Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:18:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327688.pdf: 1457038 bytes, checksum: 2aa37a38003e3b6e579ae614ab6e60cb (MD5) Previous issue date: 2014 / As quinonas são uma classe de substâncias químicas de interesse na terapêutica do câncer, visto que algumas delas apresentam potencial antitumoral. Pesquisas sugerem que o efeito antitumoral destes compostos pode ser potenciado por substituições estratégicas dos substituintes ligados ao núcleo quinóide. Desta forma, este trabalho teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico, antiproliferativo e antitumoral bem como o mecanismo molecular de ação de 1,4-naftoquinonas substituídas. Dentre os compostos avaliados, os que apresentaram maior atividade citotóxica para linhagem tumoral MCF7 (câncer de mama humano), avaliada pelo método do MTT, foram DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5 (CI50 < 25 µM). Sugerindo-se que o efeito citotóxico é influenciado principalmente por seus substituintes onde grupos doadores e aceptores de elétrons modulam as propriedades eletrônicas do átomo de nitrogênio presente nas moléculas, facilitando ou dificultando a ocorrência do ciclo redox. Além disso, estes mesmos quatro compostos inibiram a formação de colônias celulares, promovendo um efeito citostático. Através do ensaio de fragmentação do DNA plasmidial e ensaio cometa constatou-se que as 1,4-naftoquinonas substituídas promoveram dano direto ao DNA e que a fotoativação pela luz UV-A (365 nm) potencializou este dano. Para verificar se as mesmas possuíam interação direta com o DNA, foi utilizada a técnica de varredura por espectrometria, utilizando-se o CT-DNA. Foi observado que os compostos interagem com o DNA, promovendo um efeito hipocrômico, indicando que a interação seja por intercalação, o que foi confirmado pelo ensaio de fluorescência, utilizando o brometo de etídeo como agente intercalante. O dano ao DNA induzido pelos compostos foi também confirmado por imunoeletroforese, as naftoquinonas substituídas aumentaram a fosforilação da histona gH2Ax. Por outro lado, a citometria de fluxo demonstrou que os compostos avaliados promoveram a parada do ciclo celular na fase G2, o que foi também confirmada pelo ensaio de imunoeletroforese, onde não se observou inibição na expressão da proteína cdk2, o que poderia ser devido ao fato desta cinase dependente de ciclina estar particularmente envolvida na regulação do ciclo celular na fase G1. Além disso, também foi observado que os compostos promoveram a morte celular predominantemente por apoptose independente de caspase e/ou necrose programada tanto in vivo quanto in vitro. Considerando que estes compostos aumentaram a expressão da p53 e não promoveram a clivagem da PARP. Diante desses resultados, sugere-se que os compostos possam ter promovido a morte celular por necrose programada ou necrosis like/ apoptose independete de caspase. Sugere-se ainda que os efeitos citotóxicos, genotóxicos e citostático promovido pelos compostos se devam a geração de EROS, que foi observado pelo ensaio com DCFH-A, onde os compostos DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5 apresentaram um aumento significativo de geração de EROs (7874,22; 6056,37; 10547,47 e 3833,33 unidades de fluorescência/mg de proteína) em relação ao controle negativo (1493,10 unidades de fluorescência/mg de proteína). Os ensaios in vivo, demonstraram que DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5 apresentaram efeito antitumoral, se destacando o composto DPB4. Em relação ao tipo de morte celular in vivo foi observado que os compostos aumentaram o percentual de células apoptóticas iniciais e principalmente tardias e/ou necróticas, confirmando os resultados visualizados in vitro. Além disso, foi investigado se os compostos poderiam também ter uma atividade antiangiogênica, sendo este efeito observado para todos os compostos avaliados (DPB1, DPB2, DPB4 e DPB5), destacando-se o composto DPB2 que em concentrações de 5, 10 e 20 µM/ml reduziram o percentual de vasos em 67,69; 53,84 e 76,92%. Por fim, sugere-se que os efeitos mediados pelas 1,4-naftoquinonassubstituídas em estudo se devam ao sinergismo de três mecanismos: ciclo redox, pelo aumento da geração de EROs, intercalação ao DNA e/ou inibição da topoisomerase II, que consequentemente induz a morte das células tumorais.<br> / Abstract : Quinones are a class of chemicals of interest in cancer therapy, since some of them have antitumor potential. Research suggests that the antitumor effect of these compounds can be potentiated by strategic substitutions quinoid substituents attached to the core. Thus, this study aimed to characterize the cytotoxic, antiproliferative and antitumor potential as well as the molecular mechanism of action of substituted 1,4- naphthoquinones. Among the compounds evaluated, showed the highest cytotoxic activity to tumor cell line MCF7 (human breast cancer), as evaluated by the MTT method were DPB1, DPB2, DPB4 and DPB5 (IC50 < 25 mM) having substituents attached directly to the naphthoquinone nucleus. Suggesting that the cytotoxic effect is mainly influenced by their substituents groups where donors and electron acceptors modulate the electronic properties of this nitrogen atom in molecules, facilitating or hindering the occurrence of the redox cycle. Furthermore, these same four compounds inhibited the formation of cell colonies by promoting a cytostatic effect. Through the fragmentation test and the plasmid DNA comet assay was found that 1,4- naphthoquinones substituted promoted direct DNA damage and that the photoactivation by UV-A light (365 nm) potentiated this damage. To verify whether they had direct interaction with DNA, the technique of scanning spectrometer was used, using the CT-DNA. It was observed that the compounds interact with the DNA, providing a hypochromic effect, indicating that the interaction is by intercalation, which was confirmed by fluorescence assay using ethidium bromide as the intercalating agent. The DNA damage induced by the compounds was also confirmed by immunoblot, substituted naphthoquinones increased phosphorylation of histone ?H2Ax. Furthermore, flow cytometry showed that the compounds evaluated promoted cell cycle arrest in the G2 phase, which was also confirmed by immunoelectrophoresis assay where no inhibition was observed in the expression of the cdk2 protein, which could be due to the fact this cyclin dependent kinase to be particularly involved in the regulation of the cell cycle in the G1 phase. Moreover, it was observed that the compounds promoted cell death predominantly by caspase -independent apoptosis and / or programmed necrosis both in vivo and in vitro. Whereas these compounds increased the expression of p53 and did not promote the cleavage of PARP. From these results, it is suggested that the compounds may have promoted cell death by necrosis or programmed like necrosis. It is also suggested that the cytotoxic, genotoxic and cytostatic effects promoted by the compounds are due to generation of ROS, which was observed by DCFH-A assay, where DPB1 , DPB2 , DPB4 and DPB5 compounds showed a significant increase in ROS generation (7874.22, 6056.37, 3833.33 and 10547.47 fluorescence units / mg protein ) compared to negative control (1493.10 fluorescence units/mg protein). In vivo assays showed that DPB1, DPB2, DPB4 and DPB5 showed antitumor effect, highlighting the compound DPB4. Regarding the type of cell death was observed that compounds increased the percentage of early apoptotic cells and mostly late and/or necrotic, confirming the results shown in vitro. Furthermore, we investigated whether the compounds could also have a antiangiogenic activity, this effect being observed for all compounds evaluated (DPB1, DPB2, DPB4 and DPB5), highlighting the compound DPB2 that at concentrations of 5, 10 and 20µM /ml reduced the percentage of vessels in 67.69, 53.84 and 76.92 %. Finally, it is suggested that the effects mediated by substituted 1,4- naphthoquinones study are due to the synergism of three mechanisms: redox cycle by the increased generation of ROS, and DNA intercalating / or inhibition of topoisomerase II, which consequently leads to tumor cell death.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Fisicas e Matematicas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2015-03-18T20:43:15Z : No. of bitstreams: 1 313699.pdf: 3446379 bytes, checksum: 507f85a2970ba1b5fcd885a888bdf743 (MD5) / A poli(etilenoimina) (PEI) foi modificada por meio da alquilação com grupos n-alquila (n = 4, 6, 8 e 12 carbonos). O espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS), tensão superficial, emissão de fluorescência do pireno, viscosidade e medidas de pH foram as técnicas usadas para investigar a conformação e agregação das PEIs hidrofobicamente modificadas em solução aquosa, na ausência e na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS). Medidas de SAXS mostraram que o raio de giro diminui com o aumento do comprimento da cadeia alquílica, enquanto que os dados de viscosidade indicaram uma diminuição na viscosidade intrínseca. A PEI não modificada não apresentou atividade na superfície, enquanto as PEIs modificadas mostraram atividade pronunciada na superfície e presença de domínios hidrofóbicos. Na presença de SDS, o início da formação do complexo polímero-surfactante foi determinado, indicando uma diminuição na concentração de agregação crítica (cac) com o aumento no comprimento da cadeia alquílica substituída na PEI. A PEI também foi decorada com o grupo uridina com dois graus de substituição (5% e 15%). A formação de complexos das PEIs, decoradas com uridina ou hidrofobicamente modificadas, com o DNA do timo de bezerro foi investigada através das técnicas de emissão de fluorescência do brometo de etídio, espectrofotometria de UV-Vis, dicroísmo circular (CD), potencial zeta, viscosidade, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e SAXS, na ausência e na presença de SDS. Todas as PEIs apresentaram três etapas na formação de complexos com o DNA: a primeira, quando uma pequena quantidade de polieletrólito foi adicionada, as cadeias do DNA são parcialmente condensadas; a segunda, quando mais polieletrólito foi adicionado, apresenta complexos com densidade de carga nula, com tamanho micrométrico; a terceira, em concentrações mais altas da PEI, o DNA foi completamente condensado pelas cadeias das PEIs, formando complexos positivamente carregados com valores de RH,ap na faixa de 51 a 88 nm. Análises de viscosidade e SAXS sugerem que o a PEI não modificada teve a interação mais forte e que melhor condensa o DNA.<br> / Abstract : The polyethylene imine (PEI) was modified by means of the alkylation with n-alkyl groups (n = 4, 6, 8 and 12 carbons). Small-angle X-ray scattering (SAXS), viscosity, surface tension, and pyrene fluorescence emission were then used as techniques to examine the conformation and aggregation of the hydrophobically modified PEIs in aqueous solution, in the absence and presence of sodium dodecylsulfate (SDS). Analysis of the SAXS data showed that the radius of gyration decreases with an increase in the alkyl chain length of the polymer, while the viscosity data indicated a decrease in the intrinsic viscosity under the same conditions. The nonmodified PEI was not surface active, while the hydrophobically modified samples showed pronounced surface activity and the presence of hydrophobic domains. On addition of SDS, the onset of the formation of polymer#surfactant complexes was determined, indicating a decrease in the critical aggregate concentration (cac) with an increase in the alkyl chain length of the polymer backbone. The PEI also was decorated with uridine groups with two substitution degrees (5% and 15%). The complex formation of the decorated or hydrophobically modified PEI with calf thymus DNA was investigated through of the ethidium bromide fluorescence emission, UV-Vis spectrophotometry, circular dichroism (CD), potential zeta, viscosity, dynamic light scattering (DLS) and SAXS techniques, in the absence and presence of SDS. All versions of PEI showed three steps in complexes formation with DNA: first, when a small amount of polyelectrolyte was added, DNA chains were partially condensed; second, when more polyelectrolyte was added, the complexes had a null charge density and micrometric size; third, at higher concentration of PEI, the DNA was fully condensed by PEI chains, leading to positively charged complexes with RH,ap values in the range of 51-88 nm. Viscosity and SAXS analyses suggested that the unmodified PEI had the stronger interaction and promoted the best DNA condensation.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-20T20:27:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / As Fosfatases Ácidas Púrpuras - PAPs constituem uma classe de metaloenzimas que contém um sítio ativo do tipo Fe3+M2+ (M = Fe, Mn ou Zn), capazes de promover a hidrólise de ésteres de fosfato e anidridos numa faixa de pH de 4-7. Durante a catálise o grupo fosfato liga-se ao sítio M2+ onde é ativado para um ataque nucleofílico do hidróxido terminal ligado ao sítio de Fe3+ sobre o fósforo. O grupo de saída é então protonado seguido da quebra da ligação P-OR onde os produtos da reação são liberados e a enzima restabelecida a forma ativa. Acredita-se que a utilização de ligantes binucleantes N,O-doadores que possam induzir ambientes de coordenação assimétricos para os centros metálicos e sítios lábeis para reatividade é uma estratégia conveniente na busca de modelos estruturais e funcionais para as PAPs. Assim apresentamos nesse trabalho um novo procedimento sintético para o desenvolvimento de ligantes não simétricos que possam mimetizar o ambiente de coordenação dos íons metálicos no sítio ativo das PAPs. Além de novos ligantes, foram também sintetizados e caracterizados novos complexos de FeZn e FeCu cuja atividade catalítica na hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato revelou uma aceleração de até 9200 vezes em relação a reação não catalisada. Estudos de interação com DNA mostraram que os compostos estudados são capazes de promover a clivagem hidrolítica da dupla fita.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T17:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 202857.pdf: 952008 bytes, checksum: 3939b6964c1743c4c50c155741cf4974 (MD5) / Os objetivos foram estabelecer um protocolo preliminar de cultivo primário de fibroblastos gengivais humanos e conseqüentemente, estabelecer uma linhagem celular; avaliar a viabilidade celular e os danos que os procedimentos precedentes poderiam causar na molécula de DNA. Uma biópsia de 20mm2 de mucosa ceratinizada foi fragmentada em 15 partes menores e divididas em 5 garrafas de cultura. A proliferação celular foi verificada através de microscópio invertido. Após subconfluência 70%, as células foram tripsinizadas. Foram usadas as células da 6a passagem. A viabilidade foi determinada através do teste de exclusão do azul de Trypan. Os possíveis danos nos DNA foram avaliados pelo Ensaio do Cometa. Uma das garrafas foi tratada com peróxido de hidrogênio. A viabilidade dos grupos-teste foi maior que 90%. Os DNAs dos grupos-teste não apresentaram danos significativos (p<0,01). Foi possível, estabelecer uma linhagem de fibroblastos viáveis e sem alterações significantes no seu DNA. Os achados permitem o uso destas células em futuras pesquisas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T19:14:37Z : No. of bitstreams: 1 barea_ja_me_botfm.pdf: 626955 bytes, checksum: 85be35c50f78253f7b270023ffe7687e (MD5) / Este trabalho visou a comparação de 5 diferentes métodos de extração de DNA, a partir de amostras de materiais de arquivo (tecido incluído em parafina, lâmina de hemograma corada e não corada com Leishman, lâmina de mielograma, gotas de sangue em Guthrie card) e fontes escassas (células bucais, 1 e 3 bulbos capilares, 2 mL de urina), para avaliar a facilidade de aplicação dos mesmos e possibilidade de amplificação desse DNA pela técnica de PCR. Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida e não seguida por purificação com fenol/clorofórmio, utilização de Chelex 100 Ò, utilização de InstaGeneÒ e fervura em água estéril. O DNA obtido, foi testado por PCR, para a amplificação de três fragmentos gênicos: de Brainderived neutrophic factor (764 pb), de Fator V Leiden (220 pb) e de Abelson (106 pb), sendo que, a amplificação para o primeiro, eliminava a necessidade dos demais. Conforme o tamanho do fragmento gênico estudado, a fonte potencial de DNA e o método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização dos procedimentos técnicos a serem incluídos e apresentados no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro – HC – UNESP – Botucatu. / The present work aimed to compare five different methods of DNA extraction of archieved materials samples (paraffin-embedded tissues, periferic blood smear – stained or non-stained with Leshman, aspired bone marrow smears and blood guts in Guthrie card) and rare sources (oral cells, 1 and 3 capilar bulbs, 2 mL urine), to avaliate the aplication facility and the amplification possibility one for PCR. The methods included proteinase K digestion – followed or non by phenol/chloroform purification, Chelex 100Ò (BioRad), InstaGeneÒ (BioRad) and boilling in sterile water. The DNA obteined, was tested for amplification of 3 genic fragments: from Brainderived neutrophic factor gene (764 bp), Factor V Leiden gene (220 bp) and Abelson gene (106 bp). According to the genic fragment lenght studed, the DNA potential source and the extraction method used, the results characterized better guidelines for padronization of the techniques procedures for to Good Manufacturing Practices from Molecular Biology Laboratory from Blood Center – Medicine School – UNESP - Botucatu .

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T01:51:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 297593.pdf: 1091974 bytes, checksum: c69f67dcc2b97a7b63484a12f1e4985e (MD5) / Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR quantitativa em tempo real são usadas para detecção e quantificação de ingredientes geneticamente modificados (GM) em alimentos. Os objetivos deste trabalho foram desenvolver iniciadores e sondas para detecção dos elementos cry1A.105 e cry2Ab2 presentes no evento de milho GM MON89034; aplicar técnicas de PCR e PCR em tempo real para avaliar alimentos disponíveis no mercado brasileiro quanto à presença de material GM; e analisar os resultados segundo as exigências de legislação e rotulagem para esses produtos. Diferentes alimentos derivados de milho e soja foram analisados quanto à presença dos eventos de milho GM Bt11 e Bt176 e do evento de soja GM Roundup Ready (RR). No primeiro estudo, a presença dos eventos de milho GM Bt11 e Bt176 foi avaliada em 81 produtos derivados de milho (farinha de milho, fubá, biju e polenta) comercializados no Brasil. Foi observada a ausência dos eventos Bt11 e Bt176 em todas as amostras analisadas. No segundo estudo, PCR e PCR em tempo real foram aplicadas a fim de detectar e quantificar o evento de soja RR em produtos à base de soja e em derivados de carne. No total de 59 amostras analisadas, seis foram positivas para presença do evento de soja RR e apenas uma amostra apresentou soja RR acima do limite para rotulagem. No terceiro estudo, iniciadores e sondas foram desenvolvidos e avaliados em termos de especificidade, eficiência e limite de detecção para identificação específica dos elementos cry1A.105 e cry2Ab2 presentes no evento de milho GM MON89034. Os resultados mostraram alta especificidade e eficiência para detecção de cry1A.105 e cry2Ab2 sendo o limite de detecção entre 0,05 e 0,01 ng de DNA por PCR para ambos os ensaios. Este trabalho permitiu confirmar a importância e a aplicabilidade da PCR e da PCR em tempo real para detecção e quantificação de eventos e elementos GM em alimentos. / Polymerase Chain Reaction (PCR) and quantitative real time PCR have been used to detect and to quantify genetically modified (GM) ingredients in foods. The aims of this work were: to develop primers and probes for detection of the cry1A.105 and cry2Ab2 elements present in GM maize event MON89034; to apply PCR and real time PCR to evaluate the presence of GM material in foods available at Brazilian market; and to analyze the results according to law and label requirements for these products. Different types of foods derived from maize and soy were analyzed for the presence of GM maize events Bt11 and Bt176 and GM soybean event Roundup Ready (RR). On the first study, the presence of GM maize events Bt11 and Bt176 was evaluated in 81 products derived from maize (maize flour, corn meal, maize flour flakes and polenta) commercialized in Brazil. It was observed the absence of GM maize Bt11 and Bt176 in all samples analyzed. On the second study, PCR and real time PCR were applied to detect and to quantify RR soybean event present in soy and meat derived products. A total of 59 samples were analyzed, six of them were positive to the presence of RR soybean event and only one sample showed RR soybean bove the limit to be labeled. On the third study, primers and probes were developed and evaluated in terms of specificity, efficiency and limit of detection for specific detection of cry1A.105 and cry2Ab2 elements present in GM maize event MON89034. The results showed high specificity and efficiency to detect cry1A.105 and cry2Ab2 with a detection limit between 0.05 and 0.01 ng of DNA per PCR for both assays. This work allowed confirming the importance and the applicability of PCR and real time PCR to detect and to quantify GM events and elements in foods.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T04:45:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 291237.pdf: 5528836 bytes, checksum: 89b2d27edaf5442e5fe4329b22f651f9 (MD5) / O abacaxizeiro (Ananas comosus var. comosus) é uma espécie domesticada no norte da América do Sul, a partir da espécie selvagem A. comosus var. ananassoides. No período anterior a conquista a espécie já estava dispersa por toda América Tropical e parte da Subtropical, configurando uma planta de grande importância social para os grupos humanos. Após o contato com os europeus o abacaxizeiro foi disperso pelo globo, e hoje se configura como uma das frutas tropicais de maior importância econômica mundial. O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de abacaxi, tendo como principal consumidor o próprio mercado interno, mesmo apresentando um baixo consumo per capita da espécie. Isto configura um potencial de crescimento da exploração comercial da fruta, tanto no mercado interno como no externo. Em Santa Catarina a baixa produção de abacaxi, aliada ao consumo médio per capita da espécie maior que o nacional, tornam a revitalização do cultivo uma potencial oportunidade para a agricultura catarinense. Porém, para revitalizar o cultivo, os agricultores devem ter acesso a mudas de alto valor genético e isentas de pragas e doenças. A presente dissertação objetivou a caracterização genética de 29 genótipos presentes na coleção de germoplasma do CCA/UFSC, através de 7 marcadores microssatélites. Os acessos conservados na coleção são, em geral, genótipos locais do estado de Santa Catarina, configurando-se de grande importância genética regional. Nesta abordagem foi possível adaptar com sucesso um protocolo de extração de DNA genômico, extraído de partes de folhas basais de plantas adultas (aproximadamente 0,5g), obtendo-se em média 3750 ng de DNA genômico para cada acesso, concentrados em 75 µL de solução estoque. Porém, entre os lócus estudados o maior polimorfismo encontrado foi de 27,58%, o maior número de alelos foi 4, o máximo número efetivo de alelos foi de 1,597 e foi encontrado 3 alelos raros, sendo que dois deles em um mesmo lócus. Isto configura baixo poder de informação, impossibilitando a análise da distância genética e índices de variabilidade genética. A abordagem quanto a qualidade fitossanitária se deu por meio da elaboração de um protocolo de alta performance de micropropagação de abacaxizeiro baseado em culturas nodulares associadas a sistemas de imersão temporária. O protocolo foi dividido em indução e multiplicação de culturas nodulares, regeneração de microbrotos, crescimento à brotos e aclimatização. Os explantes utilizados foram bases foliares retiradas de brotos desenvolvidos in vitro. A melhor combinação de fitorreguladores para a indução de culturas nodulares foi 2 µM de ANA e 8 µM de 2-iP. Para a multiplicação de culturas nodulares a combinação que gerou os melhores resultados foi a de 2 µM de ANA e 2 µM de BAP em sistema de imersão temporária por meio de frascos duplos. Esta mesma combinação de fitorreguladores mostrou-se eficiente para a regeneração de microbrotos, porém, utilizando-se sistema de imersão temporária em frascos RITA®. Posteriormente, em sistema de imersão permanente, o crescimento de microbrotos foi mais adequado em meio de cultura contendo 10 µM de AG3. Brotos acima de 2 cm foram aclimatizados com sucesso em substrato composto por mistura (1:1) de casca de arroz carbonizada e Plantmax® HT, com uma porcentagem de sobrevivência superior a 92%.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:43:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Devido à introdução no mercado de grãos e produtos derivados de soja geneticamente modificada (GM) a habilidade em detectar estes produtos passou a ser uma necessidade legal. Atualmente, a detecção destes organismos GM está baseada na presença de DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Diversos fatores influenciam para o desempenho desta reação, destacando a qualidade do DNA extraído. Neste estudo, foi avaliada a extração de DNA de grãos e produtos de soja, através de diferentes métodos de extração derivados do método CTAB. Os produtos analisados foram grãos, farinha, extrato, mistura infantil contendo isolado proteico e bebida à base de soja. A escolha de dois protocolos denominados de C e D permitiram a extração das amostras para verificar o rendimento e a qualidade do DNA pela leitura da densidade ótica a 260 nm, visualização de bandas em gel de agarose e através da PCR, com iniciadores que amplificam o fragmento de 164pb da lectina de soja confirmando a qualidade da extração. Foram extraídas de 8 a 26 amostras de cada produto (grãos e derivados de soja) com os protocolos C e D. Com o protocolo D, obteve-se maior rendimento e melhor razão de DO 260/280. Com o protocolo C, não foi possível medir a razão de DO para DNA extraído de fórmula infantil e bebida de soja. Embora baixas concentrações de DNA tenham sido obtidas pelo protocolo C, obteve-se banda intensa do fragmento de 164 pb após amplificação com iniciadores LEC1/LEC2. Deste modo, o protocolo C foi escolhido pois evita o uso de fenol, um reativo tóxico. Amostras de extrato e bebida à base de soja foram utilizadas em um experimento piloto para a realização da detecção específica de soja Roundup Ready. Após a Nested PCR, produtos da amplificação de 169pb foram observados para 9 das 12 amostras de extrato de soja. Para amostras da bebida de soja, problemas de contaminação ocorreram com os controles negativos; gerando amostras com resultados falso-positivo; impossibilitando a confirmação da presença de resíduos de soja RR.