Orientadores: Jörg Kobarg, José Andrés Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T04:43:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Righetto_GermannaLima_M.pdf: 4383560 bytes, checksum: b0f7fd3a783153d8832bcf6f44d4b195 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O processo de splicing do RNAm é responsável por orquestrar a junção de exons, criando uma grande diversidade de isoformas gênicas. Alterações nos componentes da maquinaria de splicing e, consequentemente, no processamento do pré-RNAm podem causar ou contribuir para uma infinidade de doenças, dentre elas o câncer. A proteína SF2/ASF foi o primeiro fator de splicing a ser caracterizado como proto-oncogênico, estando superexpresso em diferentes tipos de neoplasias. Sabe-se que a ativação desse fator é, principalmente, mediada por SR quinases conhecidas como splicing quinases e pertencentes à família das SRPKs. A quinase SRPK1, responsável pela fosforilação de SF2/ASF no citoplasma, tem conhecida superexpressão em leucemias. Já a quinase SRPK2, paráloga a SRPK1, possui relação já demonstrada com a proliferação de células leucêmicas e com sua diferenciação. Diante desse quadro, buscamos nesse estudo possíveis correlações entre a maquinaria de splicing e o câncer, dando enfoque à relação entre essa maquinaria e a leucemia. Para tanto, buscamos alterações no cDNA de SRPK2 e quantificamos a expressão das SR quinases SRPK1, SRPK2 e CLK1 em diferentes linhagens de leucemia. Além disso, avaliamos, usando o sistema de Exon Array (Affymetrix), o efeito da superexpressão do fator de splicing SF2/ASF em células de mamífero, buscando alterações globais no splicing dessas células capazes de explicar o caráter oncogênico do fator. Foram encontradas nesse estudo duas novas isoformas de SRPK2, isoladas a partir do cDNA das linhagens de leucemia estudadas. Também foi observada a expressão diferencial das SR quinases SRPK1 e SRPK2 nas linhagens leucêmicas de origem linfóide e mieloide, dando indícios sobre um possível papel divergente dessas quinases nos diferentes tipos de leucemia. Além disso, nas análises preliminares do conjunto de dados obtidos no experimento de Exon Array, foi possível traçar importantes considerações sobre seu caráter oncogênico. Esses dados preliminares do experimento de Exon Array, somados às demais alterações encontradas nas SR quinases, fornecem novas e interessantes pistas sobre a relação entre alterações na maquinaria de splicing e a oncogênese / Abstract: The mRNA splicing is the cellular process responsible for RNA edition, expanding the genome by the combination of gene exons. Mutations in components of this machinery may cause or contribute to a variety of diseases, including cancer. The SF2/ASF protein was the first splicing factor characterized as proto-oncogenic by its overexpression in diverse neoplasias. The cellular activation of this and other splicing factors are mainly dependent on specific kinases, known as splicing kinases and components of a SRPKs family. The SRPK1 kinase, responsible for the cytoplasmic phosphorylation of SF2/ASF, is overexpressed in leukemia. SRPK2, a paralog of SRPK1, is involved in leukemia cell proliferation and differentiation. In this study we searched for splicing machinery and cancer correlations, focusing in the relationship of this machinery and leukemia. In this study we searched for alterations in SRPK2 cDNA and quantified the expression of this kinase and SRPK1 and CLK1 in leukemia immortalized cells. Moreover, we analyzed using Exon Arrays (Affymetrix) the effect of SF2/ASF overexpression in global splicing of non-oncogenic cells, searching for alterations related to its oncogenic character. In this study we discovered two new isoforms of SRPK2 amplified through different leukemia cell lineages. We confirmed the differential expression of SRPK1 and SRPK2 kinases in lymphoid and myeloid leukemia lineages indicating a divergent correlation of these kinases in different leukemia types. In the Exon Array preliminary analysis we also observed important alterations in cellular gene expression. These data and the alterations found in SR kinases provide new and interesting clues about the relationship of splicing machinery alterations and oncogenesis / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, Milena Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T18:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Molck_MiriamCoelho_D.pdf: 5956023 bytes, checksum: 07a0d65667a7a002b0e8ad7a872c0d31 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Síndrome Velocardiofacial (SVCF) tem prevalência de ~1:4.000 nascimentos e apresenta espectro fenotípico variável, incluindo defeitos cardíacos congênitos (DCC). Microdeleções de ~3 Mb em 22q11.2 representam a principal causa, entretanto deleções atípicas nesta região têm sido relatadas, assim como fenótipos similares associados a variações no número de cópias do DNA (Copy number variations, CNVs) em outras regiões cromossômicas. Esta proposta objetiva mapear os pontos de quebra da região 22q11.2 e investigar CNVs em outras regiões do genoma em pacientes com a deleção 22q11.2 confirmada previamente (Grupo I) e investigar CNVs no genoma de pacientes sem a deleção 22q11.2 (Grupo II). Foram investigados 108 pacientes (30 do Grupo I e 78 do Grupo II) com suspeita clínica da SVCF e DCC por Hibridação Genômica em arrays (array Genomic Hybridization- aGH). Para o Grupo I, o tamanho da deleção 22q11.2 proximal variou de 1,8 Mb a 3,3 Mb em 28 casos, sendo que um apresentou a deleção entre as LCRs (Low Copy Repeats) A-B e os demais 27 entre as LCRs A-D (região tipicamente deletada). Dois casos apresentaram deleções atípicas em 22q11.2: 3,6 Mb entre as LCRs B-F, elvolvendo as regiões 22q11.2 proximal e distal; e 1,5 Mb entre as LCRs D-E, envolvendo a região 22q11.2 distal. Além disso, foram observadas dez CNVs ? 300 kb relevantes fora da região 22q11.2, incluindo uma deleção em 11q14.3 e duplicações em 2q24.1-q24.2, 3p22.1, 5p15.2, 5q11.1, 6p21.2, 7p11.2, 15q13.3, 16q23.3 e Xp21.1. Para o Grupo II, foi observado um total de 25 CNVs ? 300 Kb relevantes. Destas, nove CNVs já foram descritas na literatura, incluindo deleções em 4q35.1-q35.2, 5p15.1-p15.33, 8p23.1, 10q22.3-q23.2, 16p11.2, 17q12 e 22q13.33; e duplicações em 3p26.3 e 3q26.2. As variações gênicas dentro dos pontos de quebra da região deletada 22q11.2, bem como as CNVs observadas em outras regiões cromossômicas contribuem para a variabilidade fenotípica observada nesta síndrome e confirmam a sobreposição desta com diferentes condições clínicas / Abstract: The Velocardiofacial Syndrome (VCFS) has a prevalence of ~1:4.000 births and shows variable phenotypic spectrum, including congenital heart defects (CHD). Microdeletions of ~3 Mb in 22q11.2 represent the main cause, however atypical deletions in this region have been reported, as well as similar phenotypes associated with changes in the number of DNA copies (Copy number variations, CNVs) in other chromosomal regions. This work aims to map the breakpoints of the 22q11.2 region and investigate CNVs in other regions of the genome in patients with the 22q11.2 deletion previously confirmed (Group I) and investigate CNVs on the genome of patients without the 22q11.2 deletion (Group II). We investigated 108 patients (30 from Group I and 78 from Group II) with clinical suspicion of VCFS and CHD for array Genomic Hybridization (aGH). For Group I, the size of proximal 22q11.2 deletion ranged from 1.8 Mb to 3.3 Mb in 28 cases, of these, one case had the deletion between LCRs (Low Copy Repeats) A-B and the other 27 between LCRs A-D (typically deleted region). Two cases had atypical deletions at 22q11.2: 3.6 Mb between LCRs B-F, involving proximal and distal 22q11.2 regions; and 1.5 Mb between LCRs D-E, involving distal 22q11.2 region. Additionally, we observed ten relevant CNVs ? 300 kb outside of 22q11.2 region, including a deletion in 11q14.3 and duplications in 2q24.1-q24.2, 3p22.1, 5p15.2, 5q11.1, 6p21.2, 7p11.2, 15q13.3, 16q23.3 and Xp21.1. For Group II, a total of 25 relevant CNVs ? 300 Kb was observed. Of these, nine CNVs have been described in the literature, including deletions in 4q35.1-q35.2, 5p15.1-p15.33, 8p23.1, 10q22.3-q23.2, 16p11.2, 17q12 and 22q13.33; and duplications in 3p26.3 and 3q26.2. Gene variations within the break points of the 22q11.2 deleted region and CNVs observed in other chromosomal regions contribute to phenotypic variability observed in this syndrome and confirm the overlapp with different clinical conditions / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Resumo: Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a -80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Abstract: Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientador: Márcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Maribel Elizabeth Funes Huacca / Mestre

Resumo: Os bovinos são divididos em dois grandes grupos, taurinos e zebuínos, cuja divergência genética é de aproximadamente 250 mil anos. Apesar da proximidade filogenética, os grupos respondem de maneira diferente ao teor de energia da dieta. No presente estudo objetivou-se validar o uso do microarranjo BLO+ para estudos de expressão gênica em zebuínos e comparar a expressão gênica no músculo LD de NEL e ANG alimentados com a dieta AE e BE. Oito ANG e oito NEL foram divididos em duas baias e receberam a dieta BE por 28 dias e na seqüência a dieta AE pelo mesmo período. Após cada período, coletou-se amostras do músculo LD, das quais extraíu-se o RNA para os estudos de expressão gênica usando microarranjos. Foram expressos 9.552 e 8.664 genes em ANG e NEL, sendo que 98% dos genes expressos em NEL também foram expressos em ANG, indicando uma alta similidaridade entre as sondas do microarranjo e os transcritos de NEL. Identificaram-se 546 genes DE para ANG e 440 para NEL. Realizou-se a análise funcional desses conjuntos de genes e observou-se diferenças nas categorias funcionais mais representativas entre as raças entre as dietas. A dieta AE estimula de forma mais acentuada a expressão de genes envolvidos no crescimento e desenvolvimento muscular em ANG, enquanto a dieta BE estimula de forma mais acentuada a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas à captação de nutrientes endógenos em NEL. Os resultados obtidos sugerem que o microarranjo BLO+ pode ser usado em estudos de expressão gênica com zebuínos e indicam que o nível nutricional da dieta afeta diferentemente a expressão gênica no músculo LD de taurinos e zebuínos. / Abstract: Bovines are divided in two large groups, taurine and zebuine, whose genetic divergence is estimated as 250,000 years before present. Despite of phylogenetic proximity, these groups respond differently to diet energy level. The current study aimed to validate the BLO+ microarray use in zebuine gene expression experiments and evaluate gene expression in LD muscle from NEL and ANG fed with AE and BE diets. Eight ANG and NEL animals were separated in two pens and received BE diet during 28-days period; following animals were fed with AE diet for the same period. After each period, samples from LD muscle were collected, of which RNA was extracted to proceed with gene expression experiment using microarrays. Were expressed 9,552 and 8,664 genes in ANG and NEL, where 98% of expressed genes in NEL were also expressed in ANG, indicating a high similarity between microarray probes and NEL transcripts. Statistical analysis identified 546 genes differentially expressed for ANG and 440 for NEL. These gene groups were submitted to functional analysis and differences in overrepresented functional categories were observed between breeds and diets. AE diet stimulates further the expression of genes related to muscle growth and development in ANG, while BE diet stimulates further the expression of genes involved in endogenous nutrients uptake in NEL. The results obtained suggest that BLO+ microarray can be used in zebuine gene expression studies and indicate that nutritional level of diet affects the differential gene expression in LD muscle from taurine and zebuine beef cattle. / Orientador: Luiz Roberto Furlan / Coorientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Leandro Márcio Moreira / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-20Bitstream added on 2014-06-13T19:44:24Z : No. of bitstreams: 1 rocha_lb_dr_jabo_prot.pdf: 6975580 bytes, checksum: 02ebdfaf49b41f3ea78cb0bfdae5765d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os bovinos são divididos em dois grandes grupos, taurinos e zebuínos, cuja divergência genética é de aproximadamente 250 mil anos. Apesar da proximidade filogenética, os grupos respondem de maneira diferente ao teor de energia da dieta. No presente estudo objetivou-se validar o uso do microarranjo BLO+ para estudos de expressão gênica em zebuínos e comparar a expressão gênica no músculo LD de NEL e ANG alimentados com a dieta AE e BE. Oito ANG e oito NEL foram divididos em duas baias e receberam a dieta BE por 28 dias e na seqüência a dieta AE pelo mesmo período. Após cada período, coletou-se amostras do músculo LD, das quais extraíu-se o RNA para os estudos de expressão gênica usando microarranjos. Foram expressos 9.552 e 8.664 genes em ANG e NEL, sendo que 98% dos genes expressos em NEL também foram expressos em ANG, indicando uma alta similidaridade entre as sondas do microarranjo e os transcritos de NEL. Identificaram-se 546 genes DE para ANG e 440 para NEL. Realizou-se a análise funcional desses conjuntos de genes e observou-se diferenças nas categorias funcionais mais representativas entre as raças entre as dietas. A dieta AE estimula de forma mais acentuada a expressão de genes envolvidos no crescimento e desenvolvimento muscular em ANG, enquanto a dieta BE estimula de forma mais acentuada a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas à captação de nutrientes endógenos em NEL. Os resultados obtidos sugerem que o microarranjo BLO+ pode ser usado em estudos de expressão gênica com zebuínos e indicam que o nível nutricional da dieta afeta diferentemente a expressão gênica no músculo LD de taurinos e zebuínos. / Bovines are divided in two large groups, taurine and zebuine, whose genetic divergence is estimated as 250,000 years before present. Despite of phylogenetic proximity, these groups respond differently to diet energy level. The current study aimed to validate the BLO+ microarray use in zebuine gene expression experiments and evaluate gene expression in LD muscle from NEL and ANG fed with AE and BE diets. Eight ANG and NEL animals were separated in two pens and received BE diet during 28-days period; following animals were fed with AE diet for the same period. After each period, samples from LD muscle were collected, of which RNA was extracted to proceed with gene expression experiment using microarrays. Were expressed 9,552 and 8,664 genes in ANG and NEL, where 98% of expressed genes in NEL were also expressed in ANG, indicating a high similarity between microarray probes and NEL transcripts. Statistical analysis identified 546 genes differentially expressed for ANG and 440 for NEL. These gene groups were submitted to functional analysis and differences in overrepresented functional categories were observed between breeds and diets. AE diet stimulates further the expression of genes related to muscle growth and development in ANG, while BE diet stimulates further the expression of genes involved in endogenous nutrients uptake in NEL. The results obtained suggest that BLO+ microarray can be used in zebuine gene expression studies and indicate that nutritional level of diet affects the differential gene expression in LD muscle from taurine and zebuine beef cattle.

Resumo: Foi construído um microarranjo com as 2600 ORFs identificadas no projeto de sequenciamento da bactéria Xylella fastidiosa estirpe 9a5c, e utilizado para analisar diferenças na expressão gênica global da bactéria dentro de uma laranja doce suscetível (Pera) e uma tolerante (cultivar Navelina ISA 315). Foram achados mais genes diferencialmente expressos envolvidos na degradação, reguladores, componentes de membrana, adesinas tipo fímbrias, transportadores, elementos genéticos móveis e genes de patogenicidade na variedade sintomática. Assim, na cultivar Navelina ISA 315, foram diferencialmente expressos mais genes relacionados com a resposta ao estresse, seja detoxificação de espécies reativas do oxigênio ou proteínas chaperonas, assim como uma adesina do tipo hemaglutinina. Isso sugere diferenças na agregação celular e composição do biofilme assim como um maior estresse da bactéria na cultivar tolerante, provocado pelas próprias defesas da planta ou por microrganismos endofíticos que estão competindo com a X. fastidiosa. A técnica de microarranjos foi validada pela RT-qPCR, e apresentou-se como uma ferramenta poderosa na análise das mudanças na expressão gênica da bactéria X. fastidiosa em plantas de laranja doce in vivo, apresentando uma visão mais real da natureza do que os sistemas in vitro, que não a conseguem imitar completamente. Foram levantadas neste trabalho algumas hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade mas no entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para lograr melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade e das interações patógeno-hospedeiro / Abstract: A DNA microarray was constructed containing 2600 ORFs identified by the Genome sequencing project of Xylella fastidiosa 9a5c strain, and used to check global gene expression differences in the bacteria within a susceptible and a tolerant sweet orange plant, the variety Pera and the cultivar Navelina ISA 315, respectively. More genes related to degradation, regulation, membrane components, fimbrial adhesins, transport, genetic mobile elements and patogenicity genes were differentially expressed in Pera variety. On the other hand, in the cultivar Navelina ISA 315, more genes related to stress response, detoxification of oxygen reactive species or other substances, "heat shock" proteins, as well as an adhesin of the hemagglutinin type, suggesting differences in cellular aggregation and biofilm composition, as well as a higher estress of the bacteria in tolerant cultivar, produced either by plant defenses or by endophitic microorganisms which are competing with X. fastidiosa. This "handmade" DNA microchip was validated by RT-qPCR, and has revealed as a powerful technique for the analysis of global changes in gene expression of X. fastidiosa in sweet orange plants in vivo, generating a more real image of what is happening in nature than in vitro systems which would never reproduce nature conditions exactly. Some hypotheses were raised in this study about patogenicity mechanisms, therefore, more research is still necessary to achieve a better understanding of pathogenicity mechanisms and host-pathogen interactions / Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Coorientador: Jackson Antonio Marcondes de Souza / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-21Bitstream added on 2014-06-13T19:39:39Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_to_me_jabo.pdf: 708831 bytes, checksum: d0290b981ff3772231b28fddb042fed0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angus Bela Vista Pecuaria Ltda / Os prejuízos causados à pecuária brasileira pelo carrapato (Rhipicephalus (B.) microplus) são significativos e, uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade dos rebanhos nas regiões tropicais tem sido a utilização de raças mais resistentes a esse ectoparasita. O objetivo desse projeto foi aplicar a tecnologia de microarray de DNA para a prospecção de genes relacionados com os mecanismos de resistência/tolerância ao carrapato, mediante a análise da expressão gênica diferencial em linfonodos de bovinos suscetíveis (Aberdeen Angus) e resistentes (Nelore) infestados artificialmente com este parasita. Os bezerros foram mantidos livres de carrapato desde o nascimento e foram infestados artificialmente com larvas de carrapato aos quatro meses de idade. As biópsias de linfonodo foram realizadas antes e após a infestação e mantidas a –80°C até o seu processamento. Essas amo stras foram submetidas a extração de RNA, síntese de cDNA e marcação . Depois elas foram submetidas a hibridização pela técnica de microarray. Foram identificados 341 genes diferencialmente expressos nos bovinos da Raça Angus e 254 para bovinos da Raça Nelore, os quais foram agrupados em categorias funcionais. Foram identificadas diferenças no padrão de expressão de genes de resposta imune entre as raças, tais como: Moléculas CD, Imunoglobulinas, Fator de Necrose tumoral, Integrinas e Interferon-γ. Para validação dos resultados de expressão diferencial foi empregada a técnica de PCR em tempo real, onde se verificou a expressão dos genes das citocinas IL-5 e IL12p40 nas duas Raças estudadas. / Significant losses are brought by ticks (Rhipicephalus (B.) microplus) to Brazilian beef farming. One of the strategies to increase yield in tropical regions is the use of resistant breeds. This study was undertaken to apply the DNA microarray technology for the prospection of genes related to tick resistance/tolerance mechanisms, through differential gene expression analysis in lymphonodes of susceptible (Aberdeen Angus) and resistant (Nelore) breeds artificially infested with the parasite. Calves were kept tick-free since birth and infested with tick larvae when they reached four months of age. Lymphonode biopsies were performed before and after infestation and kept at -80°C until analyses. Samples were subjected to RNA extraction, cDNA synthesis and labelling. Hybridization was then performed through the microarray technique. In Angus, 341 differentially expressed genes were found against 254 in Nelore, which were grouped in functional categories. Different expression patterns were identified immune response genes between breeds, such as: CD molecules, Immunoglobulines, Tumor Necrosis Factor, Integrins and Interferon-γ. Real-time PCR was used to validate results, which showed the expression of cytokines IL-5 and IL12p40 in both breeds.

Orientador: Juliana Regina Peiró / Coorientador:Sérgio Moraes Aoki / Banca:José Paes de Oliveira Filho / Banca:Flávia de Almeida Lucas / Resumo: Endotoxemia é distúrbio sistêmico que se origina da resposta do hospedeiro a um componente da membrana celular das bactérias Gram- negativas. Esta resposta se dá através da exposição dos receptores celulares TLR-4 e TLR-2 ao LPS. Os objetivos deste estudo foram investigar as alterações na expressão gênica da exposição ao LPS em leucócitos de equinos utilizando a técnica de microarray, avaliar a eficiência do modelo ex vivo para os estudos envolvendo a endotoxemia pela mesma técnica, avaliar a expressão global de genes em vias envolvidas, identificar componentes da cascata metabólica com potenciais para novas terapias, e fornecer subsídio para futuros estudos. Amostras de sangue total (15mL) de cavalos saudáveis (n=6) foram incubadas durante 4 horas a 37°C com 5% de CO2 na presença (1 ou 10 ng/mL) ou ausência de LPS (0 ng/mL). Alíquotas de 500µL de sangue foram coletadas nos momentos 0, 2 e 4 horas após o estímulo do LPS. O RNA, extraído das mostras, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em lâminas 4x44K v2 de humanos contendo sequências homólogas com a espécie equina para os genes de interesse. Após a leitura das lâminas, com filtro para genes 30x mais ou menos expressos, verificou-se um aumento da expressão do TLR-2 na concentração de 10 ng LPS/mL no momento 4 em relação ao momento 2. Este resultado sugere que, embora o receptor TLR-4 seja o principal receptor no reconhecimento do LPS, o receptor TLR-2 também tem um papel no reconhecimento destas moléculas / Abstract: Endotoxemia is systemic disturbance that origins from the host response to a component of the cellular membrane of Gram-negative bacterias. This response occurs through exposure of cellular receptors TLR-4 and TLR-2 to LPS. The objectives of this study were to investigate changes in gene expression of exposure to LPS in horses leukocytes using the microarray technique, to evaluate the efficiency of the ex vivo model for studies of endotoxemia by the same technique, to evaluate the global expression of genes in the metabolic pathways involved, identify components of the metabolic cascade with potential for new therapies, and provide allowance for future studies. Whole blood samples (15mL) of healthy horses (n=6) were incubated for 4 hours at 37°C with 5% of CO2 in the presence (1 or 10 ng/ml) or absence of LPS (0 ng/ml). Aliquots of 500μL of blood were collected at 0,2 and 4 hours after LPS stimulation. The RNAs, extracted from the samples, were used for the transcription of the cDNAs. Hybridization of labeled cDNAs with Cy-3 were performed in 4x44K v2 slides containing human sequences homologous to the equine species for the genes of interest. After the reading of the slides with filter for genes 30x up regulation or down regulation expression, it was observed an increased expression of the TLR-2 concentration of 10 ng LPS/mL at time 4 compared to time 2. This result suggests that, although the TLR-4 receptor is the main LPS recognition receptor, the receptor TLR-2 also plays a role in recognition of these molecules / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-17Bitstream added on 2014-06-13T20:29:53Z : No. of bitstreams: 1 dalmagro_p_me_araca.pdf: 405350 bytes, checksum: 6e68960f50834d47030b502e88fb55c8 (MD5) / Endotoxemia é distúrbio sistêmico que se origina da resposta do hospedeiro a um componente da membrana celular das bactérias Gram- negativas. Esta resposta se dá através da exposição dos receptores celulares TLR-4 e TLR-2 ao LPS. Os objetivos deste estudo foram investigar as alterações na expressão gênica da exposição ao LPS em leucócitos de equinos utilizando a técnica de microarray, avaliar a eficiência do modelo ex vivo para os estudos envolvendo a endotoxemia pela mesma técnica, avaliar a expressão global de genes em vias envolvidas, identificar componentes da cascata metabólica com potenciais para novas terapias, e fornecer subsídio para futuros estudos. Amostras de sangue total (15mL) de cavalos saudáveis (n=6) foram incubadas durante 4 horas a 37°C com 5% de CO2 na presença (1 ou 10 ng/mL) ou ausência de LPS (0 ng/mL). Alíquotas de 500µL de sangue foram coletadas nos momentos 0, 2 e 4 horas após o estímulo do LPS. O RNA, extraído das mostras, foi utilizado para a transcrição do cDNA. A hibridização do cDNA marcado com Cy-3 foi realizada em lâminas 4x44K v2 de humanos contendo sequências homólogas com a espécie equina para os genes de interesse. Após a leitura das lâminas, com filtro para genes 30x mais ou menos expressos, verificou-se um aumento da expressão do TLR-2 na concentração de 10 ng LPS/mL no momento 4 em relação ao momento 2. Este resultado sugere que, embora o receptor TLR-4 seja o principal receptor no reconhecimento do LPS, o receptor TLR-2 também tem um papel no reconhecimento destas moléculas / Endotoxemia is systemic disturbance that origins from the host response to a component of the cellular membrane of Gram-negative bacterias. This response occurs through exposure of cellular receptors TLR-4 and TLR-2 to LPS. The objectives of this study were to investigate changes in gene expression of exposure to LPS in horses leukocytes using the microarray technique, to evaluate the efficiency of the ex vivo model for studies of endotoxemia by the same technique, to evaluate the global expression of genes in the metabolic pathways involved, identify components of the metabolic cascade with potential for new therapies, and provide allowance for future studies. Whole blood samples (15mL) of healthy horses (n=6) were incubated for 4 hours at 37°C with 5% of CO2 in the presence (1 or 10 ng/ml) or absence of LPS (0 ng/ml). Aliquots of 500μL of blood were collected at 0,2 and 4 hours after LPS stimulation. The RNAs, extracted from the samples, were used for the transcription of the cDNAs. Hybridization of labeled cDNAs with Cy-3 were performed in 4x44K v2 slides containing human sequences homologous to the equine species for the genes of interest. After the reading of the slides with filter for genes 30x up regulation or down regulation expression, it was observed an increased expression of the TLR-2 concentration of 10 ng LPS/mL at time 4 compared to time 2. This result suggests that, although the TLR-4 receptor is the main LPS recognition receptor, the receptor TLR-2 also plays a role in recognition of these molecules

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-24Bitstream added on 2014-06-13T20:43:03Z : No. of bitstreams: 1 colombo_j_dr_sjrp.pdf: 949474 bytes, checksum: 856a4b47ea1a9aa6adebae3e2e97b6a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os tumores de cabeça e pescoço ocupam, mundialmente, a quinta posição na lista das neoplasias mais freqüentes. O tipo histológico predominante é o carcinoma de células escamosas, que acomete a cavidade oral, a orofaringe, a hipofaringe e a laringe. O tumor de laringe é um dos tipos mais comuns, correspondendo a 25% dos casos, com alto índice de mortalidade e prognóstico reservado. O principal fator etiológico para o seu desenvolvimento é o consumo combinado de álcool e fumo. O desenvolvimento do câncer de cabeça e pescoço é um processo multipasso acompanhado por mudanças genéticas e epigenéticas. Recentemente, estudos envolvendo a tecnologia microarray têm identificado genes específicos, cuja expressão está alterada em câncer de cabeça e pescoço quando comparado ao tecido normal. No entanto, a maioria dos estudos são realizados usando tumores de diferentes sítios. Neste estudo, foi analisado somente amostras de carcinoma de laringe para minimizar as diferenças genéticas. Dessa forma, os objetivos do presente projeto foram identificar e validar possíveis biomarcadores moleculares envolvidos na carcinogênese de laringe. Para tanto, foi construído um cDNA microarray com 340 genes previamente identificados pelo Head and Neck Annotation Consortium. A expressão desses genes foi analisada em 8 amostras de tecido tumoral e em 4 amostras de tecido histologicamente normal de laringe pela técnica de microarray. Foram identificados 35 genes diferencialmente expressos (SNR ½1.0½, p-value 0.001), os quais estão envolvidos em diversos processos celulares como adesão celular, apoptose, ciclo celular, inibição de proteases, metabolismo, proteólise, reparo de DNA, regulação da transcrição e transdução de sinal. A robustez da assinatura dos 35 genes diferencialmente expressos foi confirmada em um conjunto adicional de 5 amostras tumorais e 6 amostras... / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the fifth most common cancer world-wide. More than 90% of this cancer type has a squamous origin and common sites include oral cavity, oropharynx, hypopharynx and larynx Laryngeal squamous cell carcinoma is very common in head and neck cancer, corresponding to 25% of cases, with high mortality rates and poor prognosis. Tobacco use and/or alcohol consumption are the two principal risk factors involved in development of HNSCC. The development of head and neck cancer is a multistep process accompanied by genetic and epigenetic changes. In recent years, studies involving microarrays have identified specific genes whose expression has changed in head and neck cancer compared with normal tissue. However, most microarray studies are performed using tumors from different sites in head and neck. In our study, we analyzed only larynx carcinoma samples to minimize the genetic differences. Thus, the purpose of this work was to identify and to validater molecular biomarkers involved in larynx carcinogenesis. Therefore, we constructed a cDNA microarray containing 340 genes previously identified by Head and Neck Annotation Consortium. Expression analysis was applied to 8 larynx tumor samples and 4 larynx normal samples. We identified 35 differentially expressed genes between tumor and non-tumor adjacent tissue of larynx (SNR ½1.0½, p-value 0.001). Genes detected were involved in processes as apoptosis, cell adhesion, cell cycle, DNA repair, metabolism, protease inhibition, proteolysis, signal transduction and transcription regulation. The robustness of the 35-gene signature was confirmed using data from an additional set of 5 larynx tumor samples and 6 adjacent non-tumor larynx tissues. For real time RT-PCR validation we selected fourteen genes, of which 10 (ADCY6, AES, AL2SCR3, CRR9, CSTB, DUSP1, MAP3K5, PLAT, UBL1 and ZNF706) were validated... (Complete abstract click electronic access below)