Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a inibição da síntese de NO por período de tempo prolongado reduz o recrutamento de leucócitos para focos inflamatórios, dependente, pelo menos em parte, da inibição da interação leucócito-endotélio e da expressão de L-selectina. 0 presente trabalho visou complementar os estudos sobre os mecanismos envolvidos nesta ação antiinflamatória. Para tanto, ratos Wistar machos (180 a 220g) receberam L-NAME (20mg/Kg; v.o.; 14 dias) ou água pela mesma via e período de tempo. Foi avaliada a atividade das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) no tecido cerebral por radioimunoensaio; o recrutamento leucocitário para cavidade peritoneal induzido pelo LPS (5mg/kg, 4 horas); as expressões de moléculas de adesão em leucócitos do sangue circulante, no músculo cremaster e nos sinusóides hepáticos por ensaios de citometria de fluxo ou imunohistoquímica; as expressões gênicas de moleculas de adesão, quantificadas por PCR e a secreção/produção de mediadores inflamatórios em leucócitos por ensaios imunoenzimáticos, reacao de Griess ou quimiluminescência. Os resultados obtidos mostraram que: 1) o tratamento com L-NAME reduziu em torno de 90% a atividade das NOS dependentes de Ca+2 em condições basais ou após estimulação in vivo com LPS; 2) as concentrações de NO no plasma e no peritônio inflamado estavam reduzidos em animais tratados com L-NAME (30% vs. controles); 3) a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio inflamado estava reduzida em animais tratados com L-NAME (40% vs. controles); 4) as expressões de L-selectina e PECAM-1 em leucócitos circulantes; de PECAM-1 no endotélio do músculo cremaster e de VAP-1 no endotélio dos sinusóides hepáticos e músculo cremaster de animais tratados com L-NAME estavam reduzidas; 5) a redução na expressão de L-selectina foi dependente de inibição de sua síntese; 6) a concentração de IL-10 estava major no soro de animais tratados com L-NAME em relação aos controles; 7) a maior concentração de IL-10 circulante pode refletir a produção desta citocina por leucócitos na circulação, uma vez que a concentração de IL-10 também estava maior no sobrenadante de leucócitos circulantes de animais tratados com L-NAME; 8) concentrações reduzidas de IL-1β e LTB4 foram detectadas nos sobrenadantes de neutrófilos obtidos de animais tratados com L-NAME; 9) macrófagos obtidos de animais tratados com L-NAME produziram maiores concentrações de IL-1β, TNF-α e IL-6, e menores concentrações de IL-10 na ausência de estimulação; na vigência estimulação in vitro com LPS os macrófagos de animais tratados com L-NAME produziram menores concentrações de NO. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o tratamento com L-NAME por período prolongado de tempo inibe a atividade das NOS dependentes de Ca+2 e nesta condição reduz as concentrações de NO circulante e no foco da inflamação, além de inibir a migração de leucócitos para o foco inflamatório, confirmando propriedades pro-inflamatórias do NO. Os mecanismos envolvidos na inibição da migração celular parecem compreender a modulação da expressão e/ou síntese das moléculas de adesão constitutivas expressas em leucócitos e no endotélio, além da modulação da secreção de mediadores pró ou antiinflamatórios em leucócitos circulantes e neutrófilos. Por outro lado, os efeitos do tratamento com L-NAME sobre a secreção de mediadores químicos por macrófagos induzem a secreção destes e corroboram a dualidade dos efeitos do NO no processo de recrutamento celular. / Our previous results have demonstrated that in vivo chronic inhibition of nitric oxide synthesis reduces leukocyte recruitment into inflammatory focus, dependent, at least in part, on impaired leukocyte-endothelial interactions and expression of L-selectin. This study aimed to clarify the mechanisms involved in the reduced leukocyte migration observed in L-NAME-treated rats. For this purpose, male Wistar rats (180-220g) were treated with L-NAME (20 mg/kg, oral route, 14 days, dissolved in drinking water); controls animals received water by the same route and period of time. The effectiveness of L-NAME treatment was investigated by examining the activity of nitric oxide synthases (NOS) in the brain tissue using radioimmunoassay. In addition, effects of L-NAME treatment were evaluated in LPS-induced leukocyte recruitment into peritoneal cavity (5mg/kg, 4 hours); expression of adhesion molecules was determined in circulating leukocytes, cremaster muscle and liver sinusoids by flow cytometry and immunohistochemistry assay; gene expressions of adhesion molecules were quantified by PCR and leukocyte secretion of inflammatory mediators was measured by immunoenzimatics assays, Griess reaction or chemiluminescence. Our results show that: 1) L-NAME treatment reduced, around 90%, Ca+2 - dependent NOS activity in the presence or not of in vivo inflammation; 2) concentrations of NO in the plasma and into inflamed peritoneum were reduced in L-NAME-treated animals (30% vs. control animals); 3) migration of PMN leukocytes into inflammed peritoneum was impaired in L-NAME-treated rats (40% vs. control animals); 4) expressions of L-selectin and PECAM-1 in circulating leukocytes, PECAM-1 in endothelium from cremaster muscle and VAP-1 in endothelium from liver sinusoids and cremaster muscle were reduced in L-NAME-treated rats; 5) decrease in L-selectin expression was dependent on inhibition of its synthesis; 6) concentrations of IL-10 was higher in serum from L-NAME-treated rats in comparison to control rats; 7) these higher concentrations of circulating IL-10 can reflect the production of this cytokine by leukocytes from circulation, as IL-10 levels was greater in the supernatant of circulating leukocytes obtained from L-NAME-treated animals; 8) L-NAME treatment disturbed neutrophils ability to secrete IL-1β e LTB4, since these concentrations were lower in the supernatants of neutrophils from L-NAME-treated animals; 9) in absence of stimulation, macrophages obtained from L-NAME-treated rats produced higher concentrations of IL-1β, TNF-α e IL-6, and lower concentrations of IL-10, whereas in presence of in vitro LPS these cells produced lower concentrations of NO. Taken together, our results show that L-NAME treatment administrated for a prolonged period of time inhibits Ca+2 -dependent NOS activity, and in this condition, reduces concentrations of NO in plasma and into inflammatory focus and decreases leukocyte migration to the inflammatory focus thus confirming pro-inflammatory properties of NO. The mechanisms involved in impaired cellular migration seem to involve the modulation of expression and/or synthesis of constitutive adhesion molecules in leukocytes and endothelium, and to interfere in the secretion of pro or anti inflammatory mediators. On the other hand, actions of NO in secreation of chemical mediators by macrophages induces the production of inflammatory mediators and support the duality of NO in the cellular recruitment process.

A tuberculose permanece como um dos maiores problemas de saúde pública mundial. O diagnóstico precoce e o tratamento rápido e eficiente dos indivíduos com tuberculose pulmonar ativa são medidas essenciais para a redução da morbidade, mortalidade e da incidência da tuberculose no mundo. As limitações encontradas nos métodos microbiológicos tradicionais, fizeram com que metodologias alternativas fossem desenvolvidas para melhorar o diagnóstico e o prognóstico da tuberculose humana. Neste trabalho verificamos o desempenho diagnóstico do Western blotting para pesquisa de anticorpos IgG anti - Mycobacterium tuberculosis, a utilização do teste QuantiFERON® - TB Gold e a detecção de moléculas de adesão celular (ICAM-1 e selectinas) como marcadores de prognóstico. Foram acompanhados até o final do tratamento 31 pacientes com tuberculose pulmonar diagnosticados por critérios clínicos e laboratoriais. Como controles, selecionamos população de indivíduos sadios, doadores de banco de sangue e indivíduos com outras pneumopatias. Os resultados mostraram que o Western blotting apresentou sensibilidade de 94% e especificidade de 96% no diagnóstico da tuberculose pulmonar, atendendo os requisitos da OMS para testes sorológicos. O QuantiFERON® - TB Gold apresentou sensibilidade de 83% e especificidade de 100%, após ajuste do limiar de reatividade. Os resultados das moléculas de adesão celular sugerem potencial para serem utilizadas como marcadores de prognóstico da doença. Ao associarmos os resultados do Western blotting ou do QuantiFERON® - TB Gold com a baciloscopia obtivemos sensibilidade superior a 95%; e quando associados à cultura a sensibilidade encontrada foi de 100%. O Western blotting mostrou ser uma ferramenta útil como auxiliar no diagnóstico da tuberculose pulmonar mesmo em pacientes com baciloscopia negativa. / Tuberculosis remains a major public-health problem. Rapid diagnosis and prompt treatment is the cornerstone to reduce morbidity, mortality and incidence of tuberculosis in the world. Alternative methods have been developed to overcome the limitations presented by conventional microbiological methods and to improve the diagnosis and prognosis of tuberculosis. In this study we verified the diagnostic performance of Western blotting for IgG anti-M.tuberculosis antibodies detection, QuantiFERON® - TB Gold and circulating adhesion molecules (ICAM-1 and Selectins) as prognosis markers. Thirty-one patients were followed-up during the treatment. Active pulmonary tuberculosis was diagnosed by clinical and laboratorial criteria. As group control healthy individuals, blood donors and patients with other lung diseases were included. Western blotting results showed a high performance with sensitivity of 94% and specificity of 96% for the diagnosis of pulmonary tuberculosis, attending WHO requirements for serological tests. After adjusting the threshold, QuantiFERON® - TB Gold showed sensitivity of 83% and specificity of 100%. The results of adhesion molecules suggested potential to use the test as prognosis markers. Combining Western blotting or QuantiFERON® - TB Gold with acid-fast bacilli (AFB) smear results, the overall sensitivity increase to more than 95%, and when combined with culture the overall sensitivity was 100%. Together, these findings, suggest that Western blotting could be a very useful supplementary tool for pulmonary tuberculosis, especially in patients with AFB smear negative.

Diversos estudos têm sugerido uma ação anti-inflamatória para o antidepressivo amitriptilina; a presente investigação pretende analisar os mecanismos envolvidos com esta resposta. Mais especificamente, o objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da amitriptilina sobre a resposta inflamatória induzida pela carragenina em ratos e investigar os prováveis mecanismos relacionados a estes efeitos. Num primeiro momento, utilizando-se o modelo do edema de pata induzido pela carragenina, avaliamos o efeito anti-inflamatório da amitriptilina após administração em diferentes doses e intervalos de tempo, isto é, de forma aguda ou em múltiplas doses, por diferentes vias de administração. Verificamos que o tratamento com amitriptilina 10mg/kg, administrada a cada tempo de meia-vida de eliminação, produziu redução significante do edema de pata nos diversos tempos avaliados. Não houve reversão deste efeito anti-inflamatório quando os animais foram pré-tratados com um antagonista de receptores de glicocorticoides (RU-486); houve potencialização do efeito anti-inflamatório pelo pré-tratamento com antagonista de receptores alfa-1-adrenérgicos (prazosina). A administração de amitriptilina juntamente com um inibidor inespecífico de síntese de óxido nítrico (L-NAME) levou a uma potencialização do efeito anti-inflamatório avaliado pelo modelo do edema de pata; produziu, ainda, uma redução significante na concentração de leucócitos e no número total de leucócitos do exsudato peritoneal induzido por carragenina e uma redução significante do total de nitratos circulantes, quando comparados aos animais do grupo controle. Este efeito anti-inflamatório avaliado pelo edema de pata não foi revertido pela administração de um precursor da síntese de NO. O tratamento com amitriptilina ou L-NAME isoladamente ou em conjunto não produziu alterações significantes na expressão das moléculas de adesão ICAM-1, PECAM-1, L-selectina e MAC-1 por leucócitos do sangue periférico. Quando avaliamos o comportamento dos leucócitos por microscopia intravital, observamos que a amitriptilina produziu uma redução significante no rolamento, adesão e transmigração de leucócitos avaliados em condição inflamatória. A administração de amitriptilina isoladamente ou em conjunto com L-NAME também mostrou produzir redução significante nos níveis de IL-1beta e TNF-alfa no soro de ratos. Podemos assim concluir que a amitriptilina apresentou um efeito anti-inflamatório na maioria dos modelos avaliados. Os mecanismos parecem envolver a participação dos receptores alfa-1-adrenérgicos, a inibição da NOS - com consequente redução na síntese de NO e das ações próinflamatórias a ele associadas - e a diminuição nos níveis das citocinas IL-1beta e TNF-alfa. Considerando-se a teoria que implica a depressão como um fenômeno inflamatório, a compreensão dos mecanismos envolvidos no efeito anti-inflamatório da amitriptilina poderia contribuir nas investigações envolvendo esta teoria / Several studies have suggested an anti-inflammatory action to the antidepressant amitriptyline; the present investigation intend to analyze the mechanisms involved in this response. More specifically, the objective of the present study is to evaluate the effects of amitriptyline in the carrageenan-induced inflammatory response and investigate the possible mechanisms related to these effects. At first, with the carrageenan-induced paw edema model, we evaluated the anti-inflammatory effect of amitriptyline administrated in different doses, intervals, acute or chronically, by different routes of administration. We verified that amitriptyline 10mg/kg, administrated each elimination half-life, produced a significant reduction on paw edema in several times evaluated. It was not reverted with the pretreatment with an glicocorticoid antagonist (RU-486); it was potentiated with the pretreatment with an alpha-1- antagonist (prazosin). The co-administration of amitriptyline and an unspecific inhibitor of nitric oxide synthesis (L-NAME) produced a potentialization of the anti-inflammatory effect, evaluated in the paw edema model, a decrease in the leukocyte concentration and total number in the carrageenan-induced peritoneal exsudate and a significant reduction in the total serum nitrate, when compared to the control group. This anti-inflammatory effect evaluated by the paw edema was not reverted with a NO precursor administration. The only amitriptyline or L-NAME treatment didnt produce significant alterations in the adhesion molecules expression ICAM-1, PECAM-1, L-selectin e MAC-1 by leukocytes of the peripheral blood. When the leukocyte behavior was evaluated by intravital microscopy, we verified that amitriptyline produced significant reduction in the rolling, adhesion and transmigration of leukocytes evaluate in inflammatory condition. Amitriptyline and/or L-NAME administration produced a significant reduction on IL-1beta and TNF-alpha levels in rats serum. We may conclude that amitriptyline presented an anti-inflammatory effect in the most models evaluated. Mechanisms seem to involve alpha-1-adrenergic receptors, NOS inhibition - and consequent reduction in NO synthesis and its proinflammmatory actions - and reduction on cytokines IL-1beta and TNF-alpha levels. Considering the theory that implicates depression as an inflammatory phenomenon, the comprehension of the anti-inflammatory effects of amitriptyline could contribute in the investigations about this theory

Introdução: As moléculas de adesão celular (MAC) participam da interação entre o epitélio e a matriz extracelular (MEC) que são importantes para o desenvolvimento normal da célula. Alguns estudos têm revelado que alterações na expressão das MAC têm implicações no processo de carcinogênese. Nosso objetivo foi estudar a influencia da expressão da E-caderina e cateninas por imuno-histoquímica (IH) na previsão prognóstica de pacientes com carcinoma urotelial do trato urinário superior submetidos à cirurgia. Material e métodos: Avaliamos os espécimes de 20 pacientes com carcinoma urotelial da pelve renal e ureter tratados com nefroureterectomia ou ureterectomia com intenção curativa entre junho de 1997 e janeiro de 2007, todas realizadas pelo mesmo cirurgião (MS). A expressão das MAC foi avaliada através de IH pela técnica de microarranjo tecidual ou tissue microarray (TMA), e correlacionada com as características anatomopatológicas do tumor e sobrevida dos pacientes Resultados: Observamos uma relação entre a expressão de E-caderina com a recidiva da doença. Dos tumores com expressão forte de E-caderina, 85,7% sofreram recidiva contra 50,0% daqueles com moderada expressão (p=0,014). Também houve diferença na sobrevida livre de doença, sendo que aqueles com expressão forte evidenciaram media de sobrevida livre de doença de 49,1 meses, enquanto aqueles com expressão moderada ou ausente sofreram média de 83,9 meses (p=0,011). A ausência de expressão de -catenina se relacionou com maior frequência de tumores com mais de 3cm (p=0,003). Conclusões: Demonstramos que a imuno-expressão da E-caderina e - catenina estão relacionadas com recidiva e tamanho tumoral no carcinoma urotelial do trato urinário alto, podendo constituir novos marcadores prognósticos nessa neoplasia / Introduction: The cell adhesion molecules (CAM) participating in the interaction between epithelium and extracellular matrix (ECM) that are important for normal development of the cell. Some studies have shown that changes in the expression of CAM have implications in the process of carcinogenesis. We studied the E-cadherin and catenins expression profile by immunohistochemistry in patients with urothelial carcinoma of upper urinary tract underwent surgery. Materials and Methods: We evaluated specimens from 20 patients with urothelial carcinoma of renal pelvis and ureter treated with nephroureterectomy or ureterectomy between June 1997 and January 2007, all performed by one surgeon (MS). The expression of CAM was evaluated by tissue microarray technique (TMA). Results: We observed a relation between E-cadherin expression with disease recurrence. Tumors with strong expression of E-cadherin, 85.7% recurrence compared to 50.0% of those with moderate expression and 0.0% with weak expression (p = 0.014). There was also a difference in disease-free survival, and those with strong expression recurrence a median time of 49.1 months while those with moderate expression recurrence a median time of 83.9 months (p = 0.011). The absence of -catenin expression was associated with tumors larger than 3 cm (p = 0.003). Conclusions: We demonstrate that the immuno-expression of E-cadherin and -catenin are related to recurrence and tumor size in urothelial carcinoma of upper urinary tract, may be new prognostic markers in these disease

A jararagina, isolada do veneno de Bothrops jararaca, possui efeito pró-inflamatório caracterizado por edema, liberação de citocinas e migração celular. Neste estudo, demonstramos o aumento na expressão gênica da quimiocina IL-8, moléculas de adesão (E-Selectina, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, Angiopoetina-2 e MMP-10 em HUVECs estimuladas com jararagina. Também investigamos o efeito da jararagina na expressão protéica de moléculas de adesão e da quimiocina IL-8. A molécula de adesão PECAM-1 foi expressa na superfície das HUVECs em todos os tratamentos e intervalos de tempo analisados. Entretanto não observamos aumento da expressão de E-selectina e VCAM-1 após estímulo com a jararagina. A jararagina também não induziu a liberação de IL-8. Nossos resultados sugerem que a jararagina se liga nas células endoteliais, mas o receptor celular envolvido neste efeito ainda não está claro. Este trabalho contribui com a literatura na medida em que elucida a participação de importantes genes dentro do contexto inflamatório desencadeado pela jararagina em células endoteliais. / Jararhagin, from Bothrops jararaca venom, causes a local reaction manifested by edema, cytokine release and inflammatory cells recruitment. In this study we evaluated by real time PCR the expression of 9 genes involved in inflammatory response, triggered by jararhagin in HUVECs. Our results showed a significant increase in the gene expression of chemokine IL-8, adhesion molecules (E-selectin, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, angiopoietin-2 and MMP-10. We also investigated the effect of jararhagin on expression of adhesion molecules in the surface of HUVECs by flow cytometry. We did not observe increased expression of E-selectin and VCAM-1 molecules on the surface of HUVECs compared with control. Jararhagin did not increase the release of soluble chemokine IL-8 in HUVECs supernatant. Our results suggest that jararhagin binds to endothelial cells, but the cellular receptor involved in this effect remains unclear. This work contributes to the literature highlighting the participation of important genes within the inflammatory context triggered by jararhagin on endothelial cells.

Introdução: O câncer de bexiga é a quinta neoplasia mais comumente diagnosticada no Ocidente, acometendo cerca de 336.000 novos indivíduos anualmente e levando a morte 132.000 pacientes em todo o mundo. No Brasil, a incidência de tumores vesicais para o ano de 1999 foi de 7.550, representando 2,8% do total de casos novos de câncer diagnosticados em ambos os sexos. Um dos grandes desafios terapêuticos para o câncer de bexiga é a identificação dos pacientes que inicialmente apresentam carcinoma papilífero de baixo grau, mas que irão recorrer ou progredir. Métodos: Neste estudo retrospectivo 64 pacientes foram avaliados por imunohistoquímica para a análise da expressão de E-caderina e β-catenina. As marcações foram classificadas como focal ou difusa e categorizadas em negativo, fraco, moderado e forte. Os resultados foram correlacionados com grau histológico, estadiamento clínico, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de recidiva. O polimorfismo de ninjurin 1 foi genotipado por PCR-RFLP em 66 pacientes e 108 controles. Os genótipos foram correlacionados com grau histológico, estadiamento clínico, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de recidiva. Resultados: Em nossa casuística padrões mais intensos de imuno-expressão de Ecaderina foram estatisticamente associados a estádios clínicos mais avançados para carcinomas uroteliais da bexiga (p=0,005), além de menores tempos de recidiva (0,025) e progressão (0,049). O padrão de marcação difuso foi associado de forma estatisticamente significativa a estádios clínicos mais avançados (p=0,010). Não foram encontradas associações significativas entre os padrões de imuno-expressão de β-catenina com grau histológico, estádio tumoral, recidiva ou progressão dos carcinomas uroteliais da bexiga. O alelo C do polimorfismo D110A de ninjurin 1 foi associado de forma estatisticamente significativa, em nossa amostra, com o aumento do grau histológico (p=0,041). Pacientes portadores do alelo C de ninjurin 1 apresentaram menores períodos para progressão tumoral quando comparados aos homozigotos AA (p=0,010). Conclusão: Nossos resultados sugerem que a expressão de E-caderina está envolvida nos processos tumorigênese do carcinoma urotelial de bexiga e que o polimorfismo D110A de ninjurin 1 pode participar da modulação desta patologia. / Introduction: Bladder cancer is the fifth neoplasm in Western countries, whose occurrence is 336,000 new cases annually, and also being responsible for 132,000 deaths in the worldwide. The incidence of bladder tumors in Brazil were 7,550 cases in 1999, representing 2,8% of overall diagnosed cancer in both gender. One of the main therapeutic challenges is identify which patients that present low grades neoplasms will present recurrence and/or progression. Methods: Sixty four patients were evaluated for E-cadherin e β-catenin immunoexpression in a retrospective study. The staining patterns were classified as focal or difuse and categorized as negative, weak, moderate or strong. Results were correlated with tumor grade, clinical stage, progression and recurrence free survival. Ninjurin 1 polymorphism was evaluated by PCR-RFLP in 66 patients and 108 controls. Genotypes were correlated with tumor grade, clinical stage, progression and recurrence free survival. Results: E-cadherin moderate and strong staining patterns were significantly associated with high clinical stages of urothelial carcinoma of bladder (p=0.005), and short recurrence (p=0.025) and progression (p=0.049). Difuse staining pattern were significantly associated with high clinical stages (p=0.010). Neither histological grade, clinical stages, recurrence and progression free survival were associated with β-catenin staining patters in our samples of urothelial carcinoma of bladder. The allele C of D110A ninjurin 1 polymorphism was significantly associated with high grade tumors (p=0.041). C carries patients compared with AA homozygous presented short disease progression (p=0.010). Conclusion: Our results suggest that E-cadherin expression is involved in urothelial carcinoma of bladder tumorigenesis and that D110A ninjurin 1 polymorphism may contribute to modulate this pathology.

Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularmente conhecida como \"marcela\", é utilizada popularmente para tratar diversas doenças, como mal estar gástrico e intestinal, inflamações, diabetes e outros. Como os mecanismos de ação do extrato de A. satureoides ainda não são conhecidos, o presente trabalho visou esclarecer os mecanismos antiinflamatórios do extrato bruto hidroalcoólico das inflorescências de A. satureoides, focando na migração e função fagocítica e microbicida de neutrófilos. Para tanto, o extrato hidroalcoólico foi administrado por gavage (50, 100 e 250mg/kg) em ratos Wistar, machos, adultos, e a inflamação foi induzida pela injeção do lipopolisacarídeo de E. coli (LPS; 2mL de solução; 500 µg/mL em PBS) no tecido subcutâneo dorsal (modelo da bolsa de ar). Animais controles receberam volumes equivalentes de veículo do extrato e indometacina (30mg/kg). Foram quantificados o número de neutrófilos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico) e a concentração de Leucotrieno B4 e CINC-1 (ELISA) no foco de lesão; a interação leucócito-endotélio em vênulas da microcirculação mesentérica após estímulo in situ pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS; 30µg/40µL; por microscopia intravital); a expressão de moléculas de adesão e do toll-like receptor (TLR-4), além da quantificação do burst oxidativo (induzido pelo miristato-acetato de forbol - PMA) e fagocitose em neutrófilos circulantes (citometria de fluxo); análise histológica e quantificação dos marcadores hepáticos (AST, ALT e Gama-GT) e renais (uréia e creatinina) no plasma por espectrofotometria. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com o extrato reduziu o número de neutrófilos e a concentração de LTB4 e CINC-1 na bolsa de ar; reduziu a expressão de TLR4 pelos neutrófilos circulantes e a porcentagem de neutrófilos positivos para L-selectina e β2-integrina; inibiu a adesão e o comportamento rolling de leucócitos ao endotélio microvascular; reduziu o burst induzido por PMA; aumentou o potencial de fagocitose, sem alterar o burst induzido por Staphylococcus aureus, não alterou a morfologia tecidual e a concentração sérica dos marcadores de atividade hepática e renal. Em conjunto, os dados obtidos mostram que dose, aparentemente, não tóxica do extrato de A. satureoides exerce efeito antiinflamatório in vivo frente ao LPS, quantificados pela redução da migração e pelas interferências nas atividades fagocítica e microbicida dos neutrófilos. / Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularly known as \"marcela\", is popularly used to treat several diseases, such as gastric and intestinal disorders, inflammation, diabetes and others. As the mechanisms of the extract of A. satureoides have not been elucidated, this study aimed to investigate the anti-inflammatory mechanisms of the crude hydroalcoholic extract of the flowers of A. satureoides, focusing on migration and phagocytic and microbicidal neutrophils function. The hydroalcoholic extract was administered by gavage (50, 100 and 250mg/kg) into male Wistar rats, adult, and inflammation was induced by injection of lipopolysaccharide E. coli (LPS; 2 mL of solution; 500µg/mL in PBS) into the dorsal subcutaneous tissue (air pouch model). Control animals received equivalent volume of extract vehicle or indomethacin solution (30mg/kg). It was quantified the numbers of neutrophils (Neubauer chamber and stained smears by Panoptic) and concentrations of leukotriene B4 (LTB4) and CINC-1 (ELISA) in the focus of the injury; the leukocyte-endothelium interactions in mesenteric venules of the microcirculation after stimulation by LPS (30µg/40µL; intravital microscopy); the adhesion molecules and toll-like receptor (TLR-4) expressions and quantification of oxidative burst and phagocytosis in circulating neutrophils (flow cytometry); histological analysis and the hepatic markers (AST, ALT and gamma-GT) and kidney (urea and creatinine) concentrations in plasma by spectrophotometry. Data obtained showed that the treatment reduced the numbers of neutrophils and concentrations of LTB4 and CINC-1 in the subcutaneous tissue; reduced the TLR4 expression by circulating neutrophils and the number of β2-integrin- and L-selectin-positive neutrophils; inhibited the leukocyte adhesion and the rolling behavior to vascular endothelium; reduced the burst evoked by PMA; increased the phagocytosis without changing the burst induced by Staphylococcus aureus; and did not alter the tissue morphology and concentration of hepatic and renal enzymes in the serum. Together, these data suggest that dose, apparently non-toxic, of extract of A. satureoides exerts anti-inflammatory effect in vivo, quantified by the reduced migration and by interference in the phagocytic and microbicidal activities of neutrophils.

Os glicocorticóides endógenos (GCen) são moduladores importantes das reações inflamatórias, com papel em diferentes aspectos do processos. Neste contexto, tem sido demonstrado que os GCen controlam a migração de leucócitos para os focos de lesões, e um dos mecanismos propostos tem sido o efeito inibitório sobre os fenômenos de interação leucócito-endotélio. Uma vez que as moléculas de adesão medeiam os processos de interação celular, tem sido evidenciado que os GCen controlam, direta ou indiretamente, a expressão destes receptores nas membranas celulares na vigência de estresse de diferentes origens. No entanto, a literatura ainda é fragmentária e controversa quanto aos mecanismos exatos desta interferência. Desta forma, este trabalho tem por objetivo investigar o papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas na interação leucócito-endotélio, e os possíveis mecanismos intracelulares responsáveis pelos efeitos. A deficiência de GCen foi induzida em ratos Wistar machos, adultos por adrenalectomia bilateral. A participação de receptores de glicocorticoides (GC) foi avaliada em ratos normais tratados com o antagonista RU 38486. Animais falso-operados (FO), ou normais (N) foram empregados como controles. A deficiência hormonal foi constatada pela dosagem de corticosterona plasmática por radioimunoensaio e demonstraram valores significativamente baixos em animais adrenalectomizados (ADR). Ensaios de microscopia intravital mostraram que aumento exacerbado de leucócitos em comportamento \"rolling\" em vênulas pós-capilares de animais adrenalectomizados (ADR) não reflete alterações hemodinâmicas, uma vez que a deficiência hormonal não provocou modificações no diâmetro ou fluxo sangüíneo de vasos da microcirculação do músculo cremaster. No entanto, a determinação da expressão de moléculas de adesão em leucócitos circulantes por citometria de fluxo mostrou que neutrófilos de animais ADR apresentaram maior expressão de L-selectina que células de animais controles. Por outro lado, a expressão de L-selectina em granulócitos maduros presentes na medula óssea de animais ADR estava diminuída em comparação com células de animais controles. Este efeito pode estar envolvido com a maturação acelerada destas células na medula e com a neutrofilia detectada em animais ADR. É importante salientar que a estimulação de polimorfonucleares (PMN), coletados tanto do sangue como da medula, com fMLP mostrou que estas células estavam aptas a aumentar a expressão da molécula, indicando que as alterações nas suas expressões em animais ADR não são dependentes de modificações na capacidade de síntese. Adicionalmente, a ação dos GCen sobre a expressão de L-selectina parece não depender do GC, já que animais normais tratados com RU 38486 não apresentaram o mesmo padrão de alteração observada em animais ADR. Com o intuito de identificar os efeitos dos GCen sobre a capacidade individual de aderência do endotélio e do neutrófilo, ensaio de aderência in vitro foram realizados com cultura primária de célula endotelial (CE) obtida do músculo cremaster e com neutrófilos coletados da aorta abdominal. Os dados obtidos mostraram que menor número de PMN provenientes de animais ADR aderiram à CE de animal normal, mas por outro lado, a maior número de PMN de animais controles aderiram à CE de animais ADR. Em conjunto, estes dados indicam um controle diferente dos GCen sobre as células envolvidas no processo: facilitam a aderência de PMN e diminuem a aderência da CE. A investigação do papel dos GCen sobre a expressão de moléculas de adesão envolvidas no processo mostrou que os hormônios não interferem com a expressão basal de β2 integrina nos leucócitos, tanto nos circulantes quanto nos da medula. Adicionalmente, os dados de imunohistoquímica indicaram que os GCen modulam a expressão de moléculas responsáveis pela aderência. A expressão de ICAM-1 e PECAM-1 é significativamente maior no endotélio de vênulas de animais ADR que de animais controles. Associados, os dados aqui obtidos em animais ADR indicam um papel diferente dos CCen sobre a interação leucócito-endotélio. A modulação sobre a expressão de L-selectina pode estar envolvida na mobilização de neutrófilos para circulação e no comportamento rolling destas células. A subseqüente aderência dos leucócitos ao endotélio parece ser dependente de ações sobre a célula endotelial, através da modulação da expressão de moléculas da superfamília das imunoglobulinas. / The endogenous glucocorticoids (GCen) are important modulators of inflammatory reactions, acting in different aspects of the processes. In this context, it has been shown that GCen control leukocyte migration into focus of injuries, and one proposed mechanism of action is the modulation on leukocyte-endothelium interactions. Since adhesion molecules mediate cellular interactions, it has been evidenced that GCen control, direct or indirectly, the expression of these receptors on the cellular membranes during different stress conditions. However, data described in the literature are fragmentary and controversial. Then, the aim of this work was to investigate the role of the GCen on expressions of adhesion molecules involved in leukocyte-endothelium interactions and the possible intracellular mechanisms responsible for the effects. Adult male Wistar rats were submitted to bilateral adrenalectomy to induce adrenal hormone deficiency. The participation of glucocorticoid cytosolic receptor (GC) on the effects was evaluated in rats pre-treated with the glucocorticoid receptor antagonist RU 38 486. Sham-operated or normal rats were used as control. The hormone deficiency was assessed by quantification the plasmatic corticosterone by radioimmunoassay. Data showed marked lower values in adrenalectomized (ADR) than control rats. Intravital microscopy assays showed that the higher number of roller leukocytes in the postcapillary venules from cremaster muscle from ADR animals does not reflect hemodynamic alterations, given that hormonal deficiency did not modify the diameter or blood flow of microcirculation vessels. However, the determination of adhesion molecule expressions on circulating leukocytes by flow cytometry assay showed that neutrophils from ADR animals presented higher expression of L-selectin than cells from control animals. On the other hand, the expression of L-selectin on membranes of mature granulocytes in the bone marrow was decreased on cells from ADR rats. Together, these data suggest that modulation on L-selectin expression may be important target point of GE control and it may participate of the accelerated maturation of segmented cells in bone marrow, neutrophilia and in the elevated number of rolling leukocytes detected in ADR animals. It is important to emphasize that alterations on L-selectin expression on cells from ADR rats seem do not reflect an inability of its synthesis, since its expression after in vitro fMLP (formyl-Met-Leu-Phe) stimulation was not modified by hormonal deficiency. Additionally, the effect on L-selectin expression on circulating neutrophils may not be depend on the GC, since normal animal treated with RU 38486 presented expressions of L-selectin equivalent to those found in cells from control rats. To identify the effects of hormonal deficiency on individual ability of endothelium or neutrophils adherence, in vitro adherence assay was performed using both primary cultured endothelium from cremaster muscle and neutrophils collected from abdominal aorta. The results demonstrated that lesser number of PMN collected from ADR animals adhered to normal endothelium, while higher number of normal neutrophils adhered to endothelium from ADR rats. These latter results were corroborated by quantification of adhesion molecules expressions involved on adherence process by blood flow cytometer or by immunohistochemistry. The hormonal deficiency did not modify the β2 integrin expression on leukocytes, but enhanced the ICAM-1 and PECAM-1 expression on endothelium membrane of cremaster muscle venules from ADR animals. Together data obtained in ADR animals may indicate a different role of the GE on cells during the leukocyte-endothelium interaction. The modulation on L-selectin may be involved on neutrophil delivery into circulation and on the rolling of circulating neutrophils. The subsequent adherence of leukocytes to endothelium seems to be dependent on actions on endothelial cells, through modulation of expressions of immunoglobulins superfamily molecules.

Ip Wai-Ki. / "July 2003." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (p. 261-290). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

Introdução: Caderinas e integrinas são importantes para a manutenção da integridade tecidual e transdução de sinal durante o desenvolvimento da pele. A distribuição destas moléculas no desenvolvimento da pele humana foi investigada e associada com os marcadores de diferenciação, Citoqueratinas (CK) e involucrina (INV). Método: Usando a técnica de imunoistoquímica foram investigadas as proteínas E- e P- caderinas, integrinas beta- 1 e -4, CK 10, CK 14 e INV em fragmentos de pele de várias regiões corpóreas de 7 fetos humanos (semana gestacional de 4 a 24, todos pesando até 500 g). Resultados: Na fase inicial do desenvolvimento, integrinas beta-1 e -4 and E- and P- caderinas estavam presentes na membrana plasmática das células epiteliais em todos as camadas do epitélio. CK14 e CK10 foram observadas em todas as camadas epiteliais e a INV fracamente detectada em células da camada mais superficial. Em estágios mais avançados, integrinas foram detectadas em todas as camadas epiteliais, com expressão polarizada principalmente na camada basal. E- caderina foi detctada em todas as camadas, menos no estrato cornificado e a P- caderina foi observada em camadas mais profundas do epitélio. CK14 estava presente na camada basal, CK 10 no estrato suprabasal e a INV foi observada no estrato cornificado. Conclusão: Caderinas e integrinas são essenciais para o desenvolvimento da pele, sendo espacialmente e temporalmente regulados. Suas expressões são relatas com a expressão da maturação de marcadores da epiderme. / Introduction: Cadherins and integrins are important for maintenance of tissue integrity and in signal transduction during skin development. Distribution of these molecules in human skin development was investigated and associated with markers of differentiation, cytokeratins (CK) and involucrin (INV). Methods: Using immunohistochemistry expression of E- and P- cadherins, integrins beta-1 and -4, CK10, CK 14 and INV was assessed in skin fragments of 7 human fetuses (gestacional weeks ranged from 4 to 24, all weighing up to 500 g). Results: At initial phases of development, integrins beta-1 and -4 and E- and P- cadherins were present on epithelial cell membranes in all layers. CK 14 and CK 10 were expressed in all epithelial layers and INV weakly detected in the superficial layer. In more advanced stages, integrins were detected in all layers, but a marked polarized expression was seen in basal layer. E- cadherin was detected in all layers, but the cornified stratum and P- cadherin were observed in the lower layers. CK 14 was expressed in layer, CK 10 in suprabasal stratum and INV was observed in cornified layer. Conclusions: Cadherins and integrins are essential for skin development, being spatially and temporally regulated. Their expression is related with the expression of maturation markers of the epidermis.