A prevalência de alergias vem aumentando no mundo todo, em especial a asma alérgica que é considerada uma síndrome inflamatória pulmonar, que em sua forma clássica está associada ao descontrole da atividade de células T helper (Th) 2. As terapias correntes são em sua maioria sintomáticas. Porém, a imunoterapia específica (SIT, do inglês Specific-Immunotherapy ) é potencialmente curativa. A SIT consiste na adminsitração do alérgeno específico repetidamente em doses crescentes com o objetivo de promover a dessensibilização do paciente. O presente trabalho, utilizando a ovoalbumina (OVA) como alérgeno em modelo de asma alérgica experimental, investigou protocolos profiláticos e terapêuticos de SIT. Durante a realização do protocolo profilático, os animais foram sensibilizados com OVA adsorvida em hidróxido de alumínio (Alum) associada com diferentes agonistas de receptores do tipo toll (TLR, do inglês toll-like receptors ). O agonista de TLR 9 (CpG) foi o mais eficiente em inibir a sensibilização alérgica quando comparado aos demais agonistas de TLR testados. Esta inibição do desenvolvimento da inflamação alérgica pulmonar por CpG foi dependente da molécula IL-10 e da sinalização via MyD88 nas células dendríticas. Além disso, sabendo que a SIT terapêutica, administrada pela via subcutânea é capaz de desencadear uma reação anafilática, encapsulamos a OVA em lipossoma catiônico 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-sulfato (DOTAP) com o intuito de aumentar a segurança da formulação e paralelamente potencializar o efeito do CpG. Os resultados verificaram que o encapsulamento da OVA diminuiu a reação anafilática cutânea e sistêmica induzida por este alérgeno. Verificamos também que a SIT com alérgeno/CpG encapsulados no DOTAP (OVA&#43CpG/DOTAP ou BT&#43CpG/DOTAP) promove uma significativa inibição da inflamação alérgica pulmonar e produção de IgE Total. Essa inibição da alergia pulmonar foi associada com o aumento da produção de IL-10, mas não de IFN-g no lavado bronco-alveolar (BAL). Notavelmente, o efeito terapêutico inibitório de OVA&#43CpG/DOTAP não foi verificado em animais deficientes para as moléculas de MyD88, IL-10 ou IFN-g. Verificamos que a SIT terapêutica também era dependente da sinalização via MyD88 nas células dendríticas. Além disso, ao utilizarmos animais reconstituídos com células de animais doadores alérgicos, verificamos que o efeito terapêutico da SIT não foi encontrado em animais reconstituídos com células de animais IFN-gKO, e que animais reconstituídos com células de animais IL-10KO apresentavam aumento de IL-10 no BAL. A transferência de células de medula óssea de animais C57BL/6 (WT), mas não de animais IFN-gKO, tratados com OVA&#43CpG/DOTAP foi capaz de reverter o quadro inflamatório alérgico de animais WT e induzir o aumento de IL-10 no BAL. Esses resultados contribuem para a elucidação dos mecânismos envolvidos na ação anti-inflamatória da SIT e potenciais utilizações do CpG e DOTAP em processos alérgicos. / The prevalence of allergies is increasing worldwide, especially allergic asthma that is considere a pulmonary inflammatory syndrome, which in its classic form is associated with the lack of control of T helper cell (Th) 2 activity. Current therapies are mostly symptomatic. However, specific immunotherapy (SIT) is potentially curative. SIT consists of administering the specific allergen repeatedly in increasing doses in order to promote patient desensitization. The present study, using ovalbumin (OVA) as an allergen in an experimental allergic asthma model, investigated prophylactic and therapeutic SIT protocols. During the prophylactic protocol, the animals were sensitized with OVA adsorbed on aluminum hydroxide (Alum) associated with different toll-like receptors (TLR) agonists. The TLR 9 agonist (CpG) was the most efficient in inhibiting allergic sensitization when compared to the other TLR agonists tested. This inhibition mediated by CpG of the development of the allergic lung inflammation was dependent on the IL-10 molecule and the MyD88 signaling in dendritic cells. In addition, knowing that the therapeutic SIT, administered by the subcutaneous route is capable of triggering an anaphylactic reaction, we encapsulated OVA in 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium sulphate (DOTAP), a cationic liposome, in order to increase the safety of the formulation and in parallel potentiate the effect of CpG. The results showed that OVA encapsulation reduced the cutaneous and systemic anaphylactic reaction induced by this allergen. We also verified that SIT with the allergen and CpG encapsulated in DOTAP (OVA&#43 CpG/DOTAP or BT&#43CpG/DOTAP) promotes a significant inhibition of lung allergic inflammation and Total IgE production. This inhibition of lung inflammation was associated with increased production of IL-10 but not of IFN-g in the bronchoalveolar lavage (BAL). Notably, the inhibitory therapeutic effect of OVA&#43CpG/DOTAP was abrogate in animals deficient in the MyD88 or IL-10 or IFN-g molecules. We found that therapeutic SIT was also dependent on MyD88 signaling on dendritic cells. In addition, when we used animals reconstituted with cells from allergic donor animals, we found that the therapeutic effect of SIT was not found in animals reconstituted with cells from IFN-gKO animals, and that animals reconstituted with IL-10KO animal cells had increased IL -10 in the BAL. The transfer of bone marrow cells from C57BL/6 (WT) animals but not from IFN-gKO animals treated with OVA&#43CpG/DOTAP was able to reverse the lung allergic inflammation of WT animals and induce the increase of IL-10 in the BAL. These results contribute to the elucidation of the mechanisms involved in the anti-inflammatory effect of the SIT and potential uses of CpG and DOTAP in allergic processes.

The main goal in reversing the allergy epidemic is the development of effective prophylactic strategies. Early life events, such as exposures to microbes, have a major influence on the development of balanced immune responses. Due to their ability to interact with host immune system and to modulate host immune responses probiotics, mainly bifidobacteria and lactobacilli have been used with some success in prevention of allergic disease. In order to be referred to as probiotic, bacterial strain has to undergo rigorous testing. We have selected three new Lactobacillus (L.) strains out of 24 human isolates according to their antagonistic activity against pathogenic bacteria, resistance to low pH and milieu of bile salts. Safety of these strains was proven upon intragastric administration to mice; moreover, we have shown their ability to shift cytokine Th1 - Th2 balance towards non-allergic Th1 response in isolated splenic cells. Allergen specific prophylaxis using probiotics as vehicles for mucosal delivery of recombinant allergen is an attractive concept for development of well-tolerated and effective allergy vaccines. We have shown that neonatal mono-colonization of germ-free mice with the L. plantarum NCIMB8826 strain producing the major birch pollen allergen Bet v 1 attenuates the development of...

La constante augmentation des allergies en début de vie suggère une déficience de régulation immunitaire au cours de cette période. La tolérance orale est un mécanisme clé de régulation au niveau de l’intestin pour le maintien de l’homéostasie immunitaire. L’objectif de ma thèse a été de déterminer dans un modèle murin les mécanismes à l’origine de la tolérance orale en début de vie afin de mieux prévenir le développement d’allergies. L’induction de tolérance orale en début de vie n’est efficace qu’à partir de la 3ème semaine de vie. Le défaut de tolérance orale observé au cours des 2 premières semaines de vie est la conséquence d’un défaut de capture de l’antigène et d’expression de la RALDH (enzyme de conversion du rétinol en acide rétinoïque) par les cellules dendritiques CD103+ mésentériques, résultant en une ignorance de l’antigène. Les taux de rétinol sanguins en période néonatale sont très bas, et un enrichissement du lait maternel en vitamine A permet de corriger cette déficience néonatale ainsi que le défaut de présentation antigénique des cellules dendritiques CD103+. Cet enrichissement permet également de prévenir l’apparition de l’allergie dès les premiers jours de vie. De manière surprenante, alors que chez la souris adulte, la tolérance orale dépend de la génération de lymphocytes T régulateurs, la tolérance orale observée chez les souriceaux âgés de 3 semaines et chez les nouveau-nés ayant reçu de la vitamine A, dépend de la génération de lymphocytes Th1. / Increased prevalence of allergies in early life suggests a deficiency of immune regulation during this period. Oral tolerance is a key immuno-regulatory mechanism in the gut for immune homeostasis. The principal objective of my thesis was to determine in a murine model the mechanisms at the origin of oral tolerance in early life to better prevent allergy development. We found that induction of oral tolerance in early life is effective only from the 3rd week of life. The defect of oral tolerance observed during the first 2 weeks of life is the consequence of a defect in antigen capture and RALDH expression (enzyme which converts retinol in retinoic acid) by mesenteric CD103+ dendritic cells. Serum levels of retinol in neonatal period are very low, and an enrichment of the maternal milk with vitamin A allows to correct this neonatal deficiency as well as the defect of antigen presentation by the CD103+ dendritic cells. This enrichment also allows allergy prevention from the first days of life. To our surprise, while in adult mice, oral tolerance depends on the generation of regulatory T lymphocytes, oral tolerance observed in the 3 week-old mice and in the newborn which received vitamin A, depends on the generation of Th1 lymphocytes. These results demonstrate that vitamin A levels in early life are directly correlated with Th1 differentiation induced by oral administration of allergen, necessary for allergy prevention. This knowledge should now be taken into account for the implementation of allergy prevention strategies, more specific and better adapted to the neonatal period, such as a supplementation with vitamin A.

Avaliamos os mecanismos regulatórios desencadeados pela imunização materna na resposta alérgica da prole OVA. A imunização materna com OVA promoveu alterações como o aumento da expressão dos receptores FcgRIIb nos linfócitos B esplênicos dos neonatos aos 3 dias de idade (d.i.), o que se manteve até os 20 d.i. Com a imunização das proles no período neonatal a imunização materna inibiu a produção de anticorpos IgE anti-OVA. Além disso, foi observado na população de linfócitos B da prole o aumento da expressão dos receptores FcgRIIb e CD44. A transferência passiva de IgG de mães imunes no pós-natal mostrou uma inibição da produção de IgE, e no período pré-natal foi capaz de reduzir a expressão das moléculas CD40 e CD23 nos linfócitos B e a secreção de IL-10 em linfócitos T CD4 na prole no período neonatal. As evidências mostram que a imunização pré-concepcional com OVA induz mecanismos que regulam a resposta IgE da prole imunizada no período neonatal, o que foi parcialmente observado com a transferência passiva de anticorpos IgG durante o período pré e pós-natal. / To evaluate the regulatory mechanisms triggered by maternal immunization in the immune response of the offspring, the effect of preconceptional immunization with OVA was evaluated. Maternal immunization with OVA led to early alteration with increased expression of FcgRIIb in B lymphocytes from 3 days old pups. Offspring from immune mother showed diminished percentage of CD4 T cells IL-4+. The immunization of offspring during neonatal period showed that maternal immunization inhibits the production of anti-OVA IgE antibodies. The evaluation of CD4 T cell population revealed diminished IL-4+ cells. Passive IgG transfer from immune mother during neonatal period showed inhibition in the IgE synthesis, during pregnancy showed capacity to reduce the expression of CD40 molecules in B cells from neonatal pups. These evidences show that maternal OVA immunization down regulates the IgE response of offspring including phenotypic and functional alteration in B and CD4 T cells. These alterations were partially observed with IgG transfer during pregnancy or after birth.

O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da endotoxina durante a sensibilização com extrato de Blomia tropicalis (Bt) Para induzir a alergia pulmonar experimental, camundongos foram sensibilizados s.c. com Bt adsorvido ao alum em presença ou não de LPS e desafiados i.n. com Bt. Os animais sensibilizados e desafiados com de Bt apresentaram intensa inflamação pulmonar eosinofílica, AHR, grande produção de muco, aumento na produção de citocinas do tipo 2 no lavado broncoalveolar (BAL) e aumento de IgE. Quando o LPS foi adicionado, observou-se inibição no influxo de eosinófilos e aumento no influxo de neutrófilos no BAL. O LPS também inibiu IL-4 e IL5 e aumentou IFN<font face=\"Symbol\">g e IL-17. Surpeendentemente, o LPS não afetou a AHR, nem a produção de IgE. Utilizando animais nocautes, verificou-se que a inibição eosinofílica induzida pelo LPS é dependente de IFN<font face=\"Symbol\">g e MyD88 enquanto que o aumento de neutrófilos é independente de IFN<font face=\"Symbol\">g e dependente da sinalização dos TLR2, TLR4 e CD14. Além disso, na ausência de TLR2, TLR4 ou CD14, o LPS suprimiu a alergia pulmonar experimental. Em conclusão, os resultados indicam que camundongos sensibilizados com Bt e LPS co-adsorvidos ao alum desenvolvem um fenótipo de asma não clássico, dependente da sinalização pelos TLR. / The aim of this work was to study the effects of endotoxin during sensitization with Blomia tropicalis extract (Bt). To induce experimental allergic airways, mice were sensitized s.c. with Bt with or without LPS co-adsorbed onto alum, and challenged i.n. with Bt. Wild type mice sensitized and challenged with HDM showed eosinophilic lung inflammation, Arway hyperactivity (AHR), mucus hyperproduction, increased levels of type 2 cytokines in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and augmented total IgE. When LPS was added at the sensitization, we observed an inhibition of eosinophil influx and an increase in neutrophil counts in the BAL. Moreover, LPS inhibited IL-4 and IL-5 production and increased IFN-<font face=\"Symbol\">g and IL-17 production. Surprisingly, LPS did not affect AHR or IgE production. Using knockout mice, we found that the eosinophilic inhibition induced by LPS was dependent on IFN<font face=\"Symbol\">g and MyD88, while the neutrophilic increase was independent of IFN<font face=\"Symbol\">g and dependent on TLR2, TLR4 and CD14 signaling. Moreover, in the absence of TLR2, TLR4 or CD14, LPS suppressed AAD. In conclusion, our results indicate that mice sensitized with Bt and LPS co-adsorbed to alum develop a non-classical asthma-like phenotype that is dependent on TLR signaling.

Os benefícios do exercício físico moderado na asma alérgica são bem conhecidos, indicando que o exercício físico tem efeito anti-inflamatório reduzindo as respostas de Th2 e remodelamento pulmonar, porém os mecanismos dessa imunorregulação ainda não são bem descritos. Esse estudo é proposto com o objetivo de investigar os mecanismos de imunorregulação induzidos pelo exercício físico moderado sobre a inflamação da asma experimental. Camundongos Balb/c foram sensibilizados com ovalbumina (OVA) e alúmen nos dias 0, 14, 21, 28 e 42 e desafiados com aerossol de OVA três vezes por semana, desde o dia 21 até o dia 51 (grupos OVA e OVA + exercício (OEX). Um teste de capacidade máxima foi realizado nos dias 21 e 51. Os grupos EX (exercício) e OEX praticaram exercício moderado nos dias 21 até 51. Vinte e quatro horas após o último desafio, os animais (n=8/grupo) foram anestesiados, traqueostomizados e ventilados mecanicamente, para avaliação da responsividade pulmonar. Foi realizada a coleta de sangue dos animais através da veia cava inferior para análise de imunoglobulinas e os animais foram posteriormente eutanasiados. Os pulmões foram então, removidos para quantificação de citocinas no homogenato e processamento histológico. Em outros grupos de animais (n=8/grupo), avaliamos as células inflamatórias no pulmão e nos linfonodos mediastinais por citometria de fluxo. A avaliação da capacidade física comprovou maior condicionamento físico nos animais submetidos ao protocolo de treinamento. Animais sensibilizados a ovalbumina apresentam hiperresponsividade e a presença da atividade física reduziu essa elevação. A prática de exercício físico reduz a hiperplasia/hipertrofia epitelial e produção de mucosubstânicas intraepiteliais gerada pela exposição a OVA. A exposição antigênica eleva os níveis de IgG2a, IgG1 e IgE e o exercício físico não modificou essa condição. A sensibilização eleva os níveis de IL-4, IL-6, o exercício físico apresenta capacidade de diminuir a quantidade dessas citocinas, já com as citocinas IL-10 e TGF-beta há o aumento dos níveis nos grupos treinados. Na análise do perfil celular, foi observado que o exercício físico protege o pulmão da intensa eosinofilia induzida pela sensibilização a OVA com intenso influxo pulmonar de Treg nos animais OEX, com maior produção de IL-10 e TGF-beta. O exercício em animais sensibilizados também elevou o influxo de macrófagos pulmonares, M1 e M2 bem como influxo e ativação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Nos linfonodos drenantes, foi observado também que o exercício físico por si só eleva a ativação dos linfócitos TCD4+, independentemente da presença de OVA, enquanto que nos animais sensibilizados há redução da migração de macrófagos M2. Na análise de células dendríticas, foi observado em linfonodos dos grupos submetidos ao protocolo de treinamento e sensibilizados há redução da expressão de moléculas CD80, CD86 e ICOSL em cDCs, e aumento de ICOSL pDCs, sendo que nestas mesmas células há redução de CD80. O exercício físico, ao induzir maior influxo local de células regulatórias modula a inflamação pulmonar reduzindo o influxo eosinofílico pulmonar, a responsividade pulmonar, bem como o remodelamento epitelial e produção de muco induzido pelo antígeno ovalbumina / The benefits of moderate physical exercise in allergic asthma are well known, indicating that physical exercise has an anti-inflammatory effect reducing Th2 responses and pulmonary remodeling, but the mechanisms of this immunoregulation are not yet well described. This study aims to investigate the mechanisms of immunoregulation induced by moderate physical exercise on the inflammation of experimental asthma. Balb/c mice were sensitized with ovalbumin (OVA) and alum on days 0, 14, 21, 28 and 42 and challenged with OVA aerosol three times a week from day 21 to day 51 (OVA and OVA + exercise groups (OEX) A maximal capacity test was performed on days 21 and 51. EX (exercise) and OEX groups performed moderate exercise on days 21 to 51. Twenty-four hours after the last challenge, animals (n=8/group) were anesthetized, tracheostomized and mechanically ventilated, to evaluate pulmonary responsiveness, blood was collected from the animals through the inferior vena cava for immunoglobulin analysis, and the animals were later euthanized, and the lungs were then removed for quantification of cytokines (n=8/group), we evaluated the inflammatory cells in the lung and in the mediastinal lymph nodes by flow cytometry. Analysis of the physical capacity demonstrated greater physical fitness in the animals submitted to the training protocol. Animals sensitized to ovalbumin presented hyperresponsiveness and the presence of physical activity reduced this elevation. The practice of physical exercise reduces epithelial hyperplasia/hypertrophy and intraepithelial mucosubstance production generated by OVA exposure. Antigenic exposure increases IgG2a, IgG1 and IgE levels and physical exercise did not modify this condition. Sensitization increases the levels of IL-4, IL-6, physical exercise has the capacity to decrease the amount of these cytokines and IL-10 and TGF-beta cytokines had an increase in levels in the trained groups. In the analysis of the cellular profile, it was observed that physical exercise protects the lung from intense eosinophilia induced by OVA sensitization with intense pulmonary influx of Treg in OEX animals, with higher production of IL-10 and TGF-beta Exercise in sensitized animals also increased the influx of pulmonary macrophages, M1 and M2 as well as influx and activation of TCD4+ and TCD8+ lymphocytes. In the draining lymph nodes, it was also observed that physical exercise alone increases the activation of CD4+ T lymphocytes, independently of the presence of OVA, whereas in the sensitized animals there was a reduction in M2 macrophages migration. In the analysis of dendritic cells, it was observed in lymph nodes of the groups submitted to the training protocol and sensitized there was a reduced expression of CD80, CD86 and ICOSL molecules in cDCs, and an increase of ICOSL pDCs, and in these same cells there is reduction of CD80. Physical exercise, by inducing greater local influx of regulatory cells, modulates pulmonary inflammation by reducing pulmonary eosinophil influx, pulmonary responsiveness, as well as epithelial remodeling and mucus production induced by the ovalbumin antigen

Objetivo: Avaliar a prevalência e fatores de risco associados a reações adversas a alimentos (RAA) e diagnóstico médico de alergia alimentar referidas pelos pais em crianças de um a três anos de vida. Métodos: Estudo de coorte prospectivo de crianças nascidas em Ribeirão Preto, São Paulo e São Luís, Maranhão, no ano de 2010, e avaliadas para esse estudo nos três primeiros anos de vida. Em Ribeirão Preto, foram incluidas 3740 das 7702 crianças nascidas no ano de 2010. Em São Luís, participaram do estudo 3320 das 5166 crianças avaliadas ao nascimento no mesmo ano. Os responsáveis pelas crianças responderam questões referentes à ocorrência de reações adversas após a ingestão de alimentos e diagnóstico médico prévio de alergia alimentar. O estudo das associações entre os desfechos e as variáveis independentes de interesse foi feito por meio de análise univariada e por modelos log-binomiais ajustados, obtendo-se medidas de risco relativo (RR) e seus intervalos de confiança (IC). Resultados: A prevalência de reações adversas a alimentos (RAA) referidas pelos pais e de diagnóstico médico de alergia a pelo menos um alimento foi, respectivamente, de 10,7% (399/3740) e 4,4% (164/3716) em Ribeirão Preto, e de 6,4% (216/3320) e 2,7% (88/3320) em São Luís. Reações e diagnóstico de alergia ao leite de vaca ocorreram, respectivamente em 6,3% (223/3533) e 3,4% (119/3516) das crianças de Ribeirão Preto, e em 3,2% (102/3166) e 1,6% (52/3155) em São Luís. Nas duas cidades, houve concordância entre os desfechos reação a pelo menos um alimento e diagnóstico médico de alergia a pelo menos um alimento (índice kappa de 0,52 em RP e 0,51 em SL). O mesmo ocorreu para o relato de reação ao leite de vaca e diagnóstico médico de alergia ao leite (índice kappa de 0,52 em RP e 0,47 em SL). Crianças cujas mães não frequentaram universidades apresentaram menor risco de reação a pelo menos um alimento, tanto em Ribeirão Preto, 9 quanto em São Luís, e menor risco de diagnóstico médico de alergia a algum alimento em Ribeirão Preto. Os fatores associados a maior risco de diagnóstico médico de alergia a pelo menos um alimento foram a situação conjugal sem companheiro, idade de início à creche menor que 6 meses e histórico de alergia nas crianças, somente em Ribeirão Preto. O aleitamento materno exclusivo até os 6 meses associou-se a menor risco de diagnóstico médico de alergia ao leite de vaca em Ribeirão Preto. O início do leite artificial antes dos 6 meses e o início à creche antes dessa idade foram identificados como fatores de risco para diagnóstico médico de alergia ao leite de vaca nas crianças de Ribeirão Preto. Conclusões: O presente estudo contribuiu para o conhecimento da prevalência de RAA, incluindo a AA, referida pelos pais, em crianças brasileiras de até 3 anos de vida. Diferenças sociais, econômicas e culturais podem explicar as diferenças de prevalência e fatores associados a RAA e AA em RP e SL. / Objective: To evaluate the prevalence and risk factors associated with parent reported adverse reactions to food (ARF) and medical diagnosis of food allergy in 1-3 year old children. Methods: Prospective cohort study of children born in Ribeirão Preto, São Paulo and São Luís, Maranhão, in 2010, and evaluated for this study at 1-3 years of age. In Ribeirão Preto, 3740 of the 7702 children born in 2010 were included. In São Luís, 3320 of the 5166 evaluated at birth were included. Caregivers answered questions regarding the occurrence of adverse reactions after ingestion of food allergy and previous medical diagnosis of food allergy. Associations between end points and independent variables were determined by univariate analysis and log-binomial adjusted models. Relative risks (RR) and confident intervals were calculated (IC). Results: The prevalence of parent reported ARF and medical diagnosis of allergy to at least one food was, respectively, 10.7% (399/3740) and 4.4% (164/3716) in Ribeirão Preto, and 6.4% (216/3320) and 2.7% (88/3320) in São. Luís. Reactions and medical diagnosis of allergy to cow\'s milk were reported, respectively, in 6.3% (223/3533) and 3.4% (119 / 3516) of the children from Ribeirão Preto and in 3.2% (102/3166) and 1.6% (52/3155) in São Luís. In both cities, there was agreement between the reported reactions to at least one food and medical diagnosis of allergy to at least one food (kappa of 0.52 and 0.51 in RP in SL). The same happened for reported reactions to cow\'s milk and medical diagnosis of milk allergy (kappa of 0.52 and 0.47 in RP in SL). Children whose mothers did not attend universities were less likely to report reaction to at least one food, both in Ribeirão Preto and São Luís, and had lower risk of medical diagnosis of allergy to any food in Ribeirão Preto. Factors associated with increased risk of medical diagnosis of allergy to at least one food were the marital status without partners, going to a at 11 daycare center before 6 months of age and a history of allergy in children, only in Ribeirão Preto. Exclusive breastfeeding until 6 months was associated with a lower risk of medical diagnosis of allergy to cow\'s milk in Ribeirão Preto. The beginning of the artificial milk before 6 months and going to daycare centers before this age were identified as risk factors for medical diagnosis of allergy to cow\'s milk in children of Ribeirão Preto. Conclusions: This study contributes to the knowledge of the prevalence parent reported ARF, including food allergy , in Brazilian children up to 3 years. Social, economic and cultural differences can explain the differences in prevalence and associated risk factors for ARF and AA in RP and SL.

Les allergies représentent un enjeu sociétal majeur dans nos sociétés modernes. Les outils de diagnostics actuels permettent la mesure de concentration d’anticorps spécifiques IgE responsables des réactions allergiques contenus dans le sérum de patient. L’intégration de nano-micro particules diminue les distances de diffusion permettant de miniaturiser les dispositifs, de diminuer le temps de réaction et d’améliorer l’efficacité du diagnostic. C’est dans cette perspective que cette thèse se positionne en développant une méthode innovante de détection des anticorps IgE par l’utilisation de microbilles polystyrènes 10µm (PS) et superparamagnétiques 1µm (SPM).L’idée explorée dans cette thèse est d’utiliser les microbilles PS comme support d’immunodosage et les propriétés magnétiques des microbilles SPM en réalisant un tri magnétique des microbilles PS. Nous avons développé cette technologie en trois étapes technologiques distinctes. Premièrement, la bio-fonctionnalisation a permis le greffage des allergènes et des anticorps à la surface des microbilles qui réagissent ensuite avec le sérum de patient. Puis, le tri magnétique a été développé pour isoler les microbilles PS en fonction de la présence ou non d’anticorps IgE à leur surface. L’efficacité de ce procédé est proportionnelle à la quantité d’IgE par microbilles. Finalement une technologie d’auto-assemblage de microbilles appelées « assemblage gravitationnel » a été développé en exploitant avantageusement les phénomènes de sédimentation et de capillarité. Il a été montré que cette technologie complémentaire à la technologie d’assemblage capillaire étend le domaine de l’assemblage à des systèmes de suspensions colloïdales denses. De plus, cette technologie permet d’atteindre une limite de détection de 2 microbilles/ml.Des tests cliniques ont été réalisés avec succès à partir de sérums de patient sensibles à l’arachide, à la noisette et à la crevette. Le temps de procédé, la limite de détection et la dynamique de détection ont été optimisés. La preuve de concept de détection des anticorps IgE a été présentée et ouvre la voie vers le diagnostic d’allergies multiplexe. / Allergies represent a major social issue for modern societies. Current diagnostic tools enables to measure the concentration of specific IgE antibodies responsible for allergic response into the patient’s serum. The use of nano-micro particles decreases diffusion distances in order to shrink the size of device, reduce the length of time reaction and improve diagnostic efficiency. In this perspective, the PhD work develop an innovative method to detect IgE antibodies by using both 10µm polystyrene (PS) and 1µm superparamagnetic (SPM) microbeads.The PhD explores the idea of using both PS microbeads as support of immunoassay and magnetic properties of SPM microbeads in order to perform a magnetic sorting of PS microbeads. We have developped this technology in 3 different technological steps. First, biofunctionnalization is used to link allergens and antibodies onto the surface of microbeads intended to react with serum patient. Then, the magnetic sorting has been developped to isolate PS microbeads depending on the presence / absence of IgE antibodies onto their surface. The efficiency of such a process is proportional to IgE quantity per microbeads. Finally, a self-assembly process of microbeads called « gravitational assembly » has been developped by studying sedimentation and capillary phenomenon. It has been shown that this complementary technology to the capillary assembly technology extend the scope of assembly to dense system of colloidal suspension. I addition, this technology reaches a detection limit of 2 microbeads per ml.Clinical trials have been succesfully performed from serum patient allergic to peanut, hazelnut or shrimp. The process time, detection limit and dynamic range of the detection system have been studied and optimized. The proof of concept of IgE antibodies detection have been presented and points the way towards the multiplex diagnosis of allergies.

Asma alérgica é uma inflamação pulmonar crônica mediada por células Th2. A Hipótese da Higiene é a teoria aceita para explicar o aumento das alergias nas últimas décadas e preconiza que a menor exposição dos indivíduos a componentes microbianos prejudica a geração mecanismos imunorregulatórios. Nosso estudo abordou a modulação da resposta alérgica pulmonar induzida por ovalbumina, por cepas de bacilo Calmette-Guérin recombinantes (rBCG) que expressam fragmentos de toxinas bacterianas. Observamos que dependendo do antígeno heterólogo expresso, a imunização intranasal com rBCG pode levar tanto a supressão como a exacerbação da resposta alérgica pulmonar. Demonstramos que tanto em um contexto profilático quanto terapêutico, rBCG é capaz de suprimir os parâmetros alérgicos, e a supressão não envolve o recrutamento de células T regulatórias, é um fenômeno local, está associada a maior produção de IFN-g do que IL-4 e é dependente de IL-12. Estes dados sugerem que a infecção pulmonar por rBCG gera um milieu capaz de bloquear a migração de células Th2 inflamatórias. / Allergic asthma is an atopic disorder mediated by Th2 cells. The Hygiene Hypothesis is the accepted theory to explain the increasing in allergy in recent deacades. It states that modern health care and hygiene practices have led to a reduced exposure to microorganisms components which impairs the generation of immunoregulatory mechanisms. The present study analysed how the intranasal infection with recombinant bacillus Calmette-Guérin (rBCG) strains expressing fragments of bacterial toxins could modulate an allergic pulmonary inflammation induced by ovalbumin. We demonstrated that the rBCG strains could supress or exacerbate the allergic inflammation depending on the expressed heterologous antigen. We analysed the effect of the mycobacterial infection in a prophylactic and in a therapeutical contexts, and we have identified that for both situations the of supression allergic features does not involve the recruitment of regulatory T cells to the lungs, is a local phenomena, is associated with an increased production of IFN-g, and is an IL-12 dependent mechanism. Taken togheter, this data suggest that the rBCG pulmonary infection generates a milieu capable to supress the chemotaxis for Th2 cells, which suppress the establishment of the allergic inflammation in the lungs.

Fêmeas da espécie Aedes aegypti são vetores de importantes doenças como dengue, febre amarela, Chikungunya e Zika. A alimentação sanguínea realizada pelo mosquito fêmea é importante e necessária para a maturação dos ovos. Durante este processo, os mosquitos hematófagos precisam lidar com desafios impostos pelo hospedeiro vertebrado como a barreira da hemostasia e seu sistema imunológico. Estudos clássicos mostraram que a exposição à saliva do mosquito é capaz de sensibilizar o homem, embora boa parte dos indivíduos apresente dessensibilização às proteínas salivares ao longo da vida. Resultados recentes do nosso grupo sugerem que o processo de sensibilização e dessensibilização pode ser reproduzido em modelo murino. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo estudar os processos de sensibilização e dessensibilização aos antígenos salivares de A. aegypti, seu impacto no fitness biológico do mosquito (ingestão de sangue, oviposição e escolha do hospedeiro) e potenciais moléculas envolvidas nesse processo. Inicialmente, padronizamos um modelo de exposição natural, no qual camundongos BALB/c fêmeas foram expostos 10 vezes às picadas de 30 mosquitos A. aegyptifêmeas, com um intervalo de 15 dias entre cada exposição. Avaliamos o perfil de anticorpos séricos entre cada exposição e observamos uma mudança no padrão de anticorpos ao longo do tempo, inicialmente com forte componente Th2 (IgE total e IgG1 específica) e mais tardiamente, a presença de um componente Th1 (IgG2a específica). Além disso, o soro de animais expostos 4 vezes aos mosquitos apresentou atividade anafilática dependente de IgE superior ao soro de animais naive e de animais expostos 10 vezes ao mosquito. O perfil de citocinas presentes em culturas de células totais de baço mostrou forte produção de IL-4 e IL-5 antígeno-específicas, que foi semelhante entre os grupos expostos 4 ou 10 vezes aos mosquitos. A avaliação da migração celular na orelha induzida pelas picadas do mosquito mostrou que, comparado com as células residentes da orelha de animais naive, todos os tipos celulares fenotipados estavam presentes maior quantidade em tanto em animais expostos 4 vezes quanto expostos 10 vezes aos mosquitos, com destaque para os eosinófilos (aumentados ~2000 e ~1000 vezes, respectivamente). Entretanto, o número total de eosinófilos e de linfócitos B se mostrou reduzido, enquanto o número de neutrófilos estava aumentado, nos animais expostos 10 vezes quando comparados aos animais expostos 4 vezes. Do ponto de vista do vetor, não observamos grandes alterações no volume de sangue ingerido durante o repasto sanguíneo, embora haja uma tendência de maior aquisição de sangue em animais expostos 7 vezes ao mosquito. Por outro lado, a oviposição foi gradativamente diminuída entre a segunda e a sétima exposição quando comparada com a primeira exposição, voltando aos níveis originais à partir da oitava exposição. Um modelo de inflamação peritoneal aguda induzido pela inoculação do extrato da glândula salivar (EGS) de fêmeas do mosquito A. aegypti, revelou um aumento de eosinófilos, semelhante ao observado no modelo crônico de inflamação na orelha. Esse modelo foi usado para estudar o papel de moléculas do hospedeiro potencialmente envolvidas na migração eosinofílica em resposta aos antígenos salivares, revelando a importância da IL-5 e dos leucotrienos nesse processo. Assim, podemos concluir que a saliva do mosquito A. aegypti provoca uma forte resposta alérgica em camundongos, que apesar de não alterar o volume de sangue ingerido pelos mosquitos, é capaz de afetar sua oviposição. A exposição crônica induz um processo de dessensibilização, com aumento de anticorpos de perfil Th1 e diminuição da migração de eosinófilos no sítio da picada, mas que se refletiu em maior oviposição por parte dos mosquitos. Finalmente, IL-5 e leucotrienos são mediadores que parecem estar envolvidos na inflamação eosinofílica em resposta aos componentes salivares do mosquito. / Females of Aedes aegypti species are vectors of important diseases such as dengue, Yellow Fever, Chikungunya Fever and Zika. The blood meal is essential and necessary for the maturation of eggs in female mosquitoes. During this process, hematophagous mosquitoes need to cope with challenges imposed by the vertebrate host, such as the hemostasis and the immune system barriers. Classical studies have shown that exposure to mosquito saliva is able to sensitize humans, although most individuals show desensitization to salivary proteins throughout their lives. Recent results from our group suggest that the process of sensitization and desensitization can be reproduced in a murine model. Thus, the aim of the present work was to study the sensitization and desensitization processes to A. aegypti salivary antigens, their impact on the biological fitness of the mosquito (blood ingestion, oviposition and host choice) and potential molecules involved in this process. Initially, we standardized a model of natural exposure in which female BALB/c mice were exposed 10 times to the bites of 30 female A. aegypti mosquitoes, with a 15-day interval between each exposure. We evaluated the serum antibody profile between each exposure and observed a change in antibody pattern over time, initially with a strong Th2 component (total IgE and specific IgG1) and later, the presence of a Th1 (specific IgG2a) component. In addition, the serum of animals exposed 4 times to the mosquitoes showed stronger IgE-dependent anaphylactic activity than the serum of naive animals and animals exposed 10 times to the mosquitoes. The cytokine profile in spleen cell cultures showed strong antigen-specific production of IL-4 and IL-5, similar between the groups exposed 4 or 10 times to the mosquitoes. The evaluation of cell migration into the ear induced by mosquito bites showed that, compared to the resident cells of the ear of naive animals, all phenotyped cell types were present in larger amounts in both animals exposed, 4 times and 10 times, to mosquitoes, specially eosinophils (increased ~2000 and ~1000 times, respectively). However, the total number of eosinophils and B lymphocytes was reduced, while the number of neutrophils was increased, in animals exposed 10 times when compared to animals exposed 4 times. From the vector perspective, we did not observe significant changes in the volume of blood taken during the blood feeding, although there is a tendency of greater blood acquisition in animals exposed 7 times to the mosquitoes. On the other hand, the oviposition was gradually diminished between the second and the seventh exposure when compared to the first exposure, returning to the original levels from the eighth exposure. A model of acute peritoneal inflammation induced by the inoculation of female A. aegypti salivary gland extract (SGE) revealed an increase in eosinophils, similar to that observed in the chronic model of inflammation in the ear. This model was used to study the role of host molecules potentially involved in eosinophil migration in response to salivary antigens, revealing the importance of IL-5 and leukotrienes in this process. Thus, we can conclude that the saliva of the A. aegypti mosquito causes a strong allergic response in mice that it does not alter the volume of blood ingested by mosquitoes, but it is able to affect their oviposition. Chronic exposure induced a desensitization process, with increased antibodies of Th1 profile and decreased eosinophil migration to the bite site, but that resulted in greater oviposition by the mosquitoes. Finally, IL-5 and leukotrienes are mediators that seem to be involved in eosinophilic inflammation in response to the salivary components of the mosquito.