A utilização de sequências do DNA mitocondrial (mtDNA) como marcadores moleculares na investigação da diversidade genética e evolução é muito difundida, auxiliando na realização de inferências em inúmeros trabalhos. Apesar de sua inegável importância, a utilização dessas sequências como marcadores moleculares suscita algumas questões. A heteroplasmia, por exemplo, é reconhecida como um desafio na utilização de sequências do mtDNA. Este estado ocorre quando um organismo apresenta diferentes haplótipos mitocondriais. Em um trabalho anterior, foram encontrados indícios que sugeriam a presença de heteroplasmia na espécie de abelha Bombus morio. O trabalho atual investigou de forma mais detalhada a presença de heteroplasmia nessa espécie, assim como fatores que podem influenciar na identificação desse estado. Os resultados obtidos confirmaram a existência de heteroplasmia nessa espécie, e identificaram que alguns haplótipos heteroplásmicos foram compartilhados entre indivíduos de localidades distintas. Esses haplótipos heteroplásmicos compartilhados sugerem a existência de heteroplasmia estável em B. morio, o que pode influenciar inferências evolutivas, e em especial, os estudos populacionais. Também foi detectada a presença de NUMTs, pseudogenes nucleares resultantes da transferência de sequências do mtDNA para o genoma nuclear. Esses NUMTs apresentaram grande divergência de sequência em relação aos haplótipos mitocondriais, o que poderia afetar análises filogenéticas e populacionais, além da identificação de espécies por meio do DNA barcoding. Ainda, erros de amplificação podem ser falsamente interpretados como variação intraindividual do DNA mitocondrial (mtDNA), superestimando o número de haplótipos, principalmente quando polimerases de baixa fidelidade são utilizadas. Por fim, os resultados observados neste trabalho sugerem que a utilização de sequências do mtDNA deve ser utilizada de forma cautelosa, e indícios de heteroplasmia, como a presença de picos duplos, não devem ser ignorados. Quando essas evidências são observadas investigações mais detalhadas devem ser aplicadas, a fim de aferir qual a sua origem, e, no caso da heteroplasmia ser confirmada, quais as possíveis consequências produzidas pela presença desse estado / The mitochondrial DNA sequences (mtDNA) have been widely applied as molecular markers in the investigation of genetic diversity and evolution. Despite its undeniable importance, the use of these sequences as molecular markers may present some drawbacks. Heteroplasmy, for example, is recognized as a challenge. This state occurs when an individual has different mitochondrial haplotypes. In a previous work, evidences suggesting the presence of heteroplasmy in the bumblebee Bombus morio were verified. The present work investigated in more detail the presence of heteroplasmy in this species, as well as factors that may influence the identification of this state. The results confirmed the existence of heteroplasmy in this species, and identified that some heteroplasmic haplotypes were shared between individuals from different locations. These shared heteroplasmic haplotypes suggest the existence of stable heteroplasmy in B. morio, which may interfere in evolutionary inferences, especially in population studies. NUMTs, nuclear pseudogenes resulting from the transfer of mtDNA sequences to the nuclear genome, were also detected. These NUMTs showed great sequence divergence from mitochondrial haplotypes, which could affect phylogenetic and population analyzes, as well as species identification through DNA barcoding. In addition, it was observed that amplification errors might be misinterpreted as mtDNA intraindividual variation and overestimates the number of intraindividual haplotypes, especially when low fidelity polymerases are used. Finally, the results observed in this study suggest that the use of mtDNA sequences should be used carefully, and evidences of heteroplasmy, such as the presence of double peaks, should not be ignored. Additional investigations should be applied in case of heteroplasmy evidences to ascertain your source and the consequences of the presence of this state

Resumo não disponível.

Entre as doenças causadas por bactérias do gênero Mycobacterium, a tuberculose por M. tuberculosis é a mais conhecida. O diagnóstico da doença é feito utilizando-se um conjunto de exames que possibilitam a identificação da mesma (WATT, 2000). Contudo, sabe-se que o diagnóstico combinado de microscopia direta e com o posterior isolamento em meio de cultivo é o “padrão-ouro”. A principal desvantagem desse método é que tal bactéria possui um crescimento lento (cerca de 8 semanas). Recentemente, a detecção de doenças através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem proporcionado avanços significativos no diagnóstico. O uso da amplificação específica de genes, para identificar a M. tuberculosis, tais como rDNA 16S, IS6110 ou a região intergênica senX3-regX3, tem apresentado algumas restrições, ao nível de confiabilidade e sensibilidade, para a aplicação da técnica de PCR. O presente estudo mostra a construção e a aplicação de um novo alvo para a aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose, baseado no ensaio da diferença de organização gênica do operon plcA, B e C diferenciando a M. tuberculosis das demais micobactérias. Neste trabalho, foram examinadas 273 amostras de pacientes com suspeita de tuberculose, sendo estas submetidas ao estudo comparativo da técnica de PCR versus cultivo (padrão ouro). A PCR amplificou fragmentos de 439pb. Os resultados mostram 93,7% de acurácia para PCR/Cultivo (p<000,1), 93,1% de sensibilidade com intervalo de confiança de 88,7-96,0 e especificidade de 96,4% com intervalo de confiança de 96,4-99,4. O valor da estatística Kappa (k) foi de 0,82 com erro padrão de 0,041, demonstrando um alinhamento quase perfeito para a verificação do grau de concordância entre os testes. Desta forma, o uso desta nova região para a amplificação da PCR se mostra uma importante e confiável ferramenta no diagnóstico específico da tuberculose. Outra região que compreende parte dos genes mbaA e inhA foi utilizada para diferenciar o Complexo tuberculosis do Complexo avium. Porém, novos experimentos serão necessários para o emprego desta região como uma ferramenta de diagnóstico.

Orientador: Antonio Fernando Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T13:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mathiazzi_IsabellaChiarini_M.pdf: 1597687 bytes, checksum: 20d1c4dff9a3dbb344a4d175911ae3cb (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A fibrose cística (FC) é uma doença multissistêmica, hereditária, limitante da vida. As infecções respiratórias, principalmente por Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) são responsáveis por repetidas exacerbações pulmonares, que evoluem para deterioração da função pulmonar, principal causa de morbi-mortalidade da FC. Este estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade genotípica e fenotípica da P. aeruginosa isolada em dois momentos na evolução da doença pulmonar em pacientes com FC atendidos em um centro de referência. Foi realizado um estudo descritivo longitudinal. A secreção respiratória foi coletada sob a forma de escarro ou swab de orofaringe, efetuada sua identificação microbiológica e análise por Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Os dados foram apresentados de forma descritiva e em tabelas, o programa utilizado foi o SAS versão 8.02. Foram incluídos 81 pacientes, 52 apresentaram P. aeruginosa e 29 não apresentaram, foram identificadas 71 cepas não - mucóide e 67 mucóide. RAPD identificou 14 padrões com o primer 208 e 10 padrões com o primer 272. Exceto no caso dos irmãos gêmeos, não foram observadas cepas com mesmo padrão. Em nosso estudo, verificamos heterogeneidade da P. aeruginosa, independente do fenótipo da colônia. Observamos que 35,29% dos pacientes mantiveram um único genótipo. Os resultados mostraram: uma distribuição homogênea das cepas mucóide e não-mucóide; ausência de relação entre o genótipo e o fenótipo da P. aeruginosa; heterogeneidade fenotípica e genotípica da P. aeruginosa entre os pacientes fibrocísticos e na evolução de um mesmo paciente; evidências de não aquisição da P. aeruginosa pelos pacientes no ambiente de nosso centro de atendimento; um único caso de infecção cruzada (gemelares) / Abstract: Cystic fibrosis (CF) is a multiorgan inherited disease, and it restricts life. The respiratory infections, mainly by Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), are responsible for repeated lung exacerbations, which progress to the deterioration of lung functioning, the main cause of morbi-mortality of CF. The purpose of this work was to analyze the variability of P. aeruginosa regarding its genetic and phenotypic characteristics isolated in two moments during the evolution of the lung disease in patients with CF. A longitudinal descriptive study was performed. Respiratory secretion was collected as sputum or oropharynx swab, its microbiological identification and analysis by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). The data were presented in a descriptive way and in tables; SAS 8.02 the program used. 81 of the patients were included, 52 presented P. aeruginosa, 29 didn¿t present it; non-mucoid strains were identified in 71 of the samples and mucoid strains in 67. RAPD identified 14 patterns with primer 208 and 10 patterns with primer 272. With exception of the twin siblings¿ case, strains with the same pattern were not observed. In our study, we verified high P. aeruginosa heterogeneity, independent of the colony phenotype. We observed that 35,29% of the patients conserved only one P. aeruginosa genotype. The results showed: a balanced distribution of mucoid and non-mucoid strains; that there isn¿t a relationship between the P. aeruginosa genotype and phenotype; there was a phenotypical and genotypical P. aeruginosa heterogeneity among patients with cystic fibrosis and in the evolution of the same patient; there was no evidence of acquisition of P. aeruginosa by the patients environment in our care centre; only one case of cross-infection (twins) / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-08T15:19:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariane Rolins de Santana - 2014.pdf: 1616629 bytes, checksum: 564437916d584de9d3769067e398b29b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-08T15:37:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariane Rolins de Santana - 2014.pdf: 1616629 bytes, checksum: 564437916d584de9d3769067e398b29b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-08T15:37:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ariane Rolins de Santana - 2014.pdf: 1616629 bytes, checksum: 564437916d584de9d3769067e398b29b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-04-10 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Microsatellite markers are widely used to assess the genetic variability in natural populations. These markers can be developed from derived Expressed sequence tag (ESTs) or genomic libraries. A feasible and economical alternative for obtaining of these markers for species that do not already have them is the transferability from primers designed for species evolutionarily close. The species Pterodon emarginatus Vogel (sucupira) belongs to the Fabaceae family and shows great potential for use timber and medicinal, which makes them a target of exploitation. Thus, studies that contribute to their use and conservation are needed, including the genetic population. Therefore, the aim of this study was to evaluate the potential for cross-amplification primers developed for the species Phaseolus vulgaris to P. emarginatus and to analyze the polymorphism of the loci transferred from multiplex genotyping in three populations of this species. For this, were evaluated 539 primers developed for Phaseolus vulgaris, with 345 derived from ESTs libraries and 194 genomics. Amplification tests were performed using three individuals, while the assessment initial of the polymorphism with eight. Finally, genetic diversity parameters were estimated using 88 plants from three natural populations of P. emarginatus. Primers that showed amplification products visualized on agarose gel were then evaluated in 6% acrylamide gel stained with silver nitrate. Polymorphic loci were synthesized with fluorescence for evaluation and genotyping by capillary electrophoresis in ABI3500 automatic DNA analyzer. The loci were transferred to P. emarginatus 23 (4 %) being 7 polymorphic. Polymorphic, 6 electropherograms profiles. These 6 loci were evaluated in populations along with three polymorphic genomic loci previously standardized sucupira, totaling nine loci suitable for genotyping. It was possible to develop two multiplex systems, a compound of 5primers and another for 4. The number of alleles per locus ranged from two to 13, with an average of five alleles per loci. The mean values of He and Ho for both populations were 0,563 and 0,463 respectively. The value of f was not significant for the total population and equal to 0,144. The values FIT and FST were significant and equal to 0,06 and 0,195 respectively. Microsatellite markers transferred and polymorphic for P. emarginatus showed polymorphism and can be used in studies genetic population more depth to the species. / Os marcadores microssatélites são amplamente utilizados para acessar a variabilidade genética em populações naturais. Estes marcadores podem ser desenvolvidos a partir de bibliotecas derivadas de Sequências Expressas Transcritas (ESTs) ou genômicas. Uma alternativa possível e econômica para a obtenção destes marcadores para espécies que ainda não os possuem, é a transferibilidade a partir de primers desenhados para espécies evolutivamente próximas. A espécie Pterodon emarginatus Vogel (sucupira) pertence à família Fabaceae e apresenta grande potencial de uso medicinal e madeireiro, o que faz dela alvo da exploração extrativista. Assim, estudos que contribuam com o seu melhor uso e conservação são necessários, dentre eles os genético-populacionais. Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de amplificação cruzada de primers desenvolvidos para a espécie Phaseolus vulgaris para P. emarginatus e analisar o polimorfismo dos locos transferidos a partir de sistema multiplex de genotipagem em três populações desta espécie. Para tanto, foram avaliados 539 primers desenvolvidos para Phaseolus vulgaris, sendo 345 derivados de bibliotecas de ESTs e 194 genômicos. Os testes de amplificação foram realizados utilizando três indivíduos, enquanto a avaliação inicial do polimorfismo com oito. Por fim, os parâmetros genéticos de diversidade foram estimados utilizando 88 plantas, provenientes de três populações naturais de P. emarginatus. Os primers que apresentaram produtos de amplificação visualizados em gel de agarose foram, posteriormente, avaliados em gel de acrilamida 6% corado com nitrato de prata. Os locos polimórficos foram sintetizados com fluorescência para a avaliação e genotipagem via eletroforese capilar, no analisador automático de DNA ABI3500. Os locos transferidos para P. emarginatus foram 23 (4%) sendo 7 polimórficos. Dos polimórficos, 6 apresentaram bons perfis de eletroferogramas. Estes 6 locos foram avaliados nas populações juntamente com três locos genômicos polimórficos previamente padronizados para sucupira, totalizando nove locos adequados para genotipagem. Foi possível o desenvolvimento de dois sistemas multiplex, um composto de 5 primers e outro por 4. O número de alelos por loco variou de dois a 13, com uma média de cinco alelos por loco. Os valores médios de He e Ho para o conjunto das populações foram de 0,563 e 0,463 respectivamente. O valor de f não foi significativo para o total das populações e igual a 0,144. Os valores de FST e FIT foram significativos e iguais a 0,06 e 0,195 respectivamente. Os marcadores microssatélites transferidos e polimórficos para P. emarginatus apresentaram bom polimorfismo e podem ser utilizados em estudos genético-populacionais mais aprofundados com a espécie.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-04-04T19:57:21Z No. of bitstreams: 2 Tese- Robertha Augusta Vasconcelos Garcia - 2009.pdf: 2415126 bytes, checksum: 9b586c8248beb55e79f44e19660ab318 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-05T10:44:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese- Robertha Augusta Vasconcelos Garcia - 2009.pdf: 2415126 bytes, checksum: 9b586c8248beb55e79f44e19660ab318 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-05T10:44:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese- Robertha Augusta Vasconcelos Garcia - 2009.pdf: 2415126 bytes, checksum: 9b586c8248beb55e79f44e19660ab318 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From the 50 described species of the Phaseolus genera, Phaseolus vulgaris (common bean) is the most cultivated in the world and occupies 85% of the total production area. Brazil has an outstanding position in the world scenario and is considered the main grower, contributing with 17.58% of total production in an area estimated in 4.01 million hectares. Among grain legumes, common bean is the most important for direct human consumption, representing an important source of protein, amino-acids and minerals in the diet of Brazilian population. Breeding programs have searched for ways to increase productivity and simultaneously enhance its nutritional value and decrease the cooking time. The demand on the use of molecular tools has increased in the past few years, aiming to generate information that can be used in genetic breeding programs. This work presents two studies that were conducted from the development of a set of microsatellite markers derived from expressed sequences and genomic libraries. In the first study EST-SSR markers developed with a set of genomic SSR were evaluated for their amplification quality, transferability, genic information content and polymorphism in the Bat 93 x Jalo EEP558 population study. A total of markers 377 EST-SRR were developed, from which 80% showed PCR amplification products. For the transferability analysis 65 EST-SSR and an additional set of 102 genomic SSR were selected, from which 82% were transferred to, at least, one of the 10 legume species evaluated, where the higher amplification rate was observed between species from the Phaseolus genera (63.67%) and the lower was observed for the Arachis (1.8%). In the characterization of 167 SSR, 72% were polymorphic and the mean estimated PIC varied from 0.53 for genomic SSR to 0.47 to EST-SSR. The analysis of polymorphism in the BJ population revealed that from the 315 markers (302 EST - SSR and 13 genomic), 24% were polymorphic and incorporated to the common bean reference map, totalizing 180 mapped loci with a total map distance of 1154.63cM. The second study presents the construction of a genetic map using a population derived from the cross CNFM 7875 x Laranja, where 132 families were obtained and evaluated in three generations, three locations and four experiments where the genotypic data were obtained. A set of 1,034 SSR loci were tested for polymorphism and 105 (10%) were polymorphic and 93 were mapped on 12 linkage groups with a total map length of 1,369.9cM. The analysis of the phenotypic data indicated that the families show great variability for cooking time. The coefficients of heritability between the means varied between 42.89% and 62.85%. QTL mapping was performed using composite interval mapping and eight regions were associated to the control of this trait, varying from 2 to 4 QTL in generations F2:3 e F2:5, respectively. Significant interactions were observed between QTL and locations, but one QTL was stable between generations conducted in the same environment. The proportion of the phenotypic variation explained by the QTL varied from 3.35% to 21.77%. / Das 50 espécies do gênero Phaseolus descritas, a espécie Phaseolus vulgaris (feijoeiro comum) é a mais cultivada no mundo, ocupando 85% da área total de produção. O Brasil ocupa posição de destaque, sendo o maior produtor mundial, contribuindo com 17,58% da produção total, com área de cultivo estimada em 4,01 milhões de ha. Dentre os legumes de grãos, o feijoeiro comum é o mais importante para o consumo direto humano em todos os continentes, representando uma importante fonte de proteínas, aminoácidos e minerais na dieta alimentar da população brasileira. Programas de melhoramento têm buscado meios de aumentar a produtividade de grãos, aliado a um incremento no valor nutricional e ao atendimento às exigências do consumidor, como a maior facilidade no preparo do alimento. A demanda pelo uso de ferramentas moleculares tem aumentado nos últimos anos visando gerar informações que possam ser agregadas aos programas de melhoramento genético. Esse trabalho apresenta o desenvolvimento de dois estudos que foram conduzidos a partir do desenvolvimento de uma bateria de marcadores microssatélites derivados de seqüências expressas e bibliotecas genômicas. No primeiro estudo, os marcadores EST-SSR desenvolvidos, juntamente com um conjunto de SSRs genômicos, foram avaliados quanto à capacidade de amplificação, transferibilidade, conteúdo de informação gênica e polimorfismo na população Bat 93 x Jalo EEP558 (BJ) para fins de mapeamento. Foram sintetizados 377 EST-SSR, dos quais 80% amplificaram produto de PCR. Para a análise de transferibilidade, foram selecionados 65 EST-SSR e um conjunto adicional de 102 SSR genômicos, dos quais 82% foram transferíveis para, pelo menos, uma das 10 espécies de leguminosas avaliadas, onde o maior índice de amplificação foi observado entre as espécies do gênero Phaseolus (63,67%) e o menor para Arachis (1,8%). Na análise de caracterização dos 167 SSR, 72% foram polimórficos e as estimativas de PIC médio variaram de 0,53 para os SSRs genômicos a 0,47 para os EST-SSR. Quanto ao polimorfismo na população BJ, dos 315 testados (302 EST-SSR e 13 genômicos), 24% foram polimórficos e integrados no mapa de referência da cultura do feijoeiro comum, totalizando 180 locos mapeados, compreendendo uma distância total de mapa de 1154,63 cM. O segundo trabalho apresenta a construção de um mapa genético utilizando uma população derivada do cruzamento CNFM7875 x Laranja, onde foram geradas 132 famílias que foram avaliadas em três gerações e em quatro ambientes dos quais foram obtidos os dados fenotípicos. Uma bateria de 1.034 locos SSR foram avaliados quanto ao polimorfismo, onde apenas 105 (10%) segregaram e 93 foram mapeados em 12 grupos de ligação, com uma extensão final de mapa de 1.369,9 cM. A análise dos dados fenotípicos indicou que as famílias são amplamente variáveis para o tempo de cocção, apresentando coeficientes de herdabilidade no sentido amplo, que variaram de 42,89% a 62,85%. O mapeamento de QTL, utilizando o método de intervalo composto, identificou oito regiões associadas ao controle dessa característica, variando de 2 a 4 QTL na gerações F2:3 e F2:5. Foram observadas interações significativas entre QTL por locais. Porém, foi identificado um (1) QTL estável entre gerações conduzidas em um mesmo ambientes. A proporção da variação fenotípica explicada pelos QTL detectados variou de 3,35% até 21,77%.

Os microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeat) por serem considerados os marcadores moleculares ideais, têm se tornado o suporte principal nas análises genômicas em diferentes organismos. Neste estudo, as freqüências alélicas de seis locos microssatélites desenvolvidos para Sus scrofa domestica (ACTG2, ALOX12A, CGA, IGF1, SW444 e TNFB) foram estimadas em duas espécies de Suiformes, Sus scrofa sp e Tayassu pecari. Foi utilizada uma amostra representativa de 99 indivíduos (85% de T. pecari e 15% de S. scrofa sp). Os marcadores foram altamente variáveis, mostrando entre 4 e 15 alelos. A heterozigose observada variou de 0,13 a 1,00 e o conteúdo de polimorfismo informativo de 0,18 a 0,84. Estes resultados indicaram a conservação entre as espécies de suínos e demonstraram a viabilidade da utilização de iniciadores desenvolvidos para S. s. domestica na análise de outras espécies de Suiformes. / Microsatellites have been considered a superior class of genetic markers over earlier ones and became the most useful for genomic population analysis in a great variety of organisms. In this paper we had estimated genetic frequencies of six STRs (ACTG2, ALOX12A, CGA, IGF1, SW444 and TNFB) developed for Sus scrofa domestica that were used to amplify markers in two natural populations of a neotropical feral Suidae (Sus scrofa sp) and a neotropical species of peccary (Tayassu pecari). High degree of polymorphisms was observed and the number of alleles varied from 4 to 15 for the six analyzed loci. The observed heterozygosity was between 0.13 to 1.00 and PIC values varied from 0.18 to 0.84. The study also showed that these markers are evolutionary conserved, allowing the possibility of heterologous amplification.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo628_1.pdf: 2760892 bytes, checksum: 4f4d01b62e823ef377d8dde927160f8b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Esta tese está dividida em duas partes. Na primeira parte da tese estudamos as propriedades ópticas não lineares de monocamadas de partículas de ouro com tamanhos nanométricos depositadas por sputtering DC e filmes finos com nanoestruturas de ouro/sílica com 1 micrômetro de espessura preparados por co-sputtering RF ambos os materiais depositados sobre substratos dielétricos. As propriedades ópticas não lineares destes materiais foram determinadas usando a técnica de varredura Z para um comprimento de onda de excitação de 800 nm com 150 fs de largura temporal do pulso. A técnica de varredura Z permite a determinação dos índices de refração e absorção não linear simultaneamente usando um único feixe. Devido ao uso de um laser com alta taxa de repetição (76 MHz), foi usada a técnica de varredura Z com controle do efeito térmico ou acumulativo, desenvolvida no nosso laboratório em 2007, que permite separar os efeitos não lineares de origem eletrônica (rápidos) dos demais efeitos (lentos). Para os filmes de ouro preparados pela técnica de sputtering, foram obtidos valores de n2 (índice de refração não linear) da ordem de 10&#8722;11 a 10&#8722;12 cm2/W bem como valores da ordem de 10&#8722;7 e 10&#8722;6 cm/W para o &#945;2(índice de absorção não linear). Para os filmes preparados pela técnica de co-sputtering RF foram obtidos valores da ordem de 10&#8722;11 e 10&#8722;9 cm2/W para o n2. Os efeitos do tratamento térmico dos filmes na não linearidade óptica também foram explorados. Na segunda parte da tese foi estudado o impacto do uso da amplificação Raman em fibras ópticas no meio óptico de transmissão de um sistema híbrido de distribuição de sinais de radio frequência (RF) em médias e longas distâncias usando fibras ópticas. Este sistema chamado RF-sobre-fibra surgiu há algum tempo como alternativa para o crescente aumento das comunicações baseados em tecnologia como GSM, 3G, Wi-fi e WiMAX, que utilizam frequência de operação no intervalo de 1GHz a 10GHz. Medidas foram realizadas usando um amplificador Raman montado no laboratório e as figuras de mérito obtidas mostram que a amplificação Raman é uma técnica adequada para operar nestes tipos de sistema

A amplificação gênica pode ser compreendida como um mecanismo de regulação de expressão protéica em Leishmania. A exposição a concentrações não letais de diferentes drogas isoladamente, como o metotrexato, a primaquina, cloroquina e antimônio levam à amplificação de regiões específicas como as localizadas no cromossomo 6 e no cromossomo 23. Essas linhagens tornam-se resistentes a estas drogas e eventualmente apresentam resistência cruzada a outras. A terbinafina é uma substância sintética utilizada como antifúngico que age pela inibição da esqualeno epoxidase impedindo a síntese de ergosterol, componente da membrana celular de Leishmania. A exposição do parasita à terbinafina leva à amplificação da região H. A fragmentação da região H permitiu delimitar a resistência a 2,8 kb; fragmento T1. Por mutagênese insercional o gene de resistência à terbinafina foi definido e nomeado HTBF. A proteína codificada pelo HTBF possui uma extremidade N-terminal hidrofílica e C-terminal hidrofóbica com quatro alfa-hélices sendo, supostamente, uma proteína integral de membrana. Possui semelhança com a proteína Yip de Saccharomyces cerevisiae, que participa do transporte vesicular do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi. O gene HTBF foi detectado em linhagem sensível de L. major e de outras espécies de Leishmania e seu transcrito em linhagens sensíveis e resistentes de L. major. Levantou-se a hipótese de se tratar de locus de resistência a múltiplas drogas já que as regiões amplificadas, mesmo que induzidas por uma determinada droga, podem levar a resistência a outras. A co-transfecção do gene de resistência ao antimonial MRPA no transfectante portador do HTBF levou à diminuição em até cinco vezes da capacidade de resistência ao antimônio. Apesar dos genes de resistência amplificarem juntos na região H, foi constatado que possuem ação contrária. Sendo que a terbinafina interfere na integridade da membrana celular, levantou-se hipótese na qual a resistência envolveria o mecanismo de reparo de membrana. A perda do fenótipo de resistência pela falta de cálcio sugerindo a inativação desse mecanismo é um fenômeno previsto corroborando a hipótese. / Gene amplification can be recognized as a protein regulation mechanism in Leishmania. Exposure to non-lethal concentrations of different drugs in isolated manner, such as, methotrexate, primaquine, chloroquine and antimony drives the amplification of specific regions. Examples for amplified regions are contained in chromosomes six and 23. The strains become resistant to these drugs and eventu-ally to other drugs as well. Terbinafine is a synthetic substance used as an antifungal agent. Its mechanism of action is by squalene epoxidase inhibition, blocking ergosterol synthesis, a cell membrane component in Leishmania. Parasite exposure to terbinafine elicits H region amplification. H region fragmentation allowed resistance delimitation to 2.8kb, T1 fragment. By insertional mutagenesis terbinafine resistance gene was defined and termed HTBF. HTBF coded protein has a hydrophilic N-terminal and a hydrophobic C-terminal containing four alpha-helixes, putatively, an integral membrane protein. It possesses homology to Saccharomyces cerevisiae Yip protein, which takes part in the vesicular transport from the endoplasmic reticulum to Golgi apparatus. HTBF gene was detected in sensitive L. major strains and other Leishmania species and its transcript was detected in both resistant and sensitive L. major strains. We raised the hypothesis of a multiple drug resistance locus, since amplified regions induced by one drug could elicit resistance to a second drug. Co-transfection of MRPA to the HTBF transfectant led to a five-fold decrease to antimonial resistance level. Even though these resistance genes amplify together in the H region, they have antagonizing mechanisms of action. Since terbinafine action disrupts membrane integrity, we raised a hypothesis in which resistance involves enhancement of membrane repair machinery. Loss of phenotype caused by the lack of calcium suggests the inactivation of this machinery is a predicted phenomenon, corroborating the hypothesis.

Durante o desenvolvimento deste projeto adotou-se como estratégia o sequenciamento de ESTs, com a finalidade de encontrar mensagens relacionadas com desenvolvimento, metabolismo e principalmente amplificação/politenização em glândulas salivares de Rhynchosciara americana, um díptero (Sciarídeo) que apresenta cromossomos politênicos e amplificação gênica rigidamente regulada ao longo do desenvolvimento larval, tanto neste tecido quanto em outros. Um total de 8193 ESTs foi gerado, estas foram anotadas e categorizadas segundo os termos do Gene Ontology Consortium, proporcionando uma visão geral do status metabólico, como em um Northern eletrônico, de um ponto importante no desenvolvimento desta espécie, quando surgem amplificações gênicas específicas e a glândula salivar necessita secretar as proteínas do casulo. Outros frutos deste seqüenciamento foram a determinação de 91 polimorfismos e a criação de uma tabela de códon usage. Diversos ESTs foram identificados com potencial envolvimento com os endociclos observados neste tecido, destes, RaDup e RaMCM5 foram selecionados para estudo. Suas regiões genômicas foram isoladas e suas localizações cromossômicas foram identificadas, em relação a RaDup, toda a porção codificante de seu mensageiro e 12kb de DNA genômico contendo seu gene foram seqüenciados, revelando sua estrutura gênica. Anticorpos foram produzidos para detectar esta proteína, gerando evidências de sua participação tanto na replicação mitótica como nos endociclos presentes nas glândulas salivares. A localização cromossômica de RaDup é um dado muito interessante, pois pela primeira vez um pufe amplificado é relacionado com um gene regulatório. / In this work EST sequencing was used as strategy to find messages related to development, metabolism and polyteny/amplification in salivary glands of Rhynchosciara americana, a dipteran (Sciaridae) that shows in this tissue giant polytene chromosomes and gene amplification tightly regulated throughout development of the larvae. A total of 8193 EST sequences were generated, annotated and categorized using Gene Ontology Consortium terms, providing a general view of the metabolic status, like an electronic Northern, of an important point in development of the larvae, that shows where specific genes are amplified and the salivary gland needs to secrete the proteins to form the cocoon. Other data include determination of 91 SNPs and a statistic of codon usage. Several ESTs were identified with potential connection to endocicles, from these RaDup and RaMCM5 were selected for further studies. Both chromosomal loci were identified and genomic regions isolated, for RaDup the coding region of its mRNA and 12kb of genomic region were completely sequenced, revealing its gene structure, and antibodies were raised against this protein, making evident data about its involvement in replication in mitotic cells and in endocicles in salivary glands. About the chromosomal locus of RaDup, it becomes very interesting, because for the first time one amplified puff can be related to a regulatory gene.