Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-15Bitstream added on 2014-06-13T20:33:51Z : No. of bitstreams: 1 silva_pvc_me_jabo.pdf: 474489 bytes, checksum: 1d66e81d39696776d2b564803c77e0a8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A ocorrência de híbridos entre javalis e suínos, tanto na natureza como em cativeiro, é bastante comum. Assim, tem-se detectado polimorfismo em javalis, variando o número de cromossomos de 36 a 38. Nesse sentido, objetivou-se, com este trabalho, caracterizar geneticamente javalis (Sus scrofa scrofa) puros e híbridos criados no Brasil, por meio de loci de microssatélites (STRs) do suíno doméstico (Sus scrofa domestica). Para efeito de classificação, os animais foram agrupados, segundo análise de pedigree e número diplóide (2n), em 5 grupos genéticos: grupo I, constituído de 59 suínos domésticos; grupo II, formado por 46 javalis puros de origem; grupo III, constituído de 3 híbridos, com 2n=36, provenientes de acasalamentos entre híbridos e retrocruzamentos; grupo IV, representando 30 híbridos com suíno doméstico de ploidia igual a 37 cromossomos; e grupo V, constituídos de 10 híbridos também com o doméstico, porém com 2n=38, conhecidos popularmente como Javaporcos, devido à similaridade cariotípica e fenotípica com o suíno doméstico. O DNA genômico foi extraído e, posteriormente, amplificou-se, pela técnica de PCR, os fragmentos desses microssatélites - IGF1, ACTG2, TNFB -, os quais foram desenvolvidos para a subespécie Sus scrofa domestica. As condições de amplificação foram padronizadas para as amostras de javali realizadas em um termociclador, com as temperaturas de anelamento variando para cada primer. Ao final das amplificações, os produtos dos microssatélites foram colocados em um seqüenciador capilar modelo ABI 3100 Avant (Applied Biosystems). A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, concluiu-se que os microssatélites IGF1, ACTG2 e TNFB, usados em suínos, são eficiente na amplificação heteróloga e podem ser aplicados em javali. Os javalis puros se diferenciam geneticamente dos suínos e dos híbridos... / The occurrence of crossbred animals between wild boar and pigs, both in nature and in captivity, is quite common. Thus, polymorphism has been detected among wild boar, varying chromosomes from 36 to 38. Considering this, the objective of the present work was to perform a genetic characterization of wild boar and crossbred boars raised in Brazil, through. the microsatellites loci (STRs) of the domestic pig (Sus scrofa domestica). For classification purposes, the animals were grouped according to pedigree analysis and diploid number (2n) into 5 genetic groups: group I, composed of 59 domestic pigs with 2n = 38; group II, composed of 46 wild boar with 2n = 36 imported from France in 1997; group III, composed of 3 crossbred animals with 2n = 36 from the crossing between crossbred and backcrossing animals; group IV, composed of 30 crossbred animals with domestic pig with ploidy equal to 37 chromosomes and group V, composed of 10 crossbred animals also with domestic pig, but with 2n = 38, popularly known as “Boarpigs” due to their karyotypic and phenotypic similarity with the domestic pig. The genomic DNA was extracted and, after that, the fragments of these microsatellites - IGF1, ACTG2, TNFB - were amplified through the PCR technique, which were developed for the Sus scrofa domestica species. The amplification conditions were standardized for wild boar samples and performed in a thermocycler with the annealing temperatures varying for each primer. At the end of amplifications, the products of microsatellites were placed in a genetic analyzer model ABI 3100 Avant (Applied Biosystems). Considering the results of this research, the microsatellites IGF1, ACTG2 and TNFB used for pigs, were considered to be efficient on the heterologous amplifications and can also be applied on wild boar. The wild boar differs genetically from pigs and crossbreds... (Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3889.pdf: 1235045 bytes, checksum: 2746983be0ebda15a37ceeb2635ac9c2 (MD5) Previous issue date: 2011-08-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / The Cattle Egret (Bubulcus ibis) is a median sized bird, of African origin, considered as an invasive and exotic species in the American continent. In Brazil, first record was in the north, in 1964. The species have been maintaining a pattern of constant population growth, endangering the reproduction and survivorship of native species, as observed in the archipelago of Fernando de Noronha. The purposes of this work were the isolation of microsatellite loci for the species in question and to genetically characterize Brazilian populations, as a starting point in a study that contributes for the comprehension of the colonization process occurred in the country. Thereafter, two partially enriched genomic libraries were obtained, in which the generated fragments were posteriorly sequenced and analyzed for the presence of microsatellite sequences; being the cloning efficacy of 15.74%. Thirty-two microsatellite loci were selected for the analysis, of which eleven proved to be polymorphic. Content of polymorphic information for these loci varied between 0.079 and 0.453. Fragments of expected size were amplified in the eleven polymorphic loci in other six species from the same family as the Cattle Egret. Six populations from different latitudes in the country were genotyped in seven polymorphic loci. A low variability was found, with mean values of expected heterozigosity in the populations varying between 0.408 and 0.562. The population holding the higher diversity was the northern one, closest to the point of the first historic record of the species in the country. Low genetic structuring by AMOVA was detected, and some values of pairwise Fst and Rst proved to be significant when the pair contained populations from South and North of the country. Effective size (Ne) of the Brazilian population was 6.6 individuals (95% CL: 5.7-7.7). Diversity indices and population parameters analyzed did not show evidence that the dispersion of individuals occurred in a north-south axis, occurring more in an opportunistic and erratic manner. Fernando de Noronha s population, which have been managed by a population control program since 2007, presented diversity levels and population parameters comparable to the mainland populations, what indicates that the species will not be easily eliminated from this area. / A garça-vaqueira (Bubulcus ibis) é uma ave de médio porte, de origem africana, considerada espécie exótica invasora no continente americano. No Brasil, o primeiro registro foi na região norte, em 1964. A espécie vem mantendo um padrão de crescimento populacional constante, ameaçando a reprodução e sobrevivência de outras espécies nativas, como observado no arquipélago de Fernando de Noronha. Os objetivos desse trabalho foram isolar locos de microssatélites específicos para a espécie e caracterizar geneticamente as populações brasileiras, iniciando um estudo que contribui para a compreensão do processo de colonização ocorrido no país. Com esse intuito, foram construídas duas bibliotecas genômicas parciais enriquecidas, cujos fragmentos gerados foram posteriormente sequenciados e analisados quanto à presença de sequências de microssatélites, sendo de 15,74% a eficiência de clonagem. Foram selecionados 32 locos de microssatélites para as análises, dos quais 11 mostraram-se polimórficos. O conteúdo de informação polimórfica para esses locos variou de 0,079 à 0,453. Fragmentos de tamanho esperado foram amplificados nos onze locos polimórficos em outras seis espécies da mesma família. Seis populações de diferentes latitudes do país foram genotipadas em sete locos polimórficos. Uma baixa variabilidade foi encontrada, com valores médios de heterozigosidade esperada variando de 0,408 à 0,562 nas populações. A população detentora de maior diversidade foi a da região norte, mais próxima do ponto do local do primeiro registro histórico da espécie no país. Foi detectada baixa estruturação genética pela AMOVA e alguns valores de Fst e Rst par-a-par se mostraram significativos quando o par incluía populações da região sul e norte do país. O tamanho efetivo (Ne) da população brasileira foi de 6,6 indivíduos (95% CL:5,7-7,7). Os índices de diversidade e os parâmetros populacionais analisados não mostraram evidências de que a dispersão dos indivíduos tenha ocorrido segundo um eixo- norte-sul, mas sim de maneira oportunista e errática. A população de Fernando de Noronha, que vem sendo manejada por um programa de controle populacional desde 2007, apresentou níveis de diversidade e parâmetros populacionais comparáveis às populações do continente, o que indica que a espécie não será facilmente exterminada nessa área.

Caracterização molecular e susceptibilidade antimicrobiana de linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de alimentos no RS Mestranda: Fernanda De Nes Orientador: Jeverson Frazzon Listeria monocytogenes é o microrganismo causador de listeriose, uma doença infecciosa adquirida através do consumo de alimentos contaminados e que afeta principalmente pessoas com o sistema imunológico comprometido como gestantes e recém nascidos. É um microrganismo ambiental, podendo ser encontrado no solo, água e alimentos como vegetais, produtos cárneos, leites crus ou mal pasteurizados, queijos, entre outros. São bactérias invasivas e possuem facilidade para penetrar na célula hospedeira. O ataque a essas células é intermediado pelas internalinas, que são proteínas associadas a genes de virulência. As internalinas InlA e InlB, codificadas pelo gene inlAB, são proteínas associadas com a invasão e internalização da bactéria na célula hospedeira. Este trabalho teve o objetivo de caracterizar um total de 19 linhagens de Listeria monocytogenes, sorovares 1/2b, 1/2a, 4b, 4c, isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas moleculares de Amplificação Randômica do DNA Polimórfico (RAPD) e Análise por Enzimas de Restrição (PCRREA), com a amplificação de um segmento de 2916 pb que incluem partes dos genes inlA e inlB, utilizando para isso duas enzimas de restrição AluI e EcoRI. As técnicas moleculares utilizadas foram ferramentas úteis para caracterizar as linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Ainda, foi observado o perfil de resistência antimicrobiana desses microrganismos frente a vários antimicrobianos, das amostras analisadas todas foram susceptíveis aos antimicrobianos testados. / Listeria monocytogenes is a microorganism which causes listeriosis, an infection disease caused by consuming contaminated food and it mainly affects individuals with the immune system at risk like pregnant women and newborn infants. It is an environmental microorganism, being found in soil, water and food like vegetables, meat products, unpasteurized milk and cheese. They are invasive bacteria which have special facility to penetrate the host cell. The attack to those cells is carried out by internalins, which are proteins associated with virulence genes. The InlA and InlB internalins, codified by inlAB gene, are proteins associated with the invasion and internalization of the bacteria in the host cell. This work aimed at categorizing a total of 19 strains of Listeria monocytogenes, 1/2b, 1/2a, 4b and 4c serovars, isolated from dairy products from the State of Rio Grande do Sul. For the molecular categorization, it was used the molecular techniques of Polymorphic DNA Random Amplification (RAPD) and Restriction Enzymatic Analysis (PCR-REA), with the amplification of a segment of 2916 pb which includes part of inlA and inlB genes, using for that purpose two restriction enzymes, AluI and EcoRI. The molecular techniques applied were useful tools to categorize strains of L. monocytogenes isolated from dairy products of the State of Rio Grande do Sul. Furthermore, it was observed the antimicrobial resistant profile of those microorganisms in front of various antimicrobials. All of the analyzed samples were susceptible to tested antimicrobials.

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-19T20:53:36Z No. of bitstreams: 1 LARISSA CAVALCANTE COSTA - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015..pdf: 1987711 bytes, checksum: 9d66a83ab8d2cec764aeaa785de117d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-19T20:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LARISSA CAVALCANTE COSTA - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2015..pdf: 1987711 bytes, checksum: 9d66a83ab8d2cec764aeaa785de117d4 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / CNPq / O gênero Begomovirus pertence à família Geminiviridae de vírus que infectam plantas e são transmitidos pelo vetor mosca branca (Bemisia tabaci), também considerado umas das maiores pragas da agricultura. O presente estudo investigou a diversidade de begomovírus presente no vetor mosca branca (B. tabaci) em áreas da Paraíba, Minas Gerais e Distrito Federal. Um total de 17 amostras de moscas brancas foi coletado a partir de 12 espécies vegetaisem áreas da Paraíba, Minas Gerais e Distrito Federal e e usado para detecção do DNA-A de begomovirus por PCR, por RCA e por PCR-RCA, com primers específicos. Amplicons virais foram clonados e os clones recombinantes foram selecionados sob meio de cultura seletivo, contendo X-Gal e IPTG. A presença de amplicons foi confirmada por padrões de restrição gerados pelas enzimas EcoR I e Msp I em DNAs plasmidiais isolados dos clones selecionados e, então, sequenciados. As sequencias de DNA-A de begomovírus isoladas de moscas brancas coletadas em plantas de algodoeiro EMEPA-PB, em Emília, picão preto, barba-de-falcão, jatrofa, berinjela e malvona, presentes na área do Distrito Federal, foram analisadas quanto a porcentagem de identidade de sequencias de nucleotídeos e agrupamentos filogenéticos comparando com outras sequencias de isolados de begomovírus disponíveis no banco de dados GenBank. Como resultado, 5 espécies de begomovírus (SiYBV, CoMoV, SiMMV, BGMV e SiGLSV) evidenciaram a diversidade de begomovírus presente em moscas brancas nas áreas estudadas, mas que não necessariamente está presente nas respectivas plantas onde as moscas foram coletadas. Os primers PAL1v 1978 e PAR1c 496 descritos para detecção de DNA-A de begomovírus a partir de plantas foram eficientes para detecção específica desse componente genômico viral a partir do vetor mosca branca. A detecção específica de DNA-A do componente de begomovírus por PCR a partir do DNA total extraído de moscas brancas foi enriquecida pela amplificação por RCA. O begomovírus BGMV foi predominantemente encontrado em moscas brancas coletadas em plantas na área do Distrito Federal. A diversidade presente nos isolados dos 5 vírus identificados neste trabalho foi agrupada em 4 ramos filogenéticos suportados pela porcentagem de identidade de sequencias de nucleotídeos comparadas com sequencias dos isolados de begomovírus disponíveis no banco de dados GenBank / The Begomovirus genus belongs to Geminiviridae family of viruses that infect plants and is transmitted by whitefly (Bemisia tabaci) vector, which is also considered one of the major pests of agriculture. The present study investigated the diversity of begomovirusesin the whitefly vector (B. tabaci) in areas of Paraíba, Minas Gerais and the Federal District. A total of 17 samples of whiteflies were collected from 12 plant species in areas of Paraíba, Minas Gerais and the Federal District and used for the detection of begomovirus DNA-A by PCR, RCA and RCA-PCR with specific primers. Viral amplicons were cloned and the recombinant clones were selected on selective medium containing X-Gal and IPTG. The presence of amplicons was confirmed by restriction enzyme patterns generated by EcoR I and Msp I on plasmid DNAs of selected clones isolated and then sequenced. The begomovirus DNA-A sequences isolated from whiteflies collected from cotton plants EMEPA-PB, in Emilia, black prick, beard-of-hawk, jatropha, eggplant and malvona present in the Federal District, were analyzed bynucleotide sequence identity percentage and phylogenetic groups compared to other begomovirus strain sequences available in GenBank database. As a result, five species of begomovirus (SiYBV, CoMoV, SiMMV, BGMV e SiGLSV) revealed the diversity of begomovirus present in whiteflies in the studied areas, but that is not necessarily present in the respective plants where the flies were collected. The PAL1v 1978 PAR1c 496 primers described for begomovírus DNA-A detection from plants were also efficient for detection of this specific viral genomic component from whitefly vector. The specific detection of begomovirus DNA-A component by PCR from total DNA extracted from whiteflies was enriched by amplification by RCA. The BGMV begomovirus was found predominantly in whiteflies on plants collected in the Federal District. The diversity present in strains of thefive virus identified in this work was grouped into four phylogenetic branches supported by the nucleotide sequence identity percentage compared to sequences of the begomovirus strains available in GenBank database

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4725.pdf: 4003213 bytes, checksum: c40eb861711bbe31a91e5b1600b14b63 (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / Universidade Federal de Sao Carlos / Intellectual disability (ID) is manifest sign of more than 2,000 different clinical conditions and is present in 5% of the population. Because it is a heterogeneous group of clinical conditions, with different causal factors and simultaneously involved, about 50% of patients with ID have no defined etiology. Chromosomal microdeletions, situations in which there is loss of a fragment of up to 5Mb of the genome resulting in haploinsufficiency of one or multiple genes, are one of the possible causes of ID. The aim of this study was to standardize genetic testing with the technique of MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) to investigate the presence of microdeletion syndromes in a sample of patients with idiopathic DI or with diagnosis not yet confirmed by molecular genetic testing. The MLPA kit used (SALSA® MLPA® P064-B2 MR1) detected, at the same time, 11 microdeletion syndromes: 1p36 deletion, Sotos, Miller-Dieker, 22q11.2 deletion, Saethre-Chotzen, Prader-Willi, Angelman, Williams, Alagille, Smith-Magenis and Canavan. We selected 57 patients with idiopathic ID and facial dysmorphias, with normal conventional karyotyping and normal brain imaging studies. The presence of microdeletion was identified in 4 patients (7%), 3 patients had Williams syndrome and 1 had 22q11.2 deletion. The results reinforce the usefulness of MLPA in the etiologic research of ID, helping in the clinical management and familial genetic counseling. / Deficiência intelectual (DI) é sinal manifesto de mais de 2.000 condições clínicas diferentes e está presente em 5% da população. Por se tratar de um grupo heterogêneo de condições clínicas, com fatores causais distintos e simultaneamente envolvidos, cerca de 50% dos pacientes com DI não têm sua etiologia definida. Entre as possíveis causas de DI estão as microdeleções cromossômicas, situações nas quais há perda de um fragmento de até 5Mb do genoma, implicando na haploinsuficiência de um ou múltiplos genes. O objetivo desse trabalho foi padronizar testes genéticos fundamentados na técnica de MLPA (Amplificação de Múltiplas Sondas dependentes de Ligação) para investigar a presença de síndromes de microdeleção em uma amostra de pacientes com DI idiopática ou com hipótese diagnóstica ainda não confirmada por teste genético molecular. O kit de MLPA utilizado (SALSA® MLPA® P064-B2 MR1) detectava, simultaneamente, 11 síndromes de microdeleção: deleção 1p36, Sotos, Miller-Dieker, deleção 22q11.2, Saethre- Chotzen, Prader-Willi, Angelman, Williams, Alagille, Smith-Magenis e Canavan. Foram selecionados clinicamente 57 pacientes com DI e dismorfias faciais, com cariótipo convencional e exame de imagem de encéfalo normais. A presença de microdeleção foi identificada em 4 pacientes (7%), tendo sido detectados 3 pacientes com síndrome de Williams e 1 com deleção 22q11.2. Os resultados reforçam a utilidade da técnica de MLPA na investigação etiológica da DI, ajudando no manejo clínico dos pacientes e no aconselhamento genético familiar.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-07T18:32:03Z No. of bitstreams: 1 DissPPP.pdf: 1959628 bytes, checksum: 65b4132f7bd4b59eb075f69f2b29aac8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-13T19:51:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissPPP.pdf: 1959628 bytes, checksum: 65b4132f7bd4b59eb075f69f2b29aac8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-13T19:51:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissPPP.pdf: 1959628 bytes, checksum: 65b4132f7bd4b59eb075f69f2b29aac8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T19:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPPP.pdf: 1959628 bytes, checksum: 65b4132f7bd4b59eb075f69f2b29aac8 (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / The black lion tamarin (Leontopithecus chrysopygus) is one of the most endangered neotropical primates and the historical causes that led them to the brink of extinction are closely related to the history of the Atlantic Rainforest. Among its main threats are the fragmentation of their habitat, the small number of his surviving populations and the isolation of them, which directly affect the genetic structure of these populations. The use of genetic analysis and molecular markers for the wildlife conservation have been growing over the past few years with the advent of genetic and molecular technologies and bioinformatics, allowing the establishment of rapid diagnosis of diseases and many genetic and ecological parameters such as migration rate, population size, genetic diversity, kinship relations. Among the main molecular markers are microsatellite that consist of short DNA sequences tandemly repeated composed of 1 to 6 bases pairs widely distributed in eukaryotic and prokaryotic genomes. Characteristics like codominance and high level of polymorphism make microsatellites an important tool to measure the loss of genetic diversity and recent changes in genetic structure of populations, and for use in forensic investigations. Among the methods used for the isolation of such markers, is the in silico mining for species with available genetic data. In the present study, we identified 60 tetranucleotide microsatellite loci have been identified in the genome of common marmoset (Callithrix jacchus) through data mining conducted in the genome of this species. Primer pairs were designed and tested in black lion tamarin, since this kind does not have any genomic data available. Of the 60 loci tested, 87% had successful amplification of DNA samples from 10 captive animals. PCR products were analyzed on agarose gel and 13 loci were genotyped in automatic sequencer ABI3730XL. The Geneious version 8.1.6 software was used for genotyping. Only four loci showed polymorphism, observed two alleles per locus. This low polymorphism may be associated with the origin of the captive colonies. / O mico-leão-preto (Leontopithecus chrysopygus) é um dos mais ameaçados primatas neotropicais e as causas históricas que o levaram à beira da extinção estão intimamente relacionadas à história da Mata Atlântica. Entre suas principais ameaças estão a fragmentação de seu habitat, o número reduzido de suas populações sobreviventes e o isolamento das mesmas, as quais afetam diretamente a estrutura genética dessas populações. O uso de análises genéticas e marcadores moleculares a favor da conservação da vida silvestre vêm crescendo ao longo dos últimos anos com o surgimento das tecnologias genéticas, moleculares e da bioinformática, possibilitando o estabelecimento do rápido diagnóstico de doenças e de muitos parâmetros genéticos e ecológicos, como taxa de migração, tamanho populacional, diversidade genética, relações de parentesco. Dentre os principais marcadoes estão os microssatélites que consistem em pequenas sequências de DNA repetidas em tandem compostas de 1 a 6 pares de base amplamente distribuídas nos genomas eucarióticos e procarióticos. Suas características de codominância e alto nível de polimorfismos fazem desses marcadores ferramentas importantes para estimativas de perda de variabilidade e de mudanças recentes na estruturação genética de populações, além do uso em investigações forenses. Dentre os métodos utilizados para o isolamento de tais marcadores, está a mineração in silico para espécies com dados genéticos disponíveis. No presente estudo, identificamos 60 microssatélites tetranucleotídicos no genoma do saguí-de-tufo-branco (Callithrix jacchus) através de Data Mining realizados no genoma desta espécie. Pares de primers foram desenhados e testados em Leontopithecus chrysopygus, uma vez que esta espécie não possui dados genômicos disponíveis. Dos 60 locos testados, 87% tiveram sucesso de amplificação em amostras de DNA provenientes de 10 animais de cativeiro. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose e 13 locos foram genotipados em sequenciador automático ABI3730XL. O programa Geneious versão 8.1.6 foi utilizado para genotipagem. Somente quatro locos demonstraram polimorfismo, sendo observados dois alelos por loco. Esse baixo polimorfismo pode estar associado à origem das colônias de cativeiro.

Introdução. O receptor epidérmico humano 2 (Her-2) e a topoisomerase-IIα (T2A) são dois marcadores biológicos importantes, ambos tendo um valor prognóstico e preditivo potencial em pacientes com tumores sólidos. A amplificação dos genes Her- 2 e T2A são eventos independentes, embora o último seja mais frequente em tumores com amplificação do Her-2 (34-90%), do que em tumores sem amplificação do Her-2 (5-10%). Existe uma melhor correlação entre amplificação e superexpressão do Her-2 no câncer de mama (CM) do que em outros tumores. No entanto, no CM, a correlação entre amplificação e superexpressão da T2A tem sido inconsistente, e existe uma carência de tais dados em outros tipos de tumores. A expressão da proteína T2A tem mostrado uma boa correlação com o índice de proliferação tumoral, particularmente no CM. Objetivos. Artigo 1: Sintetizar o conhecimento atual sobre a importância dos marcadores Her-2 e T2A nos tumores sólidos. Artigo 2: Investigar a prevalência de amplificação e superexpressão do Her-2 e da T2A, a correlação entre estas variáveis e a correlação entre as variáveis e estágio clínico, em amostras de câncer de ovário (CO) fixadas em parafina. Artigo 3: Investigar a prevalência de amplificação da T2A, assim como a correlação entre esta variável e a expressão da proteína T2A e do marcador de proliferação celular Ki-67, em amostras de CM fixadas em parafina, mostrando uma amplificação do Her-2. Métodos. Artigo 1: Os dados foram identificados através de busca em bases de dados eletrônicas (medline), livros de resumos de congressos e referências de artigos de revisão e originais. Artigo 2: 73 amostras de CO foram testadas para amplificação e superexpressão do Her-2 e T2A, por hibridização in situ fluorescente (FISH) e imuno-histoquímica (IHC), respectivamente. Artigo 3: 103 amostras de CM, com amplificação do Her-2, foram testadas para amplificação do gene T2A (por FISH) e superexpressão das proteínas T2A e Ki-67 (por IHC). Resultados. Artigo 2: Com base nos pontos de corte >1.5 e >2 (relação cópias/CEP17), as taxas de amplificação do Her-2 foram 15/64(23.4%) e 8/64(12.5%), versus 16/64(25%) e 5/64(7.8 %) para a T2A. Encontramos somente 3/72(4.2%) casos de superexpressão do Her-2(3+), contra 15/70(21.4%) para a T2A (marcagem em >10% das células). Foi observada uma modesta correlação entre amplificação e superexpressão da T2A (p= 0.01) e uma forte correlação entre amplificação da T2A e do Her-2, quando analisados como variáveis contínuas (p<0.001). A amplificação da T2A correlacionou-se com estágio FIGO avançado (p= 0.02). Artigo 3: Uma amplificação do gene T2A foi observada em 36.9%(38/103) dos casos. Os níveis de amplificação do Her-2 (número de cópias) não se correlacionaram com a amplificação da T2A. A porcentagem média de células positivas para a T2A (por IHC) foi de 5% e 10%, para casos T2A não-amplificados e amplificados, respectivamente. Uma correlação fraca, mas ainda significativa, foi observada entre amplificação do gene T2A e porcentagem de células T2A-positivas por IHC (Spearman=0.23, p=0.02); a correlação entre estas duas variáveis foi mais forte em tumores Ki-67 positivos. Conclusões. Artigo 2 : A avaliação da amplificação e da superexpressão do Her-2 e da T2A, por FISH e IHC, respectivamente, é realizável em amostras de CO. Foi observada uma boa correlação entre a amplificação dos genes Her-2 e T2A, mas a correlação entre amplificação do gene e superexpressão da proteína foi fraca para ambos marcadores. As taxas de amplificação dos genes Her-2 e T2A são mais elevadas quando não é realizada correção para o número de cópias do CEP17. Parece existir uma boa correlação entre amplificação da T2A e estágio clínico avançado. Estudos adicionais serão necessários para determinar o melhor ponto de corte para estes marcadores. Artigo 3: Contrariamente ao Her-2, a amplificação do gene T2A não parece necessariamente levar à superexpressão da proteína no CM. Outros fatores, como o índice de proliferação celular, podem interferir na síntese da proteína T2A. Embora a maioria dos casos de aberrações do gene T2A ocorram em tumores Her-2 positivos, os níveis de amplificação do Her-2 não se correlacionaram com a amplificação do gene T2A. / Background. The human epidermal receptor 2 (Her-2) and topoisomerase-IIα (T2A) are two important biomarkers, with potential prognostic and predictive value in patients with solid tumours. Her-2 and T2A gene amplification are separate events, although the latter is more frequently seen in Her-2 amplified (34-90%) than in Her-2 non-amplified (5-10%) tumours. There is a better correlation between Her-2 amplification and protein overexpression in breast cancer (BC) than in other tumour types. Nevertheless, there is a doubtful correlation between T2A amplification and overexpression in BC, with virtually no data available in other tumour types. In BC, the expression of the T2A protein has shown a good correlation with tumour proliferation rate. Objectives. Article 1: To summarise the available literature on Her-2 and T2A in solid tumours. Article 2: To investigate the prevalence of Her-2 and T2A amplification and overexpression, the correlation between these variables and with clinical stage, in paraffin-embedded samples of ovarian cancer (OC). Article 3: To investigate the prevalence of T2A amplification, as well as the correlation between this variable and the expression of T2A protein and the proliferation marker Ki-67, in paraffinembedded samples of Her-2 amplified BC. Methods. Article 1: The data were identified through search in electronic databases (medline), abstract books and references from review and original articles. Article 2: 73 samples of OC were tested for Her-2 and T2A amplification and overexpression, by fluorescence in situ hybridisation (FISH) and immunohistochemistry (IHC), respectively. Article 3: 103 samples of Her-2 amplified BC were tested for T2A amplification (by FISH) and overexpression (by IHC), and Ki-67 expression (by IHC). Results. Article 2: Based on cut-offs of ≥1.5 and ≥2 (ratio copies/CEP17), amplification rates for Her-2 were 15/64(23.4%) and 8/64(12.5%) versus 16/64(25%) and 5/64(7.8%) for T2A. We found only 3/72(4.2%) cases of Her-2 overexpression(3+) versus 15/70(21.4%) for T2A (staining in >10% of the cells). There was a modest correlation between T2A amplification and overexpression (p=0.01) and a strong correlation between T2A and Her-2 amplification when these markers were analysed as continuous variables (p<0.001). T2A amplification significantly correlated with advanced FIGO stage (p=0.02). Article 3: T2A gene amplification was observed in 36.9%(38/103) of the Her-2 amplified samples. Her-2 amplification level (i.e. copy number) was not predictive of T2A amplification. The median percentage of T2A positive cells for T2A non-amplified and amplified cases were 5% and 10%, respectively. A weak but still significant correlation was observed between T2A gene amplification level and percentage of positively stained cells (Spearman=0.23, p=0.02), the observed correlation being higher in patients with positive staining for Ki-67. Conclusions. Article 2: The assessment of Her-2 and T2A amplification and overexpression by FISH and IHC, respectively, is feasible in OC samples. There was a good correlation between Her-2 and T2A gene amplification, but the correlation between gene amplification and protein overexpression was poor for both markers. Amplification rates were higher in the absence of correction for the number of copies of the CEP17. Finally, we found a good correlation between T2A amplification and advanced disease stage. Further studies should aim to determine the optimal cut-offs for these markers. Article 3: Contrary to Her-2, T2A gene amplification does not always lead to protein overexpression in BC. Other factors, especially tumour proliferation rate, may interfere with the T2A protein status. Although the majority of the cases of T2A gene aberrations are seen in Her-2 positive tumours, the level of Her-2 amplification does not predict for T2A amplification.

O parasita protozoário Leishmania apresenta um genoma plástico e dinâmico onde a amplificação gênica e translocações cromossomais são fenômenos comuns. Tal plasticidade sugere a necessidade de mecanismos robustos de reparo do DNA e de manutenção do genoma. A célula eucariótica desenvolveu sistemas de controle checkpoint que reconhecem estruturas alteradas de DNA e bloqueiam a progressão do ciclo celular permitindo que o reparo do DNA aconteça. Nestas células, o complexo heterotrimérico formado pelas proteínas Hus1, Rad9, e Rad1 participa nas etapas iniciais de reconhecimento e sinalização do estresse replicativo. Neste trabalho mostramos que a proteína Hus1 homóloga de Leishmania major é uma proteína nuclear que melhora a capacidade do parasito em lidar com o estresse replicativo. A análise de northern e PCR em tempo real mostraram que, após a transfecção do gene, a linhagem selecionada apresenta níveis aumentados dos transcritos LmHUS1. A utilização de um anticorpo anti-LmHus1 demonstrou o aumento nos níveis da proteína nestas células. Ainda, a superexpressão de LmHus1 confere resistência às drogas genotóxicas hidroxiuréia (HU) e metil metanosulfonato (MMS), e a resistência à HU correlaciona-se com a redução de dano no DNA após a expressão da LmHus1. A ruptura de um dos alelos LmHUS1 diminui os níveis do seu produto, compromete o crescimento do parasito e proporciona discreta diminuição na resistência às drogas genotóxicas. Resultados preliminares associam a expressão da LmHus1 ao fenômeno de amplificação gênica em L. major. Além disso, a possível quinase Chk1, efetora da sinalização iniciada em Hus1, foi clonada e transfectada no parasito, o anticorpo anti-Chk1 também foi produzido. Finalmente, considerando que LmHus1 funcione na detecção do dano e controle de defeitos na replicação de DNA, formulamos a hipótese de que o produto deste gene atue na forquilha de replicação e participe no fenômeno de rearranjo do DNA e na formação de amplicons neste parasito. / The protozoan parasite Leishmania presents a dynamic and plastic genome in which gene amplification and chromosome translocations are common phenomena. Such plasticity hints at the necessity of dependable genome maintenance pathways. Eukaryotic cells have evolved checkpoint control systems that recognize altered DNA structures and halt cell cycle progression allowing DNA repair to take place. In these cells, the PCNA-related heterotrimeric complex formed by the proteins Hus1, Rad9, and Rad1 is known to participate in the early steps of replicative stress sensing and signaling. Here we show that the Hus1 homolog of Leishmania major is a nuclear protein that improves the cell capability to cope with replicative stress. Northern analysis and real-time PCR showed that after transfection of the gene, the selected lineage presents increase in the LmHUS1 transcripts levels and overexpression was confirmed using anti-LmHus1. Thus, overexpression of LmHus1 confers resistance to the genotoxic drugs hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) and resistance to HU correlates to reduced net DNA damage upon LmHus1 expression. Preliminary results associate the LmHus1 expression to the gene amplification phenomena in L. major. And a possible Chk1-like kinase was cloned and transfected into the parasite, the anti-Chk1 was also produced. Besides, LmHus1 mutant is presented, and the LmHUS1 gene disruption decreases its product levels, leads to serious effects on growth, and presenting an slight decrease in the resistance to genotoxic drugs. Finally, considering the hypothesis that LmHus1 participates in the damage sensing and in the control of the DNA replication threats, we hypothesized that the product of this gene acts in replication forks and is involved in DNA rearrangement s and in the amplicons generation in this parasite.

Caracterização molecular e susceptibilidade antimicrobiana de linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de alimentos no RS Mestranda: Fernanda De Nes Orientador: Jeverson Frazzon Listeria monocytogenes é o microrganismo causador de listeriose, uma doença infecciosa adquirida através do consumo de alimentos contaminados e que afeta principalmente pessoas com o sistema imunológico comprometido como gestantes e recém nascidos. É um microrganismo ambiental, podendo ser encontrado no solo, água e alimentos como vegetais, produtos cárneos, leites crus ou mal pasteurizados, queijos, entre outros. São bactérias invasivas e possuem facilidade para penetrar na célula hospedeira. O ataque a essas células é intermediado pelas internalinas, que são proteínas associadas a genes de virulência. As internalinas InlA e InlB, codificadas pelo gene inlAB, são proteínas associadas com a invasão e internalização da bactéria na célula hospedeira. Este trabalho teve o objetivo de caracterizar um total de 19 linhagens de Listeria monocytogenes, sorovares 1/2b, 1/2a, 4b, 4c, isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Para a caracterização molecular foram utilizadas as técnicas moleculares de Amplificação Randômica do DNA Polimórfico (RAPD) e Análise por Enzimas de Restrição (PCRREA), com a amplificação de um segmento de 2916 pb que incluem partes dos genes inlA e inlB, utilizando para isso duas enzimas de restrição AluI e EcoRI. As técnicas moleculares utilizadas foram ferramentas úteis para caracterizar as linhagens de Listeria monocytogenes isoladas de produtos lácteos do Rio Grande do Sul. Ainda, foi observado o perfil de resistência antimicrobiana desses microrganismos frente a vários antimicrobianos, das amostras analisadas todas foram susceptíveis aos antimicrobianos testados. / Listeria monocytogenes is a microorganism which causes listeriosis, an infection disease caused by consuming contaminated food and it mainly affects individuals with the immune system at risk like pregnant women and newborn infants. It is an environmental microorganism, being found in soil, water and food like vegetables, meat products, unpasteurized milk and cheese. They are invasive bacteria which have special facility to penetrate the host cell. The attack to those cells is carried out by internalins, which are proteins associated with virulence genes. The InlA and InlB internalins, codified by inlAB gene, are proteins associated with the invasion and internalization of the bacteria in the host cell. This work aimed at categorizing a total of 19 strains of Listeria monocytogenes, 1/2b, 1/2a, 4b and 4c serovars, isolated from dairy products from the State of Rio Grande do Sul. For the molecular categorization, it was used the molecular techniques of Polymorphic DNA Random Amplification (RAPD) and Restriction Enzymatic Analysis (PCR-REA), with the amplification of a segment of 2916 pb which includes part of inlA and inlB genes, using for that purpose two restriction enzymes, AluI and EcoRI. The molecular techniques applied were useful tools to categorize strains of L. monocytogenes isolated from dairy products of the State of Rio Grande do Sul. Furthermore, it was observed the antimicrobial resistant profile of those microorganisms in front of various antimicrobials. All of the analyzed samples were susceptible to tested antimicrobials.

O Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (do inglês, EGFR) é uma proteína de membrana celular que consiste em um domínio extracelular para o acoplamento do ligante e em um domínio intracelular apresentando sítio catalítico de tirosinoquinase. Em ~40% dos GBMs primários é observada a amplificação de EGFR resultando na sua hiperexpressão, o que raramente ocorre em GBM secundário. Mais da metade dos casos de GBM com amplificação do receptor está associado com rearranjo do gene, uma forma deletada de EGFR (EGFRvIII). Adicionalmente, o receptor de interleucina 13 alfa-2 (IL-13R 2), apresenta-se abundante e especificamente hiperexpresso em gliomas de alto grau, em particular, GBM. O objetivo do presente estudo é analisar a expressão, amplificação, e deleção de EGFR em astrocitomas, bem como a coexpressão entre esse gene e o da IL-13R 2. Foram analisadas 145 astrocitomas (22 astrocitomas pilocíticos (AP); 22 astrocitomas grau II (AGII); 17 astrocitomas anaplásico (AA); e 84 GBM) e 17 tecidos cerebrais não tumorais provenientes de cirurgia de epilepsia. A deleção EGFRvIII foi analisada por RT-PCR, e confirmada por PCR em tempo real (RQ-PCR). A expressão relativa de EGFR e IL-13R 2 foi estudada por RQ-PCR utilizando-se o método SYBR Green, comparado ao tecido não tumoral, e normalizado para os genes de referência endógena, HPRT e Gus- . A amplificação de EGFR foi também determinada por RQ-PCR com relação ao gene da beta-hemoglobina, descrito como um gene de cópia única. Foi realizada imunohistoquímica para analisar a expressão da proteína EGFR. A deleção EGFRvIII foi somente encontrada em GBM (19/84, 23%), demonstrando a exclusividade dessa alteração num grau tumoral de maior malignidade e uma diminuição da sobrevida desses pacientes (p = 0,030). A hiperexpressão de EGFR foi encontrada em 88 casos (61%), correspondendo a 50% de GBM, 88% de AA, e interessantemente em 77% de AGII e 64% de AP. Da mesma maneira, a hiperexpressão de IL-13R 2 foi encontrada em 62 casos (43%), correspondendo a 48% de GBM, 29% de AA, 18% de AGII e, surpreendentemente em 59% de AP. Embora tenha havido um aumento de expressão de ambos os genes em todos os graus de astrocitomas, não houve coexpressão dos mesmos. A amplificação de EGFR foi observada em 29 casos (20%) correspondendo a 31% de GBM e ainda um caso para cada um dos demais graus de astrocitomas, sendo que dos 29 casos amplificados, 21 pacientes eram mais velhos que 45 anos (p < 0,001) e 50% dos casos de GBM com amplificação de EGFR, apresentaram simultaneamente EGFRvIII. Adicionalmente, o acúmulo citoplasmático da proteína foi detectado em 74 casos (51%), correspondendo a 55% de GBM, 47% de AA, 54,5% de AGII e 37% de AP, além de um acúmulo nuclear detectado em 15% dos casos de astrocitomas difusamente infiltrativos. Assim, a alta freqüência de hiperexpressão dos genes estudados em todos os graus de astrocitomas, principalmente a amplificação de EGFR e a presença da deleção EGFRvIII foram observados entre os astrocitomas de alto grau, especialmente em GBM. Os resultados apresentados contribuem para um melhor direcionamento no futuro em métodos terapêuticos específicos, salientando a importância da análise de expressão molecular, protéica e das alterações mutacionais que envolvem genes candidatos, em particular, EGFR e IL-13R 2 / Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR is a transmembrane protein consisting of an extracellular EGF-binding domain and an intracellular domain with ligand-activated tyrosine kinase activity. In ~40% of primary GBM is observed amplification leading to overexpression of EGFR, but rarely in secondary GBM. Over the half of primary GBM with EGFR amplification is associated to gene rearrangement, a deleted form of EGFR (EGFRvIII). Additionally, the interleukin-13 alpha 2 receptor (IL13R 2) is abundant and specifically overexpressed in high-grade gliomas, particularly in GBM. The aim of the present study is to analyze the EGFR expression, amplification, and deletion in astrocytomas as well as its coexpression with IL13R 2. We have analyzed 145 surgical astrocytoma samples (22 pilocytic astrocytomas (PA); 22 low-grade astrocytomas (LGA); 17 anaplastic astrocytomas (AA); and 84 GBM) and 17 non-neoplastic brain tissue from epilepsy surgery. EGFRvIII deletion was analyzed by RT-PCR, and also confirmed by real time PCR (RQ-PCR). The relative EGFR and IL-13R 2 expression was studied by RQ-PCR using SYBR Green method, compared to non-neoplastic tissue, normalized for HPRT and Gus- genes. The EGFR amplification was also determined by RQ-PCR relative to the hemoglobin beta gene, described as a single copy gene. Immunohistochemistry was performed to analyze the protein expression in tumor samples. The EGFRvIII deletion was found only in GBM cases (19/84, 23%) demonstrating the exclusivity of this alteration in higher tumor grade and survival was decreased in these patients (p = 0.030). EGFR overexpression was found in 88 cases (61%), corresponding to 50% of GBM, 88% of AA, and interestingly in 77% of LGA and 64% of PA. In the same way, the overexpression of IL-13R 2 was found in 62 cases (43%), corresponding to 48% of GBM, 29% of AA, 18% of LGA and, surprising in 59% of PA. Although increased expression of both genes was demonstrated in all astrocytoma grades, it was no coexpression of the genes. The amplification was observed in 29 cases (20%) corresponding to 31% of GBM and only one case each of PA, LGA and AA. Among 29 cases with EGFR amplification, 21 patients were older than 45 years (p < 0.001) and 50% of GBM with EGFR amplification presented simultaneously the EGFRvIII. Moreover, the EGFR cytoplasmic accumulation was detected in 74 cases (51%), corresponding to 55% of GBM, 47% of AA, 54.5% of LGA and 37% of PA, and nuclear accumulation was detected in 15% of diffusely infiltrative astrocytomas. Thus, the high overexpression frequency of the genes studied in all grades of astrocytomas, mainly the EGFR amplification and presence of EGFRvIII deletion were observed among high-grade astrocytomas, mainly in GBM. The present results contribute to better tailoring specific future therapeutical approach in patients with astrocytomas, pointing out the importance of the molecular, protein expressions and mutational analyses of candidates genes, in particular, EGFR and IL-13R 2