Les ganglions de la base forment un réseau neuronal mettant en jeu une circuiterie complexe et jouant un rôle essentiel dans la régulation des fonctions motrices, dans différentes formes d'apprentissage sensorimoteur, ainsi que dans les processus motivationnels. Cette régulation met en jeu une boucle cortico-striato-thalamo-corticale dans laquelle le striatum tient une position centrale en étant la principale structure d’entrée de ce réseau. Il joue le rôle de filtre en intégrant et traitant l’ensemble des informations qui y parviennent. Ce réseau neuronal complexe peut être altéré par différentes pathologies humaines (maladie de Parkinson, schizophrénie, chorée de Huntington, addiction aux drogues, …) qui résultent d’une perturbation ou d’une lésion au niveau d’une ou plusieurs structures composant le système des ganglions de la base.<p>Le striatum, premier relais du système des ganglions de la base, reçoit deux afférences principales :les voies dopaminergique nigro-striatale et glutamatergique cortico-striatale. En plus de ces deux afférences majeures, l’adénosine, par son action sur ses récepteurs, joue de nombreux rôles de régulation dans ce système. Ainsi, l’activité neuronale des neurones épineux moyens du striatum est modulée par les récepteurs de la dopamine qui sont en étroites interactions avec les récepteurs de l’adénosine. Bien que la signalisation de la dopamine et de l’adénosine ait été l’objet de nombreuses attentions, les mécanismes impliqués dans la régulation, par les récepteurs D2 de la dopamine et A2A de l’adénosine, dans le contrôle du potentiel membranaire et de l’excitabilité intrinsèque des neurones épineux moyens du striatum et leurs conséquences sur cette excitabilité en cas de déplétion en dopamine (mimant la maladie de Parkinson) restent encore très méconnues.<p>Dans ce travail de thèse, nous avons donc tenté d’élucider les mécanismes de régulation des récepteurs D2 et A2A et leurs interactions dans la modulation de la transition du potentiel membranaire et de l’excitabilité intrinsèque des neurones striataux, ainsi que les conséquences d’une déplétion en dopamine sur cette excitabilité neuronale. <p><p>Dans le premier travail de thèse, sur un modèle in vitro de transition du potentiel membranaire et par l’utilisation de peptides compétitifs, nous avons montré que les récepteurs D2 et A2A régulent le plateau de dépolarisation du potentiel membranaire induit par le NMDA via un mécanisme d’interaction protéine-protéine intramembranaire. En effet, l’activation du récepteur D2 supprime la transition entre un potentiel membranaire hyperpolarisé, le « down-state » et un plateau de dépolarisation du potentiel membranaire, le « up-state » par la régulation de l’activité du canal calcique Cav1.3a interagissant avec la protéine d’ancrage Shank. L’activation du récepteur A2A per se n’a pas d’effet, mais il réverse totalement la modulation de la transition du potentiel membranaire par le récepteur D2 selon un mécanisme dans lequel l’hétéromérisation des récepteurs A2A-D2 est strictement nécessaire, démontrant ainsi un intérêt physiologique direct de ces hétéromères. Nos travaux démontrent que la transition du potentiel membranaire et la fréquence de décharge des potentiels d’action des neurones striataux sont étroitement contrôlées par les récepteurs D2 et A2A via des interactions spécifiques protéine-protéine impliquant une hétéromérisation des récepteurs A2A-D2.<p><p>Dans la seconde étude présentée dans cette thèse, nous avons mis en évidence une régulation antagoniste de l’excitabilité intrinsèque des neurones épineux moyens du striatum par les récepteurs D2 et A2A via des mécanismes impliquant la modulation d’une conductance potassique de type A (IA). Par ailleurs, nous avons montré qu’une déplétion en dopamine conduit à une augmentation de l’excitabilité intrinsèque de ces neurones via une diminution d’une conductance IA. Malgré une forte diminution des afférences synaptiques excitatrices déterminées par une diminution de la densité des épines dendritiques et une augmentation du courant minimal nécessaire pour induire un premier EPSP, l’augmentation de l’excitabilité intrinsèque induite par la déplétion en dopamine résulte en un renforcement de la réponse des synapses restantes, permettant aux neurones striataux de répondre à une stimulation en provenance des afférences excitatrices de manière similaire voire même, plus efficace que dans les conditions contrôles. De plus, cette augmentation de l’excitabilité intrinsèque via la régulation d’une conductance IA représente une forme de plasticité homéostatique permettant au neurone de compenser une perturbation de l’activité neuronale ou de la transmission synaptique et donc d’assurer une stabilité de son patron de décharge des potentiels d’action. Ces données montrent la capacité de cette homéostasie à maintenir la fréquence de décharge des neurones striataux dans une gamme fonctionnelle, et ce dans des conditions pathologiques, permettant de stabiliser l’activité neuronale dans un réseau altéré.<p><p><p>En conclusion, l’ensemble de ce travail de thèse a permis de mettre en évidence une interaction fonctionnelle des récepteurs D2 de la dopamine et A2A de l’adénosine dans la régulation du contrôle de l’excitabilité des neurones épineux moyens du striatum. Il a également permis d’établir l’existence d’un mécanisme de plasticité homéostasique intervenant dans ce système neuronal altéré, afin de maintenir une activité électrique fonctionnelle des neurones striataux.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Les fonctions immunitaires déclinent au cours du vieillissement, un phénomène qui pourrait être lié à l'accumulation de cellules sénescentes dans les tissus. La sénescence est un état irréversible d'arrêt de croissance qui s'engage principalement en réponse à des dommages irréparables de l'ADN. Les cellules sénescentes ont un phénotype sécrétoire pro-inflammatoire (SASP) qui affecte les tissus voisins. CD73 est une enzyme qui travaille en collaboration avec CD39 pour produire de l’adénosine à partir d‘adénosine triphosphate (ATP). Il a été démontré que des concentrations plus élevées d'adénosine dans un microenvironnement tumoral nuisent aux fonctions des cellules immunitaires. L'objectif de ce projet est de déterminer si les fibroblastes sénescents ont la capacité d'induire l'expression de CD39/CD73 à la surface des cellules tueuses naturelles (NK) et d'inhiber la réponse immunitaire antitumorale. Nos résultats montrent que les cellules NK-92, NKAES (cellules tueuses naturelles amplifiées) et les cellules NK primaires expriment des niveaux plus élevés de CD39/CD73 lorsqu'elles sont cultivées avec des fibroblastes sénescents. De plus, nous avons observé que le marqueur CD73 est aussi augmenté dans les fibroblastes sénescents. L'augmentation était cependant plus prononcée lorsque la sénescence était induite en raison de la surexpression de l’oncogène hRASv12 plutôt que suite à l'exposition à des radiations ionisantes. En outre, la cytotoxicité des cellules NK diminue lorsque celles-ci sont exposées à un environnement sénescent et lorsqu'on traite les cellules avec 2-Chloro Adénosine (CADO), un analogue de l'adénosine. Nous supposons que l'augmentation de l'expression de CD39/CD73 conduira à une production accrue d'adenosine, créant ainsi un environnement immunosuppressif. La caractérisation de l'impact de la sénescence cellulaire sur les fonctions des cellules NK pourrait donner un aperçu du développement de stratégies visant à augmenter la capacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales, améliorant potentiellement les résultats du traitement du cancer. / Immune functions decline during aging, a phenomenon that may be linked to the accumulation of senescent cells in tissues. Senescence is an irreversible state of cell growth arrest often in response to irreparable DNA damage. Senescent cells have a proinflammatory secretory phenotype (SASP) that affects nearby tissues. CD73 is an enzyme that works in collaboration with CD39 to produce adenosine from adenosine triphosphate (ATP). Higher concentrations of adenosine in a tumor microenvironment were shown to impair immune cell functions. The objective of this project is to determine whether senescent fibroblasts have the ability to induce CD39/CD73 expression at the surface of natural killer (NK) cells and inhibit the antitumoral immune response. Our results show that NK-92, NKAES and primary NK cells express higher levels of CD39/CD73 when grown in co-culture with senescent fibroblasts. Similarly, we also observed that the CD73 marker is increased in senescent fibroblasts. The effect was, however, more pronounced when fibroblasts were induced to senesce because of the overexpression of oncogenic hRASv12 compared to when induced to senesce following exposure to ionizing radiation. In addition, the cytotoxicity of NK cells decreases when NK cells are exposed to a senescent environment and when treated with 2- Chloroadenosine (CADO), an analog of adenosine. We hypothesize that increased CD39/CD73 expression will lead to an increased production of adenosine creating an immunosuppressive environment. Characterization of the impact of cellular senescence on the function of NK cells could provide insights into the development of strategies to increase the ability of the immune system to eliminate tumor cells, potentially improving cancer treatment outcomes.

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue. / Opioids are the most effective analgesics available but their use is limited by tolerance. Tolerance is related, at least in part, to receptor desensitization. Hence, the role of the present study was to better characterize the desensitization process, in particular concerning the role of the tyrosine kinase Src on regulation of delta opioid receptor signalling. Our results show that pharmacological inhibition with PP2 (administered at low concentration: 20-40µM) or molecular inhibition of the kinase with low expression levels of a dominant negative mutant of Src (0,2µg of DNA) potentiate the magnitude and duration of agonist-dependent (DPDPE; 1µM; 5 min) activation of the ERK pathway. We also showed that higher concentrations of Src inhibitors (80 and 100µM of PP2 or 1µg/ml of dominant negative mutant DNA) block the MAPK cascade following DOR stimulation by DPDPE. These observations indicate that Src has a biphasic effect on ERK activity, respectively potentiating or inhibiting agonist stimulation of the MAPK cascade at low and high levels of Src inhibition. We reasoned that high levels of Src blockers were interfering with ERK activation mechanism while low levels of inhibition were interfering with receptor desensitization. This possibility was tested by using cAMP accumulation assays to evaluate the effect of Src blockers (PP2, 20 µM; 1h) on agonist-induced desensitization. DOR stimulation by DPDPE inhibited forskolin stimulated cAMP production in a dose dependent manner with a maximal reduction of 61%. This inhibitory response was reduced by 72% following pre-exposure to DPDPE (1 µM, 30 min), an effect that was blocked by pre-treating cells with PP2 (PP2, 20 µM; 1 h) before desensitization. The protective effect of Src blockers did not involve changes in DOR internalization but interfering with internalization by using an internalization-deficient DOR mutant or hypertonic medium (0.4M sucrose) reduced this protection, indicating the need for optimal internalization in order for the protective effect of Src blockers to take place. Based on the latter observation it was possible to conclude that Src contribution to DOR desensitization is post-endocytic.

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.

Les nucléotides et nucléosides sont des molécules essentielles à la vie. Outre leurs fonctions intracellulaires, ils jouent un rôle dans la communication intercellulaire. Les nucléotides et nucléosides sont libérés dans l’espace extracellulaire par différents mécanismes et ensuite rapidement métabolisés par des ecto-nucléotidases. Ils exercent leurs effets paracrines et/ou autocrines en activant des récepteurs présents à la surface membranaire des cellules. Les récepteurs P1, au nombre de quatre (A1, A2A, A2B et A3), sont activés par l’adénosine. Les récepteurs P2X1-7 ont une activité intrinsèque de canal ionique et sont essentiellement activés par l’ATP. Les récepteurs P2Y possèdent sept domaines transmembranaires et sont couplés à des protéines G. A ce jour huit sous-types ont été identifiés :P2Y1,2,4,6,11,12,13,14. Ces récepteurs sont activés par des nucléotides adényliques (ATP et ADP) et/ou uridyliques (UTP, UDP et UDP-glucose). Les récepteurs P1 et P2 modulent l’activité de multiples processus biologiques :système immunitaire (A2A, P2X7, P2Y11,…), agrégation plaquettaire (P2Y1, P2Y12, P2X1), tonus vasculaire, angiogenèse,…<p><p>Notre laboratoire a identifié et caractérisé plusieurs récepteurs P2Y :P2Y4, P2Y6, P2Y11 et P2Y13. Ce dernier est activé par l’ADP et est couplé à une protéine Gi. L’abondance du transcrit P2Y13 murin est caractérisée par l’ordre suivant :rate >> pancréas > foie = cerveau. Afin de déterminer son rôle physiologique, nous avons généré une lignée de souris invalidées pour le récepteur P2Y13. Après avoir validé l’inactivation du gène P2Y13 dans ces souris, nous avons analysé leur phénotype. Les souris P2Y13-/- ne présentent pas d’anomalie évidente :elles sont viables, fertiles et se développent normalement. Etant donné le profil d’expression de ce récepteur, nous avons analysé leur système immunitaire, en particulier les cellules dendritiques (DC). <p>In vivo, l’invalidation du récepteur P2Y13 ne semble pas avoir d’impact sur les réponses inflammatoires (choc septique, infiltration de neutrophiles, test à la formaline) et auto-immunes (uvéorétinite expérimentale). In vitro, nous avons montré que l’ADPβS induit une mobilisation de calcium cytoplasmique dans les DC spléniques et qu’il stimule l’endocytose d’antigènes par celles-ci. L’utilisation de DC transgéniques a permis d’exclure l’implication du récepteur P2Y13 et a montré que ces effets sont médiés par le récepteur P2Y12 qui est également activé par l’ADPβS. Ces observations suggèrent qu’il serait intéressant d’analyser le système immunitaire des souris P2Y12-/-, en particulier les réponses immunes dépendantes des DC. D’autre part, ce travail a débouché sur la mise en évidence d’un effet anti-inflammatoire médié par le récepteur de l’adénosine A2B dans les DC dérivées de la moelle osseuse. Enfin, nous avons récemment mis en évidence un rôle potentiel du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des glucides et des lipides. Nous avons observé que les souris P2Y13-/- produisent plus d’insuline en réponse à une injection de glucose que les souris contrôles tandis que leur glycémie ne semble pas altérée. De plus, les souris P2Y13-/- sous régime riche en graisses reproduisent 3 caractéristiques du syndrome métabolique chez l'homme :surpoids, dyslipidémie (augmentation des triglycérides et du non HDL-cholestérol) et hyperinsulinémie.<p><p>Notre travail de thèse débouche donc sur deux conclusions et une perspective :<p>•\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’axe adénosinergique est au cœur de divers processus pathophysiologiques. L’enzyme CD73 joue un rôle pivot dans la génération de l’adénosine en catalysant la déphosphorylation de l’adénosine monophosphate. L’adénosine contribue à un éventail large de processus biologiques et pathologiques, principalement via l’activation de récepteurs transmembranaires. L’adénosine est principalement reconnue pour son activité régulatrice des cellules immunitaires et CD73 pour son rôle dans l’accumulation de l’adénosine dans le microenvironnement tumoral. En effet, en altérant la réponse immunitaire anti-tumorale via l’inhibition des fonctions effectrices de divers types de cellules immunes, CD73 et l’adénosine sont fréquemment associés à la progression tumorale et s’inscrivent comme cibles thérapeutiques intéressantes. Les rôles de CD73 et l’adénosine dans d’autres processus immunitaires physiologiques ne sont pas tous aussi bien compris, notamment concernant les processus d’immunisations. En utilisant un modèle murin d’immunisation contre le pneumocoque, cette thèse démontre un rôle positif, mais non essentiel, de CD73 et de l’adénosine dans la commutation isotypique des lymphocytes B et la génération d’une immunité protectrice contre l’infection au S. pneumoniae. Cette découverte est pertinente au développement de stratégies thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité d’immunisation dépendante des cellules B, plus particulièrement chez les populations à risque en bas âge. Ensuite, alors que la modulation de l’axe adénosinergique, notamment via l’inhibition de CD73, est une avenue thérapeutique étudiée dans divers contextes de tumeurs solides, ce potentiel thérapeutique demeure largement inexploré dans des modèles de néoplasmes sanguins. En utilisant un modèle de souris transgénique de leucémie spontanée, cette thèse démontre un rôle pro-tumorigénique, avec un biais sexuel, de CD73 dans la leucémie lymphoïde chronique des lymphocytes B (LLC), via l’altération de l’immunité anti-tumorale. Enfin, alors que les rôles immunosuppressifs de CD73 et l’adénosine sont bien décrits, leurs activités pro-tumorigéniques qui s’étendent au-delà de l’immunité anti-tumorale sont peu connues. En accord avec la littérature, cette thèse explore plusieurs hypothèses selon lesquelles CD73 module l’activité métabolique mitochondriale des cellules cancéreuses. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent un rôle pro-tumorigénique à l’enzyme CD73, indépendant de la signalisation adénosinergique et de l’inhibition de l’immunité anti-tumorale, qui favorise la flexibilité métabolique et plus particulièrement la respiration mitochondriale des cellules cancéreuses, via la voie de récupération de la biosynthèse du nicotinamide (NAD+). En résumé, cette thèse apporte plusieurs précisions quant aux rôles biologiques de l’enzyme CD73 qui sont pertinents à l’immunisation dépendante des lymphocytes B, à la pathogénèse de la LLC ainsi qu’à la régulation de l’activité métabolique des cellules cancéreuses. Cette thèse offre de nouvelles pistes de réflexion quant au potentiel thérapeutique que renferme l’axe adénosinergique et plus particulièrement CD73, en approfondissant nos connaissances quant à l’éventail de ses fonctions. / The adenosinergic axis is central to a plethora of pathophysiological processes. The enzyme CD73 is key to the generation of adenosine by catalyzing the dephosphorylation of adenosine monophosphate. Adenosine’s contribution to biological and pathological processes is mainly carried through the activation of transmembrane receptors. Adenosine is mostly appreciated for its regulatory activity on a variety of immunes cells whereas CD73 is often referred to the enzyme responsible for adenosine accumulation within tumor microenvironment. Thus, by hindering antitumoral immune responses, CD73 and adenosine are frequently associated with cancer progression and targeting these offers great therapeutic potential in clinic. CD73 and adenosine’s role in other immune physiological processes are not fully understood, notably regarding immunization processes. Using a murine model of pneumococcal immunization, this thesis herein demonstrates a positive, but non-essential, role for CD73 and adenosine in B cells’ isotype class switching required to protective immunity against S. pneumoniae. This finding is particularly relevant to the development of novel strategies aimed at enhancing B cell-dependent immunization in high-risk populations such as young infants. While targeting the adenosinergic axis, particularly CD73, was extensively proven efficient in restoring antitumor immunity in many solid tumor contexts, its therapeutic potential in blood neoplastic malignancies remain largely unexplored. Using a transgenic mouse model of spontaneous leukemia, this thesis identifies a sex-oriented pro-tumorigenic role for CD73 in favoring B cells chronic lymphocytic leukemia (CLL) progression, through the inhibition of antitumor immunity. Finally, while immunosuppression by CD73 and adenosine is well described in cancer, other immune-independent pro-tumorigenic roles of CD73 are poorly understood. In accordance with literature, this thesis explores various hypotheses by which CD73 regulates cancer cells’ mitochondrial metabolic activity. Results presented herein suggest an immune- and adenosine signaling-independent pro-tumorigenic function for CD73 in favoring cancer cells’ metabolic flexibility and more particularly mitochondrial respiration through the nicotinamide (NAD+) salvage biosynthesis pathway. In sum, this thesis brings many insights into CD73’s biological functions relevant to B cells-dependent immunization, in CLL pathogenesis and in cancer cells’ metabolic activity. By expanding our knowledge of the extend of CD73’s biological functions, this thesis further discusses novel potential therapeutic opportunities.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'anion superoxyde peut agir comme une molécule de signalisation ou comme un facteur préjudiciable selon sa concentration, l'organe cible, et selon la présence ou non d'antioxydants neutralisants. Actuellement, dans les cellules musculaires lisses (CMLs) vasculaires, les effets de l'anion superoxyde sur les différentes voies de transduction du signal et sur les interactions croisées entre ces voies ne sont pas encore définies. Par conséquent, une meilleure connaissance des effets de l'anion superoxyde sur les différentes voies de signalisation pourrait fournir une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux fonctions altérées des CMLs vasculaires observées dans des conditions pathologiques. L'objectif général de cette étude était de caractériser et d'évaluer le rôle modulateur de l'anion superoxyde, produit par la réaction de l'hypoxanthine avec la xanthine oxidase, sur les activités de différentes voies de signalisation dans les CMLs vasculaires, et de déterminer si la sensibilité de différentes voies de signalisation à l'anion superoxyde était altérée dans l'hypertension artérielle. Le projet de ce programme de recherche était basé sur les principaux postulats suivants : (1) l'anion superoxyde pourrait affecter sélectivement la production d'inositol 1,4,5-triphosphates (IP3), de GMPc, ou d'AMPc dans les CMLs vasculaires; (2) le rôle modulateur de l'anion superoxyde pourrait être dû à une altération des interactions croisées entre différentes voies de signalisation; et (3) les anomalies observées dans les CMLs vasculaires chez le rat spontanément hypertendu (SHR) pourraient être reliées à des altérations des différentes voies de signalisation induites par l'anion superoxyde. Une production augmentée d'1P3induite par l'anion superoxyde dans les CMLs d'aorte de rat ou d'artère mésentérique en culture a été démontrée pour la première fois dans cette étude. L'anion superoxyde a augmenté la formation d'IP3d'une manière concentration-dépendante et temps-dépendante. La superoxyde dismutase (SOD), mais non la catalase, a inhibé significativement la formation d'IP3 induite par l'anion superoxyde. L'inhibition de la phospholipase C (PLC) a aboli l'effet de l'anion superoxyde sur la formation d'1P3. La génistéine et la tyrphostine A25, deux inhibiteurs de la tyrosine kinase, ont aussi inhibé significativement la formation d'IP3induite par l'anion superoxyde. L'utilisation d'anticorps anti-PLCy a atténué significativement la formation d'1P3induite par l'anion superoxyde. De plus, le taux d'expression des protéines de la PLCy a été augmenté après l'exposition des CMLs à l'anion superoxyde. Ces observations suggèrent donc que dans les CMLs vasculaires la formation d'1P3 induite par l'anion superoxyde pourrait être en grande partie secondaire à une augmentation de l'activité de la tyrosine kinase liée aux voies de signalisation de la PLCy. En ce qui concerne la voie du GMPc, l'anion superoxyde a diminué significativement les niveaux de base de GMPc et supprimé aussi l'augmentation des niveaux de GMPc induite par des stimulateurs de la guanylyl cyclase, le nitroprussiate de sodium (NPS) ou la s-nitroso-nacétylpénicillamine (SNAP). La formation d'1P3stimulée par l'anion superoxyde a été significativement inhibée par le NPS ou la SNAP, mais potentialisée de façon importante par un inhibiteur de la guanylyl cyclase l'ODQ ou par le KT5823 (un inhibiteur de la protéine kinase dépendant du GMPc). Cependant, l'anion superoxyde n'a pas eu d'effet sur les niveaux de base d'AMPc ou sur la production d'AMPc induite par la forskoline et de plus, l'inhibition de l'adénylyl cyclase ou de la protéine kinase dépendante de l'AMPe n'a pas affecté la formation d'lP3stimulée par l'anion superoxyde. Ces données, par conséquent, suggèrent que l'inhibition de la formation de GMPc par l'anion superoxyde contribue probablement à l'activation de la formation d'1P3induite par l'anion superoxyde en atténuant le rétrocontrôle inhibiteur du GMPc sur les voies de signalisation liées à la PLC, tandis que la voie de signalisation de l'AMPc ne serait pas impliquée dans la formation d'EP3induite par l'anion superoxyde. Dans les CMLs vasculaires de rat SHR, les effets de l'anion superoxyde ont été plus puissants que dans les CMLs de rat WKY, en ce qui concerne l'augmentation de formation d'1P3, la diminution des taux de GMPc et la facilitation induite par l'anion superoxyde des interactions croisées entre les voies du GMPc et de 1'IP3. Dans les CMLs vasculaires des deux souches de rat, la formation d'IP3induite par l'anion superoxyde a été inhibée par une variété d'antioxydants, dont la N-acétylcystéine, l'acide a-lipoïque, la mélatonine et la SOD. Il apparaît donc vraisemblable que l'hypersensibilité à l'anion superoxyde des voies de 1'IP3et du GMPc puissent contribuer à l'augmentation du tonus vasculaire et de la réactivité des CMLs dans l'hypertension artérielle. Nous avons aussi investigué si l'effet de la mélatonine était dû à ses propriétés antioxydantes. Un effet inhibiteur plus important de la mélatonine sur la contraction aortique induite par la norépinéphrine (NE) a été observé chez les rats SHR en comparaison avec les rats Wistar-Kyoto (WKY). L'inhibition par la mélatonine de la formation d'IP induite par la NE a été aussi plus importante dans les CMLs aortiques de rat SHR que dans celles de rat WKY. Les effets plus puissants de la mélatonine chez le rat SHR, qui ont été aussi observés avec la SOD, mais non avec la catalase, ne sont pas dûs à l'activation des récepteurs à la mélatonine ou des récepteurs a-adrénergiques. Ces résultats indiquent que les effets anti-hypertenseurs de la mélatonine sont largement dûs à l'inactivation de l'anion superoxyde, et que les niveaux endogènes d' antioxydants ne parviennent pas à contrecarrer les niveaux accrus d'anion superoxyde produits chez le rat SHR. En conclusion, cette étude révèle une variété de nouveaux mécanismes de signalisation de l'anion superoxyde. Pour la première fois, il a été démontré que l'anion superoxyde active l'hydrolyse des phosphoinositides et augmente les taux d'IP3dans les CMLs vasculaires, principalement par la stimulation de la tyrosine kinase liée à la voie de signalisation de la PLCy. Il a aussi été observé que l'anion superoxyde réduit la formation de GMPc et supprime l'inhibition croisée de 1'1P3par le GMPc, facilitant ainsi la formation d'1P3. Les effets sélectifs de l'anion superoxyde sur les voies de 1'IP3et du GMPc, ainsi que l'existence d'une inhibition croisée de la formation d'1P3par la voie du GMPc, révèlent des mécanismes nouveaux pour expliquer le rôle modulateur de l'anion superoxyde sur les voies de signalisation dans les CMLs. Par conséquent, les effets plus puissants de l'anion superoxyde sur la signalisation de la voie de 1'IP3et de la voie du GMPc dans les CMLs vasculaires de rat SHR, effets qui ont été démontrés pour la première fois dans cette étude, pourraient être responsables des altérations des mécanismes de transduction du signal cellulaire chez le rat SHR et ainsi contribuer au développement et/ou au maintien de l'hypertension artérielle. Ces observations permettent donc d'imaginer de nouvelles orientations pour le développement de nouvelles stratégies pour la prévention ou le traitement de l'hypertension artérielle. / Superoxide anion can act as a signalling molecule or a detrimental factor depending on its concentration, the targeted organ, and the presence of counteracting antioxidants. The effects of superoxide on different signal transduction pathways and on the cross-talk interactions among these pathways in vascular smooth muscle cells (SMCs) are presently still unsettled. Therefore, a better knowledge on the effects of superoxide on different signalling pathways may provide a better understanding of the mechanisms underlying the altered functions in vascular SMCs observed in pathological conditions. The general objective of this study was to characterize and evaluate the modulating role of superoxide generated by the hypoxanthine and xanthine oxidase reaction on the activities of different signalling pathways in vascular SMCs and to investigate whether the sensitivities of different signalling pathways to superoxide were altered in hypertension. The design of the present research program was based on the following major postulates. (1) superoxide might selectively affect the generation of inositol 1,4,5-triphosphates (IP3), cGMP, or cAMP in vascular SMCs; (2) the modulating role of superoxide might be mediated by alteration in the cross-talk interactions among different signalling pathways; and (3) the abnormalities observed in vascular SMCs from spontaneously hypertensive rats (SHR) might be related to the alterations induced by superoxide on different signalling pathways. An enhanced production of 1P3induced by superoxide in cultured SMCs from rat aorta or mesenteric artery was demonstrated, for the first time, in this study. Superoxide increased 1P3 formation in a concentration- and time-dependent manner. Superoxide dismutase (SOD), but not catalase, significantly inhibited the superoxide-increased 1P3formation. The inhibition of phospholipase C (PLC) abolished the effect of superoxide on IP3formation. Genistein and tyrphostin A25, two tyrosine kinase inhibitors, also significantly inhibited the superoxideinduced IP3formation. The application of antibody against PLCI, significantly attenuated the superoxide-induced 1P3formation. Moreover, the expression level of PLC7proteins was increased after exposing SMCs to superoxide. These observations thus suggest that superoxideinduced IP3 formation may be in a great part secondary to an increase in the activity of tyrosine kinase-link PLCy signalling pathways in vascular SMCs. Concerning the cGMP pathway, superoxide significantly decreased the basal levels of cGMP and also suppressed the rise in cGMP levels induced by guanylyl cyclase stimulator sodium nitroprusside (SNP) or s-nitroso-n-acetylpenicillamine (SNAP). The superoxide-induced IP3 formation was significantly inhibited by SNP or SNAP, but markedly potentiated by a guanylyl cyclase inhibitor ODQ or KT5823 (a cGMP-dependent protein kinase inhibitor). However, superoxide had no effect on the basal levels of cAMP or the forskolin-induced cAMP production and moreover, the inhibition of adenylyl cyclase or cAMP-dependent protein kinase did not affect the superoxide-enhanced IP3formation. These data, therefore, suggest that the reduced cGMP formation by superoxide probably contributes to the superoxide induced activation of 1P3 formation by lifting the inhibitory feedback of cGMP on the PLC pathway(s), whereas, the cAMP pathway may not be involved in the superoxide-induced IP3formation. In vascular SMCs from SHR, the effects of superoxide were more potent than in SMCs from WKY, including the increase in 1P3 formation, the decrease in cGMP levels, and the superoxide-induced facilitation of the cross-talk interaction between cGMP and IP3pathways. The superoxide-induced 1P3formation was inhibited by a variety of antioxidants, including nacetylcysteine, cc-lipoic acid, melatonin and SOD, in vascular SMCs from both strains. It thus appears that the hypersensitivity of 1P3and cGMP pathways to superoxide is likely to contribute to the increased vascular tone and reactivity of SMCs in hypertension. Whether the effect of melatonin is due to its antioxidant properties was also explored. A greater inhibitory effect of melatonin on the norepinephrine (NE)-induced aortic contraction was observed in SHR than in Wistar-Kyoto rats (WKY). The inhibition of the NE-induced IP formation by melatonin was also greater in aortic SMCs from SHR than that from WKY. The enhanced effects of melatonin in SHR, which were found to be similarly enhanced with SOD but not with catalase, were not mediated by melatonin receptors or oc-adrenoceptors. These results indicate that the anti-hypertensive effects of melatonin are largely due to the scavenging of superoxide, and that the levels of endogenous antioxidants may not counteract the levels of overproduced superoxide in SHR. In conclusion, this study reveals a variety of novel signalling mechanisms for superoxide. For the first time, it was demonstrated that superoxide activates the hydrolysis of phosphoinositides and increases IP3levels in vascular SMCs mainly through the stimulation of tyrosine kinase-link PLCy signal pathway. It was also found that superoxide reduces cGMP formation and suppresses the cross-inhibition of IP3by cGMP, thus facilitating 1133formation. The selective effects of superoxide on 1133and cGMP pathways as well as the existence of a cross-inhibition of IP3formation by cGMP pathway provide novel mechanisms for the signalling role of superoxide in vascular SMCs. Therefore, the altered signalling effects of superoxide on the IP3pathway and the cGMP pathway, which were demonstrated in vascular SMCs from SHR for the first time in this study, could thus be responsible for the alterations in cellular signal transduction mechanisms in SHR and might contribute to the development and/or maintenance of hypertension. These observations could provide new avenues for the development of new strategies for the prevention or treatment of hypertension.