it shows efficacy in all organs except the brain due to the inability of the recombinant enzyme to cross the blood-brain barrier. To further our knowledge of the progression of the disease, using a mouse model of Hunter’s disease we have developed a MALDI based method to specifically image gangliosides in brain deposits with a spatial resolution of 5 µm. This method also permits subsequent ganglioside staining by immunohistochemtry of the tissue section. With this method, we have identified four types of ganglioside which are specific to the Hunter’s disease pathology. We were also able to detect two types of deposits, one which is enriched in short chain gangliosides and the other in long chain gangliosides.

Dans un contexte de démarche écoresponsable et pour répondre aux exigences de biocompatibilité notamment dans les applications cosmétiques et biomédicales, nous avons développé de nouveaux hydrogels à base de polysaccharides neutres et anioniques en utilisant deux voies originales. La 1ère approche est biomimétique et a consisté à mimer un phénomène d’élaboration naturelle d’hydrogels que l’on retrouve chez certains végétaux pour lesquels une enzyme, la laccase, permet de créer des liens de réticulation par dimérisation des composés phénoliques (en l’occurrence de l’acide férulique FA) présents sur les arabinoxylanes des mucilages des graines de céréales par exemple. Notre travail a ainsi consisté à greffer de l’acide férulique via deux chimies différentes de type imidazole et carbodiimide respectivement pour des polysaccharides neutres ou anioniques. Nous avons ainsi fonctionnalisé trois polysaccharides : le pullulane ou PUL (neutre modèle), le carboxyméthylpullulane ou CMP (anionique modèle) et l’acide hyaluronique ou HA (anionique d’intérêt). Des taux de greffage compris entre 2 et 25% ont été obtenus. L’étude physicochimique en régimes dilué et semi-dilué a permis de mettre en évidence un comportement associatif lié au caractère amphiphile des polysaccharides fonctionnalisés. La réticulation en présence de laccase, suivie in situ en rhéologie, a été réalisée avec succès sur les différents systèmes envisagés avec des contrôles possibles de la cinétique, des propriétés mécaniques finales ou encore du gonflement des hydrogels en fonction du caractère neutre ou chargé des polysaccharides, du degré de substitution en acide férulique, de la concentration en polymère ou de l’activité enzymatique fixée. Les dérivés synthétisés ont globalement démontré des activités biologiques (antioxydante et cytocompatible) intéressantes. La deuxième approche repose sur la photoréticulation possible de polysaccharides (PUL, CMP et HA) fonctionnalisés par le greffage d’amine/acide gras mono ou polyinsaturé (oleylamine, acide oléique et linoléique) via la chimie des imidazoles. Si le pullulane modifié par l’acide linoléique à 2% s’est avéré non hydrosoluble en raison de son caractère neutre, tous les autres dérivés avec des taux de greffages de 3 et 10% ont démontré une bonne solubilité dans l’eau. Les études physicochimiques mettent en évidence un très fort caractère associatif de ces dérivés amphiphiles avec la formation de gels physiques en régime semi-dilué. La photoréticulation a été démontrée en rhéologie sous irradiation UV in situ en présence d’un photoamorceur de type Darocur 1173®. Les résultats préliminaires obtenus selon cette approche en photoréticulation ouvrent ainsi des perspectives intéressantes. / In the framework of an eco-responsible context and to take advantage of biocompatibility, notably in cosmetic and biomedical applications, we have developed new hydrogels based on neutral and anionic polysaccharides using two original routes. The first approach is biomimetic and consists of mimicking a natural development of hydrogels that is found in certain plants for which an enzyme, laccase, allows to create crosslinks by dimerization of phenolic compounds, in occurrence of ferulic acid (FA) present on arabinoxylans mucilage of cereal seeds for example. Thus, our work consisted in grafting ferulic acid via two different chemical ways that means imidazole and carbodiimide respectively for neutral or anionic polysaccharides. We functionalized three polysaccharides: pullulan or PUL (neutral model), carboxymethylpullulane or CMP (model anionic) and hyaluronic acid or HA (anionic of interest) with grafting rates of between 2 and 25%. The physicochemical study in diluted and semi-diluted regimes evidenced an associative behavior due to the amphiphilic character of the functionalized polysaccharides. The crosslinking in the presence of laccase, followed in situ thanks to rheology, has been successfully performed on the various envisaged systems with possible controls of kinetics, the final mechanical properties or the swelling of the hydrogels as a function of the neutral or charged nature of the polysaccharides, the degree of substitution in FA, the polymer concentration or the enzymatic activity. The synthesized derivatives have generally demonstrated interesting biological activities (antioxidant and cytocompatibility). The second approach is based on the possible photocrosslinking of polysaccharides (PUL, CMP and HA) functionalized by the grafting of mono or polyunsaturated fatty amine/acid (oleylamine, oleic acid and linoleic acid) via imidazole chemistry. If pullulan grafted with 2% of linoleic acid was found to be water-insoluble due to its neutral character, all other derivatives (i.e. anionic ones) with grafting rates of 3 and 10% showed good solubility in water. The physicochemical studies show a very strong associative character of these amphiphilic derivatives with the formation of physical gels in semi-diluted regime. Photocrosslinking has been demonstrated in situ thanks to rheology/UV irradiation in the presence of a Darocur 1173® photoinitiator. The preliminary results according to this photocrosslinking approach thus open interesting perspectives.

Cette thèse porte sur la synthèse de polyuréthanes thermoplastiques plus durables à partir de dérivés des huiles végétales. La première voie étudiée est basée sur la réaction, largement utilisée, entre un diol et un diisocyanate. Aussi, pour s’affranchir de l’utilisation des diisocyanates toxiques, une approche via la polyaddition entre un bis carbonate cyclique et une diamine a également été étudiée. Pour ce faire des précurseurs bi-fonctionnels : diols, bis carbonates cycliques à 5 et 6 chainons et diamines ont été préparés à partir de dérivés de l’huile de tournesol (oléate de méthyle) et de l’huile de ricin (undécénoate de méthyle et acide sébacique). Les propriétés thermo-mécaniques des polyuréthanes et poly(hydroxyuréthane)s thermoplastiques obtenus ont pu être ajustées par le choix adapté de la structure chimique des précurseurs (gras) utilisés. Les travaux réalisés démontrent un effet de la taille du cycle du carbonate sur la réactivité. En effet, les (bis) carbonates cycliques à 6 chainons se sont avérés plus réactifs que leurs homologues à 5 chainons. De plus, la synthèse de diamines via un intermédiaire dinitrile semble très prometteuse pour le « design » d’une plateforme de diamines issues d’acides gras et de poly(hydroxyuréthane)s entièrement bio-sourcés. / This thesis aims to synthesize more sustainable thermoplastic polyurethanes from vegetable oil derivatives. The first route that has been investigated is based on the well-known reaction between a diol and a diisocyanate. Then to avoid the use of diisocyanates, the route via the polyaddition of a bis cyclic carbonate and a diamine have been studied as well. For this purpose, bifunctional precursors such as diols, bis 5- and 6-membered cyclic carbonates and diamines have been prepared from sunflower oil derivative (methyl oleate) and castor oil derivatives (methyl undecenoate and sebacic acid) The thermo-mechanical properties of the PUs have been modulated by designing and selecting the chemical structure of the (fatty acid-based) monomers. The performed model reaction kinetics revealed the higher reactivity of the 6-membered cyclic carbonates compare to the 5-membered ones. Finally, the developed route to fatty acid-based diamines via dinitriles synthesis in mild conditions was really efficient and this route is really promising to develop a fatty acid based-diamines platform and fully bio-based poly(hydroxyurethane)s.

L’imagerie et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (IRM et SRM) sont des méthodes non-invasives qui ont le potentiel d’estimer in vivo la quantité et la qualité des adiposités abdominales. Le contexte scientifique et clinique de ce manuscrit s’articule autour de l’étude de surnutrition « Poly-Nut » dont l’un des objectifs est d’analyser les évolutions des tissus adipeux (TA) dans une phase rapide de prise de poids. L’originalité et la complexité de cette thèse résident dans le développement, l’adaptation et la comparaison de plusieurs méthodes quantitatives d’IRM et de SRM, pour l’étude du signal lipidique dans un contexte clinique à 3T. La fiabilité et la validation des mesures obtenues in vivo par ces techniques font ici l’objet d’une étude approfondie. Pour l’analyse quantitative du signal de spectroscopie, différentes méthodes existantes ont été comparées à celle développée spécifiquement pour notre étude clinique. L’estimation paramétrique par moindres carrés non linéaires appliquée aux spectres RMN des lipides peut conduire, selon la fonction modèle utilisée, à un problème non linéaire mal posé. Nous montrons alors que l’utilisation d’un modèle simplifié se fondant sur la structure d’une chaine de triglycéride, comme utilisé récemment en imagerie quantitative, constitue une solution valide au regard de l’état de l’art. Ensuite différentes méthodes (IRM, SRM, Dual Energy X-ray absorptiometry, chromatographie en phase gazeuse) ont été utilisées pour caractériser les TA sous-cutanés et viscéraux. Le suivi par IRM du contenu lipidique du foie ainsi que du volume et de la composition en acide gras des TA à partir d’une unique acquisition en multi-écho de gradient est démontré. Enfin des développements expérimentaux menés parallèlement à l’étude clinique sur un imageur préclinique à 4,7T, comparent différentes stratégies d’encodage du déplacement chimique par imagerie et caractérisent des méthodes SRM pour estimer in vivo la proportion d’omégas-3 dans les chaînes d’acides gras. / Magnetic resonance imaging and spectroscopy (MRI and MRS) are non-invasive methods that have the potential to estimate in vivo the quantity and the quality of abdominal adipose tissues (AT). The scientific and clinical context of this thesis is based on an overfeeding study entitled "Poly-Nut". One of the main objectives of this study is to analyze changes in adipose tissues in a rapid phase of weight gain. The originality and complexity of this thesis rely in the development, adaptation and comparison of several quantitative methods of MRI and MRS, for the study of lipid signal, in a clinical context, at 3T. The reliability and the validation of the measurements obtained in vivo using these techniques are the main subject of this PhD thesis. For the quantitative analysis of the spectroscopy signal, different existing methods have been compared to those developed specifically for our clinical study. According to the model function used, the nonlinear-least-squares parametric estimation applied to the lipid spectra can lead to an ill-posed nonlinear problem. We demonstrated that the use of a simplified model based on the structure of a triglyceride chain, as recently used in quantitative imaging, was a valid solution regarding the state of the art. Then different methods (MRI, MRS, Dual Energy X-ray absorptiometry, gas chromatography) were used to characterize the subcutaneous and visceral AT. We demonstrated the feasibility of MRI to follow the lipid content in the liver as well as the volume and the fatty acid composition of AT using a single multiple gradient-echo acquisition. Finally, experimental developments were carried out in parallel with the clinical study, on a 4.7T preclinical system, first, to compare different strategies for encoding the chemical shift using imaging and, secondly, to characterize MRS methods for in vivo estimation of the relative proportion of omega-3 among all fatty acids.

L’objectif des travaux de cette thèse a été d’explorer les bases moléculaires de l’effet de l’huile d’Argan (HA) sur le métabolisme lipidique au niveau mitochondriale et peroxysomale ainsi qu’élucider son potentiel anti-inflammatoire. Nous avons donc montré, dans un premier temps, que les méthodes artisanales préservaient les propriétés antioxydantes d’HA empêchant l’oxydation de l’acide férulique contrairement à l’HA d’origines commerciale. Ensuite, le traitement par l‘HA ou par les lipopolysaccharides (LPS) de fibroblastes humains, un modèle cellulaire de la pseudo-adrénoleucodystrophie néonatale (P-NALD), révèle pour l’HA une prolifération des peroxysomes indépendante de l’activation du récepteur nucléaire PPARα et de son coactivateur PGC-1α. Par contre, l’induction de la prolifération de peroxysomes par les LPS est accompagnée d’une activation de PPAR et de PGC-1Parallèlement, une étude a été réalisée au niveau hépatique chez des souris traitées par l‘HA ou par les LPS. Nous avons montré pour la première fois l’activité antioxydante de l’huile d’Argan in vivo au niveau hépatique par l’induction de l’activité enzymatique de la catalase peroxysomale et une activité hypolipémiante par la stimulation des activités déshydrogénases (ACADs) de la -oxydations mitochondriale des acides gars. De plus, l’HA induit la transcription des gènes PPECK et G6PH de la voie de la néoglucogenèse. Nous avons montré également pour la première fois un effet préventif de l’HA contre la répression des activités déshydrogénases des voies de -oxydations mitochondriale et peroxysomale, ainsi que celle la voie de la néoglucogenèse. Nos travaux démontrent que l’HA possède un potentiel anti-inflammatoire, induit par le LPS, élucidé par la répression de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNFα et par l’induction de cytokines anti-inflammatoires IL10 et IL-4. L’ensemble de nos résultats indiquerait que l’huile d’Argan, du fait de sa composition riche en acide gras mono et polyinsaturés et en antioxydants, a des effets hypolipémiants et anti-inflammatoires au niveau hépatique qui se traduisent par une régulation de l’expression à la fois de récepteurs nucléaires et de leur gènes cibles ainsi que de certaines cytokines / The objective of this thesis work was to explore the molecular basis of Argan Oil (AO) effects on the mitochondrial and peroxisomal lipid metabolism and to elucidate its anti-inflammatory potential. We thus showed, initially, that the artisanal method preparation preserved the antioxidant properties of AO preventing the oxidation of the ferulic acid, by contrast to AO of commercial origin. Then, the treatment by the AO or lipopolysaccharides (LPS) of human fibroblasts, the cellular model of pseudo-neonatal adrenoleukodystrophy (P-NALD), revealed for the AO that peroxisomes proliferation is independent from the activation of the nuclear receptor PPARα and the co-activator PGC-1α. On the other side, the induction of the proliferation of peroxisomes by LPS is accompanied by an activation of both PPARα and PGC-1α. At the same time, mice treatments by AO or by the LPS showed, for the first time, the hepatic antioxidant activity of AO through the induction of the activity of the peroxisomal catalase. In addition, we showed a hypolipidemic activity of AO, by the stimulation of dehydrogenase activities (ACADs) of the mitochondrial fatty acid b-oxidation. Moreover, the AO induces the transcription of genes involved in gluconeogenesis pathway (i.e. PEPCK and G6PH). We also revealed, for the first time, the preventive effect of AO against LPS repressions of mitochondrial and peroxisomal fatty acid degradation as well as on the gluconeogenic pathway. Furthermore, the AO anti-inflammatory potential has been shown, in mice treated by LPS, through the repression of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNFα and by the induction of the anti-inflammatory cytokines IL10 and IL-4. All together, our results may indicate that the Argan oil, because of its composition rich in mono and polyunsaturated fatty acids and in antioxidants as well, has a hypolipidemic and an anti-inflammatory effects, which are revealed by the regulation of the expressions of nuclear receptors and their target genes including several cytokines

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