Orientador: Luis Roberto Furlan / Resumo: Este estudo foi conduzido com novilhos pertencentes a diferentes grupos genéticos, Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) e Canchim (n=30), objetivando identificar SSCPs (Polimorfismos de Conformação de Cadeia Simples) e RFLP (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) no gene da obesidade e relacionar esses polimorfismos com a área-de-olho-de-lombo (AOL) e a espessura de gordura subcutânea (EGS) na carcaça. Cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base na seqüência do gene da leptina bovina depositada no Genbank (U50365), para a amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de fragmentos a partir do DNA genômico extraído dos leucócitos. Os fragmentos LEPT1, LEPT2, LEPT3 e LEPT7 foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida para identificação dos SSCPs. O fragmento LEPT4 foi digerido com a enzima de restrição Sau3AI para detecção do RFLP. Os fragmentos LEPT1, LEPT2 e LEPT7 apresentaram sete, quatro e cinco padrões diferentes de migração, respectivamente, enquanto o fragmento LEPT3 apresentou padrão monomórfico. O genótipo LEPT7-A foi relacionado à maior AOL (P<0,05), sendo que este genótipo foi mais freqüente no grupo Simental x Nelore, o qual também apresentou menor EGS (P<0,05) em relação aos animais Angus x Nelore. As freqüências do alelo A e do genótipo homozigoto AA do RFLP foram as maiores nas três populações estudadas, com valores de 90, 93 e 80%; e de 84, 87 e 68% para Angus x Nelore, Canchim e Simental x Nelore, respectivamente. Polimorfismos no exon 3 do gene da obesidade são potenciais candidatos para serem utilizados como marcadores moleculares para características de carcaça nos programas de melhoramento genético de bovinos de corte. / Abstract: This study was carried out with Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) and Canchim (n=30) in order to identify SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) and RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) within obese (leptin) gene and to relate these polymorphisms with carcass's ribeye area (REA) and subcutaneous fat layer (SFL). Based on bovine leptin gene sequence (Genbank acession number: U50365), five primers were designed for PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification of fragments using genomic DNA extracted from leukocyte. LEPT1, LEPT2, LEPT3 and LEPT7 fragments were eletrophoresed through polyacrilamide gel for SSCPs identification. LEPT4 was digested with Sau3AI for RFLP detection. LEPT1, LEPT2 and LEPT7 fragments showed seven, four and five migration patterns, respectively, while LEPT3 showed monomorphic pattern. LEPT7-A genotype was associated with higher REA (P<0.05), and this genotype was more frequent within Simmental x Nelore group, which had lesser SFL (P<0.05) in relation to Angus x Nelore. In LEPT4-RFLP, the frequencies of A allele and AA genotype were higher within three studied populations, their values were 90, 93 and 80%; and 84, 87 and 68% for Angus x Nelore, Canchim and Simental x Nelore, respectively. Polymorphisms within exon 3 of obese gene are potential candidates for using as molecular markers of carcass traits in beef cattle breed improvement programs. / Doutor

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese, consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8 expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression allow the generation of large amounts of new information in relatively short time. Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function. In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of 10 genes was selected based on their differential expression during metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this methodology in medium to large scale

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9007_Rodrigo Monte Lorenzoni.pdf: 954098 bytes, checksum: 5aea780df5fa2ff2c51790957419c8fd (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / O biribá (Annona mucosa) é uma espécie que tem como centro de origem a Floresta Amazônica, seu fruto possui grande aceitação para consumo in natura, além de ser uma fonte promissora de compostos bioativos com propriedades farmacológicas. Entretanto, apesar da importância, pouco se sabe sobre a variabilidade e diversidade genética desta espécie. O conhecimento da variabilidade genética de espécies pouco explorado possibilita a utilização das mesmas em programas de melhoramento genético e/ou de conservação, sendo os microssatélites (SSR) uma ferramenta interessante para esse tipo de estudo, contudo para realizar estudos com essa classe de marcadores é necessário o conhecimento da ploidia da espécie. Porém, dados referentes ao conteúdo de DNA nuclear e número cromossômico, ainda não foram descritos para a espécie. Portanto, objetivou-se mensurar o valor 2C nuclear, determinar o número cromossômico, avaliar a transposição de marcadores microssatélites desenvolvidos para Phaseolus vulgaris e Coffea sp. e estimar a diversidade genética entre acessos de A. mucosa. O conteúdo de DNA nuclear foi estimado por meio da citometria de fluxo onde foi verificado que a espécie apresenta valor 2C= 5,42 pg e que não existe variação intraespecífica. A técnica de citogenética clássica gerou metáfases onde foi possível determinar que a espécie possui 42 cromossomos e, portanto, é uma espécie hexaploide. Com base na ploidia encontrada foi possível avaliar a transferibilidade dos marcadores, onde foram transferidos e validados 42,25% dos primers. A partir dos 157 fragmentos gerados com 82% de polimorfismo foi possível estimar a diversidade genética entre os acessos estudados, onde os indivíduos foram separados em três grupos distintos pelo método UPGMA e em dois grupos pela análise bayesiana. Com este estudo foi possível verificar que após o conhecimento da ploidia, onde 2n= 6x= 42 cromossomos, os marcadores puderam ser avaliados e mostraram-se eficientes para amplificação heteróloga de amostras de DNA de A. mucosa e os primers que apresentaram polimorfismo poderão ser utilizados em estudos moleculares desta espécie, sem o gasto de recursos financeiros e tempo no desenvolvimento de novos marcadores.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-07Bitstream added on 2014-06-13T20:44:29Z : No. of bitstreams: 1 salman_akd_dr_botfmvz.pdf: 275057 bytes, checksum: 5bc5665febfc65df6266f4e7dc57a759 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo foi conduzido com novilhos pertencentes a diferentes grupos genéticos, Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) e Canchim (n=30), objetivando identificar SSCPs (Polimorfismos de Conformação de Cadeia Simples) e RFLP (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) no gene da obesidade e relacionar esses polimorfismos com a área-de-olho-de-lombo (AOL) e a espessura de gordura subcutânea (EGS) na carcaça. Cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base na seqüência do gene da leptina bovina depositada no Genbank (U50365), para a amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) de fragmentos a partir do DNA genômico extraído dos leucócitos. Os fragmentos LEPT1, LEPT2, LEPT3 e LEPT7 foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida para identificação dos SSCPs. O fragmento LEPT4 foi digerido com a enzima de restrição Sau3AI para detecção do RFLP. Os fragmentos LEPT1, LEPT2 e LEPT7 apresentaram sete, quatro e cinco padrões diferentes de migração, respectivamente, enquanto o fragmento LEPT3 apresentou padrão monomórfico. O genótipo LEPT7-A foi relacionado à maior AOL (P<0,05), sendo que este genótipo foi mais freqüente no grupo Simental x Nelore, o qual também apresentou menor EGS (P<0,05) em relação aos animais Angus x Nelore. As freqüências do alelo A e do genótipo homozigoto AA do RFLP foram as maiores nas três populações estudadas, com valores de 90, 93 e 80%; e de 84, 87 e 68% para Angus x Nelore, Canchim e Simental x Nelore, respectivamente. Polimorfismos no exon 3 do gene da obesidade são potenciais candidatos para serem utilizados como marcadores moleculares para características de carcaça nos programas de melhoramento genético de bovinos de corte. / This study was carried out with Angus x Nelore (n=31), Simental x Nelore (n=30) and Canchim (n=30) in order to identify SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) and RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) within obese (leptin) gene and to relate these polymorphisms with carcass’s ribeye area (REA) and subcutaneous fat layer (SFL). Based on bovine leptin gene sequence (Genbank acession number: U50365), five primers were designed for PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification of fragments using genomic DNA extracted from leukocyte. LEPT1, LEPT2, LEPT3 and LEPT7 fragments were eletrophoresed through polyacrilamide gel for SSCPs identification. LEPT4 was digested with Sau3AI for RFLP detection. LEPT1, LEPT2 and LEPT7 fragments showed seven, four and five migration patterns, respectively, while LEPT3 showed monomorphic pattern. LEPT7-A genotype was associated with higher REA (P<0.05), and this genotype was more frequent within Simmental x Nelore group, which had lesser SFL (P<0.05) in relation to Angus x Nelore. In LEPT4-RFLP, the frequencies of A allele and AA genotype were higher within three studied populations, their values were 90, 93 and 80%; and 84, 87 and 68% for Angus x Nelore, Canchim and Simental x Nelore, respectively. Polymorphisms within exon 3 of obese gene are potential candidates for using as molecular markers of carcass traits in beef cattle breed improvement programs.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T14:05:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Jehan Fonsêca do Nascimento.pdf: 3525122 bytes, checksum: 3ffc9a4b29e449d6793bed6b88ed2f69 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:05:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Jehan Fonsêca do Nascimento.pdf: 3525122 bytes, checksum: 3ffc9a4b29e449d6793bed6b88ed2f69 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / CNPq; Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica / Esta tese apresenta dois esquemas de monitoramento de corrosão em metal à base de fibra óptica usando a técnica de reflectometria óptica amplificada no domínio do tempo e também apresenta resultados experimentais de um estudo sobre os efeitos da rugosidade de superfície no filme metálico sob o sinal óptico durante o processo de corrosão. O sistema sensor amplificado é multiponto, auto-referenciado e pode medir taxa de corrosão a vários quilômetros do equipamento OTDR. O primeiro esquema usa uma fibra dopada com Érbio com bombeamento remoto e é utilizado para avaliar o aumento do alcance do sistema quando comparado com o sistema não-amplificado. O segundo esquema usa outro EDFA próximo ao OTDR como reforço para o sinal óptico gerado por ele. Além disso, esse sistema é usado para as medidas de corrosão e também para avaliação da sensibilidade do sistema às variações de ganho do amplificador. Os resultados experimentais obtidos em condições laboratoriais controladas mostram as vantagens do sistema de amplificação, em termos do seu longo alcance, melhor resolução espacial e imunidade a variações de ganho. Nos resultados experimentais obtidos pelo sensor de corrosão foram observados efeitos ópticos que sugerem a influência da rugosidade do filme metálico na reflectância da luz, resultante do processo de corrosão. Resultados experimentais obtidos através de um aparato experimental que utiliza diferentes comprimentos de onda da luz e também diferentes meios externos indicam que ocorrem efeitos de espalhamento de luz e ressonância de plásmons de superfície.

Made available in DSpace on 2016-04-27T18:12:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Marcon do Amaral Campos.pdf: 1275237 bytes, checksum: 0c8a5754c3aa5ce39e7e47c9c8b4fdc1 (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Objective: The purpose of this study was to investigate two methods for obtaining the real-ear to coupler difference (RECD) in infants: with an insert earphone and the measure in free field with a linear hearing aid. The test -retest reliability and reproducibility of both methods were compared as well as the reliability of between-ear RECD measures. The values of RECD obtained were compared with the database of DSL [i/o] 4.1 and 5.0. Design: The RECD was measured in 25 hearing impaired infants aged 3 months to 24 months with no malformations or visible syndrome and with normal middle ear function. The RECD values were obtained via both methods twice each with removal and reinsertion of the probe microphone between each measure and using the infant s earmold. Results: The insert earphone method resulted in significantly better test-retest reliability than the free field because the values were most similar for all frequencies and ages. The RECD values obtained in the current study were similar to those proposed by DSL [i/o] 4.1 and DSLm 5.0 database. There were no significant differences between the mean RECDs obtained using an insert earphone compared with those obtained via free field method but the standard deviation is significantly higher in free field measurement. Conclusions: The results of this study support the use of the insert earphone method of measurement of the RECD as a reliable tool in assisting with the hearing aids fitting in infants. The variability is smaller in this method and the values were more similar to DSL[ i/o] 4.1 and DSLm 5.0 database / Objetivo: Analisar comparativamente a RECD medida em bebês por meio de dois métodos de mensuração: a medida realizada com o fone de inserção e a medida em campo livre com utilização de um AASI linear, verificando a confiabilidade e reprodutibilidade do teste e reteste de cada medida. Método: Foi mensurada a RECD em 25 bebês deficientes auditivos, entre 3 a 24 meses, sem mal formação ou síndrome aparente que apresentavam função de orelha média dentro da normalidade. A medida da RECD foi realizada com fone de inserção e em campo livre com um AASI linear duas vezes cada uma delas, com molde do bebê. A ordem de aplicação dos dois métodos e da orelha a ser testada foi estabelecida de forma aleatória. A coleta foi realizada no Centra da Audição DERDIC, com aprovação do comitê de ética e consentimento do responsável pelo bebê. Resultados: As medidas com fone de inserção mostraram-se mais confiáveis do que as realizadas em campo livre com AASI, pois apresentou menor variação intra e intersujeitos. Os valores da RECD encontrados nesse estudo estão próximos aos propostos pelos bancos de dados do DSL [i/o] 4.1 e DSLm 5.0. Não houve diferença significante entre as orelhas na medida da RECD. Conclusão: Na comparação entre médias, controlando a faixa etária, houve diferença estatisticamente significante entre os valores da RECD medidos com fone de inserção e em campo livre com AASI na maioria das freqüências estudadas. Portanto as medidas não são equivalentes. A medida da RECD realizada com fone de inserção mostrou-se mais confiável e precisa que a realizada em campo livre com o AASI, pois a diferença entre teste e o reteste foi menor, as variações nas medidas intrasujeito e intersujeitos foram menores do que em campo livre com o AASI, assim como o desvio padrão dos valores obtidos

No grupo pediátrico, as principais causas de ascite são aquelas relacionadas à hipertensão do sistema porta, especialmente a cirrose de causas variadas. O desenvolvimento de ascite está associado a algumas complicações como a hiponatremia dilucional, a insuficiência renal funcional e a infecção da ascite. Na ausência de uma causa cirúrgica ou intra-abdominal de peritonite, distinguem-se duas formas principais de infecção da ascite: a peritonite bacteriana espontânea (PBE) e a bacteriascite (BA). Define-se a PBE como aquela situação associada a uma contagem de polimorfonucleares (PMN) na ascite > 250 células/μL. A BA é diagnosticada quando a cultura da ascite é positiva, na presença de uma quantidade de PMN na ascite < 250 células/μL. Como a cultura convencional da ascite mostra baixa sensibilidade, sua positividade não é necessária ao diagnóstico da PBE. O advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem permitido a detecção de microrganismos em baixas concentrações, de cultivo exigente, demorado ou não disponível.O objetivo geral deste estudo foi comparar os resultados do método de amplificação da subunidade 16S do gene rRNA com aqueles obtidos pela técnica de cultura automatizada (BACTEC 9240) no diagnóstico de PBE, em crianças e adolescentes com ascite por hipertensão porta (gradiente albumina soro-ascite > 1,1 g/dl), acompanhados na unidade de gastroenterologia pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foram estudados 31 pacientes e 40 paracenteses. A mediana da idade foi de 2,9 anos (intervalo interquartílico: 0,8-8,5 anos). Dezesseis pacientes foram do sexo masculino. Vinte e quatro pacientes eram cirróticos e, destes, vinte foram classificados com Child-Pugh C. A mediana do escore PELD foi de 18,5 (intervalo interquartílico: 0,8 – 8,5 anos). Aproximadamente, 10 mL de ascite foram inoculados, à beira do leito, em frascos de cultura, e incubados no sistema BACTEC 9240. Cerca de 20 mL da amostra foram enviados ao laboratório para a realização da coloração de Gram, para a análise bioquímica, para a contagem total e diferencial de células e para o estudo citopatológico. Simultaneamente, 10 a 30 mL de ascite foram estocadas a – 20o C para detecção do DNA bacteriano. Após extração do DNA com Trizol, a técnica de amplificação foi realizada utilizando-se primers para o gene 16S rRNA. Houve 12 episódios de ascite infectada (8 PBE e 4 BA). A cultura foi positiva em 4/8 casos de PBE. A sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) da cultura para o diagnóstico de PBE foram 50%; 87,5%, 50,0% e 87,5%, respectivamente. A técnica de amplificação do DNA bacteriano foi positiva em 7/8 casos dePBE, em 3/4 casos de BA e em 8 casos que apresentavam ascite com cultura negativa e não neutrocítica (ACNNN). A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN da PCR no diagnóstico de PBE foram 85,7%, 65,6%, 38,8% e 95,5%, respectivamente. Os pacientes com ACNNN foram classificados de acordo com os resultados do DNA bacteriano e comparados em relação ao escore PELD, ao gradiente de albumina soro-ascite e à mortalidade em três meses. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada. Concluímos que o método molecular foi mais sensível do que o da cultura no diagnóstico de PBE, podendo se constituir em um teste de triagem dessa complicação. A detecção de DNA bacteriano em 8 pacientes com ACNNN suscita questões a respeito da utilidade do teste também no diagnóstico de BA. / Cirrhosis is the most important cause of portal hypertensive ascites in children. The development of ascites in these patients is related to several complications such as dilutional hyponatremia, functional renal failure and infection of ascites. In the absence of secondary bacterial peritonitis, there are two forms of infected ascites: spontaneous bacterial peritonitis (SBP) defined as a polymorfonuclear (PMN) cell count in ascites > 250/μL and bacterascites (BA) defined as a positive ascites culture with a PMN count < 250 cells/μL. Because ascites culture is often negative, the positivity of ascites culture is not necessary to diagnose SBP. The main applications of the polymerase chain reaction (PCR) include the detection of bacteria in low concentrations, fastidious bacterial pathogens and the detection of slowly growing bacteria. The aim of this study was to compare the amplification of 16S rRNA gene with the BACTEC culture in the diagnosis of SBP, in pediatric patients with portal hypertension ascites (a serum to ascites albumin gradient > 1.1 g/dL) attending the pediatric gastroenterology unit at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Thirty-one patients and forty paracentesis were studied. The median age of patients was 2.9 years (interquartílicoe range: 0.8-8.5). Sixteen patients were male. Cirrhosis of several causes was presented in 24 patients, 20 were classified as Child-Pugh C and the median of PELD score was 18.5 (interquartil range:10.0-27.5). Bacterial aerobic and anaerobic cultures were obtained by bedside inoculation of 10 mL of ascitic fluid into culture bottles wihich were incubated in BACTEC 9240 culture system. A volume of 20 mL of ascites was send to laboratory for the biochemical analyses, Gram’s stain, total and differential cell counts and citology. Simultaneously, 10 to 30 mL of ascites was stored at - 20o C to posterior bacterial DNA detection. After DNA extraction, detection of bacterial DNA was performed using primers for 16S rRNA gene. There were twelve episodes of infected ascites (8 SBP and 4 BA). Culture was positive in 4/8 cases of SBP. The molecular technique was positive in 7/8 cases of SBP and 3/4 cases of BA. For the diagnoses of SBP, the sensitivity, specificity positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of BACTEC culture was 50%, 87.5%, 50% and 87.5%, respectively. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of bacterial DNA was 87.5%, 65.6%, 38.8% and 95.5%. Eight patients with culture-negative nonneutrocytic ascites (CNNNA) had positive bacterial DNA.They are not different of those with CNNNA and negative bacterial DNA in respect of PELD score, serum to albumin ascites gradient or mortality in three month. In conclusion, the amplification of 16S rRNA gene was most sensitive than BACTEC culture in the diagnosis of SBP. The finding of positive bacterial DNA in patients with CNNNA indicates that the method could be useful in the diagnoses of BA as well.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Coordenação e Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Isolados de C. parapsilosis sao fisiologicamente indistinguiveis, mas geneticamente heterogeneos. Em estudo recente, baseado em variacoes da sequencia de ONA observada entre os grupos, Tavanti et al. (2005) propuseram que cada um desses grupos fossem considerados especies distintas, C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis, respectivamente. Objetivos: 1) Avaliar, atraves da tecnica de RAPO, a prevalencia dessas especies em isolados de ICS de varias regioes do Brasil; 2) Verificar o comportamento fenotipico dessas especies, a fim de averiguar possiveis diferencas em relacao ao perfil metabolico, sensibilidade a antifungico e producao de biofilme. Material e Metodos: 141 cepas, identificadas previamente atraves de testes fenotipicos como C. parapsilosis, foram analisadas utilizando a tecnica de RAPO para identificacao de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis utilizando o iniciador 1281. As cepas identificadas como C. orthopsilosis e C. metapsilosis tiveram a regiao ITS do rDNA sequenciada para confirmacao da identidade. Posteriormente, as amostras encontradas como C. orthopsilosis, C. metapsilosis e 24 cepas de C. parapsilosis foram avaliadas em relacao aos seguintes testes fenotipicos: i) micromorfologia, ii) crescimento em caldo hipertonico, iii) tolerancia a temperatura de 42° C, iv) perfil bioquimico utilizando o sistema 1032 C, v) teste de susceptibilidade a antifungicos (TSA) pelo metodo de microdiluicao em caldo, utilizando anfotericina B, fluconazol, itraconazol, voriconazol, 5-fluorocitosina e caspofungina, vi) producao e quantificacao de biofilme pelo metodo de coloracao com cristal violeta. Resultados: 124 (87,9 por cento) isolados foram identificados como C. parapsilosis, 13 (9,2 por cento) isolados como C. orthopsilosis e 4 (2,9 por cento) como C. metapsilosis. Nao foi possivel a identificacao de apenas 3 isolados pela tecnica de RAPO, porem sua identificacao foi confirmada como C. orthopsilosis atraves de sequenciamento da regiao ITS do rDNA. O comportamento dos isolados das 3 especies foi semelhante em relacao ao crescimento em alta temperatura e alta concentracao salina. Nao houve diferencas micromorfologicas relevantes entre as especies. Atraves do sistema de 1032 C, foi possivel observar que somente 3 isolados de C. metapsilosis (60 por cento), foram tolerantes a actidiona e 1 (20 por cento) assimilou o acucar ribose. Quanto ao TSA, a ocorrencia de resistencia entre os isolados foi vista somente para 2 cepas frente a 5-fluorocitosina. Em relacao ao biofilme, 60 por cento (15) das cepas de C. parapsilosis foram fortes produtoras de biofilme seguidas de 14,3 por cento (2) das cepas de C. orthopsilosis. Todos os isolados de C. metapsilosis deste estudo revelaram ser fracos produtores de biofilme. Conclusao: A tecnica de RAPO, empregando o iniciador 1281, apresentou-se como um metodo pratico, rapido e eficaz na diferenciacao das especies do complexo C. parapsilosis, identificando 97,9 por cento das cepas estudadas. C. parapsilosis foi a especie mais prevalente como patogeno de infeccao sistemica que as especies do complexo C. parapsilosis. Quanto as provas fenotipicas, podemos concluir que nao sao eficientes na identificacao de especies deste complexo, sendo necessario o uso de ferramentas moleculares para correta identificacao das mesmas. Tendo em vista poucas alteracoes em relacao a susceptibilidade a drogas entre as especies do complexo, o interesse maior na identificacao esta relacionado a estudos epidemiologicos / Introduction: Candida parapsilosis strains are physiologically similar but genetically different. Some studies based on molecular methods clearly divided C. parapsilosis into three different groups (I, II and III). Recently, Tavanti et al. (2005) detected coding genes polymorphisms and suggested the replacement of the old nomenclature of C. parapsilosis groups I, II and III into 3 new species: Candida parapsilosis, Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis, respectively. Objectives: 1) To evaluate the prevalence of these species within blood stream isolates from different Brazilian geographic areas using RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA); 2) To study phenotypic characteristic of these 3 species to evaluate possible differences on biochemical profile, susceptibility to antifungal drugs and biofilms production. Material and Methods: Species identification by RAPD using the primer 1281 was carried out for isolates previously identified as C. parapsilosis. RAPD identification confirmation of C. orthopsilosis e C. metapsilosis was done by sequencing the ITS region. Four C. metapsilosis, 13 C. orthopsilosis and 24 C. parapsilosis strains were subjected to the following phenotypic tests: i) micromorphology, ii) hypertonic broth growing, iii) tolerance to 42o C, iv) biochemical profiling using ID32 C system, v) microdilution broth susceptibility testing to amphotericin B, itraconazole, voriconazole, 5- fluorocitosine and caspofungin, vi) Production and quantification of biofilm formation by crystal violet method. Results: 124 (87.9%) isolates were identified as C. parapsilosis, 13 (9.2%) as C. orthopsilosis and 4 (2.9%) as C. metapsilosis. The RAPD technique was not able to identify three isolates as C. orthopsilosis, but this was possible by sequencing the ITS region. No differences were detected among the strains under the high temperature and saline concentration growing conditions. We did not verify major micromorphological differences among the species. Three (60%) C. metapsilosis isolates were tolerant to actidione and one (20%) of them assimilated ribose on ID32C system. Two strains were resistant to 5-fluorocitosine. Fifteen (60%) C. parapsilosis and 2 (14%) C. orthopsilosis strains were high biofilms producers. Conclusion: For strains belonging to the C. parapsilosis complex RAPD method using primer 1281 is a useful tool for species identification. C. parapsilosis had the highest prevalence among all the blood stream samples studied, followed by C. orthopsilosis and C. metapsilosis. Since phenotypic methods are not effective for these species identification, molecular methods should be used. Among the strains belonging to C. parapsilosis complex, minor differences or drug susceptibility were detected, therefore species identification is indicated for epidemiology studies only. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

No grupo pediátrico, as principais causas de ascite são aquelas relacionadas à hipertensão do sistema porta, especialmente a cirrose de causas variadas. O desenvolvimento de ascite está associado a algumas complicações como a hiponatremia dilucional, a insuficiência renal funcional e a infecção da ascite. Na ausência de uma causa cirúrgica ou intra-abdominal de peritonite, distinguem-se duas formas principais de infecção da ascite: a peritonite bacteriana espontânea (PBE) e a bacteriascite (BA). Define-se a PBE como aquela situação associada a uma contagem de polimorfonucleares (PMN) na ascite > 250 células/μL. A BA é diagnosticada quando a cultura da ascite é positiva, na presença de uma quantidade de PMN na ascite < 250 células/μL. Como a cultura convencional da ascite mostra baixa sensibilidade, sua positividade não é necessária ao diagnóstico da PBE. O advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem permitido a detecção de microrganismos em baixas concentrações, de cultivo exigente, demorado ou não disponível.O objetivo geral deste estudo foi comparar os resultados do método de amplificação da subunidade 16S do gene rRNA com aqueles obtidos pela técnica de cultura automatizada (BACTEC 9240) no diagnóstico de PBE, em crianças e adolescentes com ascite por hipertensão porta (gradiente albumina soro-ascite > 1,1 g/dl), acompanhados na unidade de gastroenterologia pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foram estudados 31 pacientes e 40 paracenteses. A mediana da idade foi de 2,9 anos (intervalo interquartílico: 0,8-8,5 anos). Dezesseis pacientes foram do sexo masculino. Vinte e quatro pacientes eram cirróticos e, destes, vinte foram classificados com Child-Pugh C. A mediana do escore PELD foi de 18,5 (intervalo interquartílico: 0,8 – 8,5 anos). Aproximadamente, 10 mL de ascite foram inoculados, à beira do leito, em frascos de cultura, e incubados no sistema BACTEC 9240. Cerca de 20 mL da amostra foram enviados ao laboratório para a realização da coloração de Gram, para a análise bioquímica, para a contagem total e diferencial de células e para o estudo citopatológico. Simultaneamente, 10 a 30 mL de ascite foram estocadas a – 20o C para detecção do DNA bacteriano. Após extração do DNA com Trizol, a técnica de amplificação foi realizada utilizando-se primers para o gene 16S rRNA. Houve 12 episódios de ascite infectada (8 PBE e 4 BA). A cultura foi positiva em 4/8 casos de PBE. A sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) da cultura para o diagnóstico de PBE foram 50%; 87,5%, 50,0% e 87,5%, respectivamente. A técnica de amplificação do DNA bacteriano foi positiva em 7/8 casos dePBE, em 3/4 casos de BA e em 8 casos que apresentavam ascite com cultura negativa e não neutrocítica (ACNNN). A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN da PCR no diagnóstico de PBE foram 85,7%, 65,6%, 38,8% e 95,5%, respectivamente. Os pacientes com ACNNN foram classificados de acordo com os resultados do DNA bacteriano e comparados em relação ao escore PELD, ao gradiente de albumina soro-ascite e à mortalidade em três meses. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada. Concluímos que o método molecular foi mais sensível do que o da cultura no diagnóstico de PBE, podendo se constituir em um teste de triagem dessa complicação. A detecção de DNA bacteriano em 8 pacientes com ACNNN suscita questões a respeito da utilidade do teste também no diagnóstico de BA. / Cirrhosis is the most important cause of portal hypertensive ascites in children. The development of ascites in these patients is related to several complications such as dilutional hyponatremia, functional renal failure and infection of ascites. In the absence of secondary bacterial peritonitis, there are two forms of infected ascites: spontaneous bacterial peritonitis (SBP) defined as a polymorfonuclear (PMN) cell count in ascites > 250/μL and bacterascites (BA) defined as a positive ascites culture with a PMN count < 250 cells/μL. Because ascites culture is often negative, the positivity of ascites culture is not necessary to diagnose SBP. The main applications of the polymerase chain reaction (PCR) include the detection of bacteria in low concentrations, fastidious bacterial pathogens and the detection of slowly growing bacteria. The aim of this study was to compare the amplification of 16S rRNA gene with the BACTEC culture in the diagnosis of SBP, in pediatric patients with portal hypertension ascites (a serum to ascites albumin gradient > 1.1 g/dL) attending the pediatric gastroenterology unit at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Thirty-one patients and forty paracentesis were studied. The median age of patients was 2.9 years (interquartílicoe range: 0.8-8.5). Sixteen patients were male. Cirrhosis of several causes was presented in 24 patients, 20 were classified as Child-Pugh C and the median of PELD score was 18.5 (interquartil range:10.0-27.5). Bacterial aerobic and anaerobic cultures were obtained by bedside inoculation of 10 mL of ascitic fluid into culture bottles wihich were incubated in BACTEC 9240 culture system. A volume of 20 mL of ascites was send to laboratory for the biochemical analyses, Gram’s stain, total and differential cell counts and citology. Simultaneously, 10 to 30 mL of ascites was stored at - 20o C to posterior bacterial DNA detection. After DNA extraction, detection of bacterial DNA was performed using primers for 16S rRNA gene. There were twelve episodes of infected ascites (8 SBP and 4 BA). Culture was positive in 4/8 cases of SBP. The molecular technique was positive in 7/8 cases of SBP and 3/4 cases of BA. For the diagnoses of SBP, the sensitivity, specificity positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of BACTEC culture was 50%, 87.5%, 50% and 87.5%, respectively. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of bacterial DNA was 87.5%, 65.6%, 38.8% and 95.5%. Eight patients with culture-negative nonneutrocytic ascites (CNNNA) had positive bacterial DNA.They are not different of those with CNNNA and negative bacterial DNA in respect of PELD score, serum to albumin ascites gradient or mortality in three month. In conclusion, the amplification of 16S rRNA gene was most sensitive than BACTEC culture in the diagnosis of SBP. The finding of positive bacterial DNA in patients with CNNNA indicates that the method could be useful in the diagnoses of BA as well.

No grupo pediátrico, as principais causas de ascite são aquelas relacionadas à hipertensão do sistema porta, especialmente a cirrose de causas variadas. O desenvolvimento de ascite está associado a algumas complicações como a hiponatremia dilucional, a insuficiência renal funcional e a infecção da ascite. Na ausência de uma causa cirúrgica ou intra-abdominal de peritonite, distinguem-se duas formas principais de infecção da ascite: a peritonite bacteriana espontânea (PBE) e a bacteriascite (BA). Define-se a PBE como aquela situação associada a uma contagem de polimorfonucleares (PMN) na ascite > 250 células/μL. A BA é diagnosticada quando a cultura da ascite é positiva, na presença de uma quantidade de PMN na ascite < 250 células/μL. Como a cultura convencional da ascite mostra baixa sensibilidade, sua positividade não é necessária ao diagnóstico da PBE. O advento da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem permitido a detecção de microrganismos em baixas concentrações, de cultivo exigente, demorado ou não disponível.O objetivo geral deste estudo foi comparar os resultados do método de amplificação da subunidade 16S do gene rRNA com aqueles obtidos pela técnica de cultura automatizada (BACTEC 9240) no diagnóstico de PBE, em crianças e adolescentes com ascite por hipertensão porta (gradiente albumina soro-ascite > 1,1 g/dl), acompanhados na unidade de gastroenterologia pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foram estudados 31 pacientes e 40 paracenteses. A mediana da idade foi de 2,9 anos (intervalo interquartílico: 0,8-8,5 anos). Dezesseis pacientes foram do sexo masculino. Vinte e quatro pacientes eram cirróticos e, destes, vinte foram classificados com Child-Pugh C. A mediana do escore PELD foi de 18,5 (intervalo interquartílico: 0,8 – 8,5 anos). Aproximadamente, 10 mL de ascite foram inoculados, à beira do leito, em frascos de cultura, e incubados no sistema BACTEC 9240. Cerca de 20 mL da amostra foram enviados ao laboratório para a realização da coloração de Gram, para a análise bioquímica, para a contagem total e diferencial de células e para o estudo citopatológico. Simultaneamente, 10 a 30 mL de ascite foram estocadas a – 20o C para detecção do DNA bacteriano. Após extração do DNA com Trizol, a técnica de amplificação foi realizada utilizando-se primers para o gene 16S rRNA. Houve 12 episódios de ascite infectada (8 PBE e 4 BA). A cultura foi positiva em 4/8 casos de PBE. A sensibilidade, a especificidade e os valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN) da cultura para o diagnóstico de PBE foram 50%; 87,5%, 50,0% e 87,5%, respectivamente. A técnica de amplificação do DNA bacteriano foi positiva em 7/8 casos dePBE, em 3/4 casos de BA e em 8 casos que apresentavam ascite com cultura negativa e não neutrocítica (ACNNN). A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN da PCR no diagnóstico de PBE foram 85,7%, 65,6%, 38,8% e 95,5%, respectivamente. Os pacientes com ACNNN foram classificados de acordo com os resultados do DNA bacteriano e comparados em relação ao escore PELD, ao gradiente de albumina soro-ascite e à mortalidade em três meses. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada. Concluímos que o método molecular foi mais sensível do que o da cultura no diagnóstico de PBE, podendo se constituir em um teste de triagem dessa complicação. A detecção de DNA bacteriano em 8 pacientes com ACNNN suscita questões a respeito da utilidade do teste também no diagnóstico de BA. / Cirrhosis is the most important cause of portal hypertensive ascites in children. The development of ascites in these patients is related to several complications such as dilutional hyponatremia, functional renal failure and infection of ascites. In the absence of secondary bacterial peritonitis, there are two forms of infected ascites: spontaneous bacterial peritonitis (SBP) defined as a polymorfonuclear (PMN) cell count in ascites > 250/μL and bacterascites (BA) defined as a positive ascites culture with a PMN count < 250 cells/μL. Because ascites culture is often negative, the positivity of ascites culture is not necessary to diagnose SBP. The main applications of the polymerase chain reaction (PCR) include the detection of bacteria in low concentrations, fastidious bacterial pathogens and the detection of slowly growing bacteria. The aim of this study was to compare the amplification of 16S rRNA gene with the BACTEC culture in the diagnosis of SBP, in pediatric patients with portal hypertension ascites (a serum to ascites albumin gradient > 1.1 g/dL) attending the pediatric gastroenterology unit at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Thirty-one patients and forty paracentesis were studied. The median age of patients was 2.9 years (interquartílicoe range: 0.8-8.5). Sixteen patients were male. Cirrhosis of several causes was presented in 24 patients, 20 were classified as Child-Pugh C and the median of PELD score was 18.5 (interquartil range:10.0-27.5). Bacterial aerobic and anaerobic cultures were obtained by bedside inoculation of 10 mL of ascitic fluid into culture bottles wihich were incubated in BACTEC 9240 culture system. A volume of 20 mL of ascites was send to laboratory for the biochemical analyses, Gram’s stain, total and differential cell counts and citology. Simultaneously, 10 to 30 mL of ascites was stored at - 20o C to posterior bacterial DNA detection. After DNA extraction, detection of bacterial DNA was performed using primers for 16S rRNA gene. There were twelve episodes of infected ascites (8 SBP and 4 BA). Culture was positive in 4/8 cases of SBP. The molecular technique was positive in 7/8 cases of SBP and 3/4 cases of BA. For the diagnoses of SBP, the sensitivity, specificity positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of BACTEC culture was 50%, 87.5%, 50% and 87.5%, respectively. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of bacterial DNA was 87.5%, 65.6%, 38.8% and 95.5%. Eight patients with culture-negative nonneutrocytic ascites (CNNNA) had positive bacterial DNA.They are not different of those with CNNNA and negative bacterial DNA in respect of PELD score, serum to albumin ascites gradient or mortality in three month. In conclusion, the amplification of 16S rRNA gene was most sensitive than BACTEC culture in the diagnosis of SBP. The finding of positive bacterial DNA in patients with CNNNA indicates that the method could be useful in the diagnoses of BA as well.