Les traitements actuels anticancéreux ont une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales mais également sur les cellules saines des systèmes immunitaires et hématopoïétiques. De plus, ces traitements ont l’incapacité de stimuler le système immunitaire et de prévenir les récidives. Cependant, certains agents tels que les anthracyclines, la radiothérapie ou encore la thérapie photodynamique ont la capacité d’induire une mort cellulaire dite immunogène. Durant cette modalité, l’exposition à la surface des cellules tumorales mourantes d’une protéine chaperonne du reticulum endoplasmique (RE), la calréticuline (CALR), est une étape essentielle et caractéristique de l’immunogénicité ainsi que la libération d’HMGB1, l’autophagie et la sécrétion d’ATP. Des données issues de la littérature prouvent que les anthracyclines sont également capables d’activer des marqueurs du stress du RE. Notre travail a consisté à étudier les liens moléculaires entre le stress du RE et les marqueurs de la mort cellulaire immunogène. Grâce à un criblage à haut débit, nous avons déterminé que les drogues dites immunogènes activaient la phosphorylation d’eIF2α (eukaryotic initiation factor 2 alpha) et qu’il existait une corrélation forte avec l’exposition de la CALR (R score 0,73 ; p<0,01). De manière surprenante, ces agents échouent à activer la voie de signalisation sous-jacente ainsi que les deux autres voies du stress du RE médiées par ATF6 (activating transcription factor 6) et XBP1s (spliced X-box binding protein 1). Par ailleurs, une anthracycline appelée mitoxantrone inhibe activement les trois voies du stress du RE en co-traitement avec un inducteur du stress du RE et inhibiteur de la N-glycosylation: la tunicamycine. Ces données in vitro ont également été validées dans un modèle in vivo de souris immunodéficientes xénogreffées. De plus, grâce à un algorithme reliant les propriétés physico-chimiques des drogues anti-cancéreuses avec leurs capacités à induire les marqueurs de mort cellulaire immunogène suivants: P-eIF2α, CALR, HMGB1, granules de stress et autophagie, un score prédictif d’immunogénicité a pu être déterminé. Nous devrons déterminer dans le futur comment utiliser ce score comme marqueur prédictif d’une réponse immunogène au cours des traitements cliniques. / Conventional anticancer chemotherapies display a high degree of toxicity with certain specificity for tumor cells. However most of these approaches fail to activate immune system-related bystander effects and thus do often fail to prevent from recurrence. Despite these premises, certain anticancer treatments (including anthracycline-based chemotherapy, radiotherapy and photodynamic therapy) have the ability to induce an immunogenic cell death (ICD) modality. The exposure of calreticulin (CALR) during the course of ICD is quintessential for the transfer of tumor antigen from dying tumors to dendritic cells of the immune system as well as translocation of high mobility group box 1 (HMGB1), autophagy and ATP secretion. Previous studies have shown that certain anticancer agents including anthracylins are able to activate markers of endoplasmic reticulum stress (ER stress). Here we investigated the molecular mechanisms that link ER stress responses with hallmarks of ICD. In a drug screening approach, we showed that ICD-inducing drugs triggered the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 alpha (P-eIF2α) and that this correlated with CALR exposure (R score 0.73, p<0.01). Surprisingly though the agents failed to induce downstream ER stress pathways including the transcriptional activation of activating transcription factor 4 (ATF4), the alternative splicing of X-box binding protein 1 (XBP1s) mRNA and the proteolytic cleavage of activating transcription factor 6 (ATF6). In addition, we found that mitoxantrone actively inhibited all three arms of the unfolded protein response, when co-administered with the inhibitor of N-linked glycosylation tunicamycin, whereas tunicamycin alone triggered all arms of ER-stress. These findings were validated in vivo in immunodeficient animals xenografted with biosensors for ER-stress responses. Moreover, using a machine learning approach that integrates physicochemical properties of oncologic drugs with their ability to elicit immunogenic hallmarks including the phosphorylation of eIF2α, the exposure of CALR, the translocation of HMGB1, the formation of stress granules and the induction of autophagy we established an in silico approach for ICD prediction. For the future, we further aim to investigate the possibility to use these score comprising P-eIF2α and its downstream consequences as biomarker for immunogenic responses during anticancer treatment in patients.

A espécie Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produz o complexo antibiótico retamicina, que apresenta atividade contra leucemia em seres humanos mas possui limitações de uso devido ao seu grande efeito cardiotóxico. Uma linhagem mutante de S. olindensis, So20, obtida por tratamento da linhagem selvagem com MMS (metanossulfonato de metila), apresentou diferença qualitativa quanto à produção deste complexo antibiótico. O extrato metanólico das células desta linhagem mutante sofreu diversos tratamentos com solventes orgânicos e foi submetido a diversas técnicas de separação cromatográfica. Algumas substâncias foram parcialmente isoladas e foram submetidas a análise espectrométrica, que indicaram diferenças nas suas estruturas com relação ao complexo obtido da linhagem selvagem DAUFPE 5622. Algumas destas frações parcialmente purificadas da linhagem mutante foram testadas quanto a sua atividade antimicrobiana, contra Bacillus subtilis 007, e quanto sua capacidade de intercalação em fragmentos de DNA em gel de eletroforese, no ICB-USP, indicando resultados promissores. / Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 species produces the antibiotic complex retamycin, which are active against human leukemia, but is still not used in human treatments due to its cardiotoxic effects. The S. olindensis mutant, So20, obtained by treatment with MMS (methyl methanesulfonate), showed qualitative differences in the antibiotic production. The methanolic extract from these mutant strains cells was purified by means of solvent partition and by chromatographic purification techniques. Some compounds were partially purified and the analysis of their spectrometric data indicated structural differences from that obtained from DAUFPE 5622 strains. Some of these partially purified substances from mutant strains were tested for their antimicrobian activity, against Bacillus Subtilis 007, and for their DNA intercalation ability on eletroforesis gel, in the ICB-USP laboratories, showing promising results.

A espécie Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produz o complexo antibiótico retamicina, que apresenta atividade contra leucemia em seres humanos mas possui limitações de uso devido ao seu grande efeito cardiotóxico. Uma linhagem mutante de S. olindensis, So20, obtida por tratamento da linhagem selvagem com MMS (metanossulfonato de metila), apresentou diferença qualitativa quanto à produção deste complexo antibiótico. O extrato metanólico das células desta linhagem mutante sofreu diversos tratamentos com solventes orgânicos e foi submetido a diversas técnicas de separação cromatográfica. Algumas substâncias foram parcialmente isoladas e foram submetidas a análise espectrométrica, que indicaram diferenças nas suas estruturas com relação ao complexo obtido da linhagem selvagem DAUFPE 5622. Algumas destas frações parcialmente purificadas da linhagem mutante foram testadas quanto a sua atividade antimicrobiana, contra Bacillus subtilis 007, e quanto sua capacidade de intercalação em fragmentos de DNA em gel de eletroforese, no ICB-USP, indicando resultados promissores. / Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 species produces the antibiotic complex retamycin, which are active against human leukemia, but is still not used in human treatments due to its cardiotoxic effects. The S. olindensis mutant, So20, obtained by treatment with MMS (methyl methanesulfonate), showed qualitative differences in the antibiotic production. The methanolic extract from these mutant strains cells was purified by means of solvent partition and by chromatographic purification techniques. Some compounds were partially purified and the analysis of their spectrometric data indicated structural differences from that obtained from DAUFPE 5622 strains. Some of these partially purified substances from mutant strains were tested for their antimicrobian activity, against Bacillus Subtilis 007, and for their DNA intercalation ability on eletroforesis gel, in the ICB-USP laboratories, showing promising results.

Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne del’inefficacité de ses défenses immunitaires naturelles à entraver la progression tumorale. Larestauration ou l’induction de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces sont des enjeuxmajeurs des stratégies thérapeutiques actuelles. En plus des immunothérapies classiques,visant à activer le système immunitaire des patients contre leurs tumeurs, les thérapiesconventionnelles, telles que les chimiothérapies et la radiothérapie, peuvent avoir des effetsimmunostimulants, en parallèle de leur effet directement cytotoxique sur les cellulestumorales. Parmi celles-ci, les anthracyclines, l’oxaliplatine et la radiothérapie sontnotamment capables d’induire une mort cellulaire immunogène. L’efficacité thérapeutique deces traitements dépend de l’activation de lymphocytes T (LT) CD8 anti-tumoraux,producteurs d’interféron-gamma (IFN-γ). En utilisant des modèles murins de tumeurstransplantées, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par des droguesimmunogènes induit la libération d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extracellulaire.Ce signal de danger endogène se lie à son récepteur P2RX7 sur les cellulesdendritiques et permet la formation de l’inflammasome NLRP3/ASC/pro-caspase 1,conduisant à l’activation protéolytique de la caspase 1, qui active la pro-interleukine-1β (pro-IL-1β) en interleukine-1β (IL-1β). L’IL-1β peut directement agir sur les LT CD8 pourfaciliter leur polarisation vers un phénotype de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1).De plus, le traitement de tumeurs établies par des drogues immunogènes induit uneproduction d’IL-17A (IL-17) dans le lit tumoral, au cours de la première semaine suivant letraitement. Les LT gamma delta (LTγδ) sont les principaux producteurs de cette cytokinedans nos modèles. Ces cellules s’accumulent transitoirement dans la tumeur dès le troisièmejour suivant le traitement et leur taux est parfaitement corrélé à celui des LT CD8 producteursd’IFN-γ tumoraux. Comme l’IFN-γ, l’IL-17 et les LTγδ sont nécessaires à l’efficacitéthérapeutique des drogues immunogènes. L’IL-1β produite par les cellules dendritiquesexposées à des corps apoptotiques immunogènes stimule directement la production d’IL-17par les LTγδ. Ces travaux ont contribué à identifier l’ATP extra-cellulaire comme undéterminant moléculaire de l’immunogénicité des cellules tumorales exposées à certainesthérapies anti-cancéreuses conventionnelles. De plus, nous montrons que les traitementscytotoxiques classiques peuvent moduler l’environnement immunitaire dans le lit tumoral, etcontribuer à remplacer une inflammation chronique et immunosuppressive en uneinflammation aigüe et immunogène. L’étude des interactions entre le système immunitaire etles thérapies anti-cancéreuses conventionnelles est nécessaire pour utiliser ces traitements demanière plus rationnelle, en les combinant par exemple à des immunothérapies plusclassiques. / In most cases, cancer occurs in immunocompetent individuals, revealing the potential failure of the immune system to impair tumor development. Trying to restore or to induce an efficient anti-tumoral immune response is part of the main challenges of cancer treatment. In addition to the classical immunotherapeutic compounds, conventionnal cytotoxic treatments can also have some immunostimulatory effects. Among these treatments, the chemotherapeutic agents oxaliplatin and anthracyclins, as well as irradiation, can induce an immunogenic cell death, contributing to the activation of IFNγ-producing CD8 T cells. We show that upon treatment with immunogenic drugs, tumor cells are able to release ATP in the extracellular medium. This ATP can act on dendritic cells through its receptor P2RX7, which is able to activate the inflammasome NLRP3 and the subsequent production of IL-1β. Using models of transplantable tumors in mice we could show that the production of IL-1β induced by immunogenic treatments was mandatory for their efficacy. In addition to being directly involved in Tc1 cells polarization, IL-1β could promote the production of IL-17A by gamma delta T cells which were accumulating in the tumor bed following chemotherapy. We could show that these IL-17 producing gamma delta T cells were involved in treatment efficacy. This work has revealed that extracellular ATP was a crucial endogenous danger signal involved in anti-cancer chemotherapy efficacy. Furthermore, we have shown that conventionnal cytotoxic compounds could transform the smoldering pro-tumoral inflammation into an acute and immunogenic anti-tumoral one. This work may have some clinical implications, especially in the setting of therapeutic protocols involving the combination of conventionnal cytotoxic therapies with selected immunoadjuvants for the treatment of cancer.

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La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est le cancer le plus fréquent chez les enfants. Malgré le fait que plus de 80% des enfants atteints de LLA sont aujourd'hui guéris de leur maladie, ce succès a toutefois un prix élevé, car l’exposition aux médicaments cytotoxique et/ou à l’irradiation pendant une période vulnérable du développement de l’enfant peut entraîner des conséquences à long terme. En effet, environ 60% des enfants ayant survécu à une LLA devront vivre avec des problèmes de santé liés au traitement, également appelés effets indésirables tardifs (late-adverse effects, LAEs). Parmi ces derniers, on notera des problèmes métaboliques, l’ostéoporose, une altération des fonctions cognitives ou cardiaques, ainsi que la dépression et l’anxiété. Si certains survivants ne présentent aucune de ces complications, d'autres peuvent en avoir plusieurs. Différents facteurs peuvent contribuer à cette variabilité, notamment le traitement reçu, les caractéristiques de la maladie, les habitudes de vie et, surtout, la constitution génétique du patient. Ce projet s'est concentré sur les biomarqueurs génétiques permettant d'identifier les individus les plus susceptibles de souffrir de LAEs. Récemment, une étude exhaustive (évaluations cliniques, psychosociales et biochimiques) s’est déroulée au CHU Sainte-Justine pour caractériser chacune de ces morbidités chez 250 survivants de la LLA de l'enfant (cohorte PETALE). De plus, on a obtenu le profil génétique de chaque participant. Nous avons utilisé cet ensemble de données et des outils statistiques et bio-informatiques pour réaliser des études d'association comparant la fréquence des variants génétiques chez les survivants ayant développé ou non des LAEs; en particulier, les complications cardiovasculaires et neurocognitives, ainsi que les troubles de l'humeur tels que l'anxiété et la dépression. D'autres facteurs de risque tels que les caractéristiques de traitement et/ou de la leucémie ont été pris en compte lors de l'analyse pour dériver les meilleurs prédicteurs génétiques. Ainsi, en utilisant l'approche des gènes candidats, nous avons identifié les variants communs des gènes MTR, PPARA, ABCC3, CALML5, CACNB2 et PCDHB10 qui étaient associés à des déficits de performance des tests neurocognitifs, tandis que les variants des gènes SLCO1B1 et EPHA5 étaient associés à l'anxiété et à la dépression. Deux variants, rs1805087 dans le gène MTR et rs58225473 dans le gène CACNB2 sont particulièrement intéressants, car ces associations ont été validées dans la cohorte de réplication SJLIFE (St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA). Les analyses d'association ont été complémentées par une étude d'association à l'échelle de l'exome, qui a identifié plusieurs gènes supplémentaires comme des modulateurs potentiels du risque de développer des complications neurocognitives liées au traitement (gènes AK8 et ZNF382), ainsi que l'anxiété et la dépression (gènes PTPRZ1, MUC16, TNRC6C-AS1, APOL2, C6orf165, EXO5, CYP2W1 et PCMTD1). Le variant rs61732180 du gène ZNF382 a ensuite été validé dans la cohorte de réplication SJLIFE. Également, nous avons effectué des analyses d’association concernant les complications cardiaques liées au traitement qui ont identifié plusieurs nouveaux marqueurs associés à ces complications dans les gènes TTN, NOS1, ABCG2, CBR1, ABCC5, AKR1C3, NOD2 et ZNF267. De plus, nous avons résumé les connaissances actuelles sur les marqueurs pharmacogénomiques qui ont été associés aux effets de cardiotoxicités, induites par les anthracyclines, qui affectent les patients atteints de cancer pédiatrique. Nous avons également inclus un aperçu de l'applicabilité des résultats rapportés, notamment ceux qui ont été validés dans la cohorte PETALE. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux complications qui surviennent après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Nous avons appliqué des approches bio-informatiques et statistiques similaires pour obtenir un profil plus complet de la composante génétique derrière ces complications potentiellement mortelles. Ainsi, une étude d'association à l'échelle de l'exome a été réalisée dans une cohorte de patients pédiatriques subissant une greffe de cellules souches hématopoïétiques après un régime de conditionnement contenant du busulfan. Nous avons identifié de nouvelles variations génétiques conférant un risque plus élevé de syndrome d'obstruction sinusoïdale (notamment dans les gènes UGT2B10, BHLHE22, et KIAA1715) et de maladie aiguë du greffon contre l'hôte (dans les gènes ERC1, PLEK, NOP9 et SPRED1), qui pourraient être utiles pour des stratégies personnalisées de prévention et de traitement. Ces travaux contribuent à la compréhension de l'influence des facteurs génétiques sur le risque de développer des complications liées au traitement, tant au cours du traitement qu'à long terme. De plus, les marqueurs génétiques signalés ainsi que d'autres facteurs de risque connus peuvent conduire à des modèles de prédiction identifiant les patients à risque accru de ces complications. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer in children. Even though more than 80% of children with ALL are now cured of their disease, this success comes at a high price as exposure to cytotoxic drugs and/or radiation during a vulnerable period of child development may have long-term consequences. In fact, approximately 60% of children who survive ALL will have to live with treatment-related health problems, also called late-adverse effects (LAEs). These include metabolic problems, osteoporosis, impaired cardiac or cognitive functions, as well as depression and anxiety. While some survivors do not have any of these complications, others may have more than one. Different factors can contribute to this variability, in particular, the treatment received, the characteristics of the disease, the lifestyle, and, above all, the genetic makeup of the patient. This project focused on genetic biomarkers capable of identifying the individuals most likely to suffer from LAEs. Recently, an exhaustive study (clinical, psychosocial, and biochemical evaluations) took place at Sainte-Justine University Health Center (Montreal, Canada), with the goal to characterize each of these morbidities in 250 survivors of childhood ALL (PETALE cohort). In addition, the genetic profile of each participant was obtained, and we used statistical and bioinformatics tools to perform association studies on this dataset in order to compare the frequency of genetic variants in survivors with or without LAEs. We evaluated cardiovascular and neurocognitive complications, as well as mood disorders such as anxiety and depression. Other risk factors, such as treatment and/or leukemia characteristics were also considered during the analysis to derive the best genetic predictors. Thus, using the candidate gene approach, we identified common variants in the MTR, PPARA, ABCC3, CALML5, CACNB2, and PCDHB10 genes that were associated with deficits in neurocognitive tests performance, whereas variants in the SLCO1B1 and EPHA5 genes were associated with anxiety and depression. Two variants, rs1805087 in the MTR gene and rs58225473 in the CACNB2 gene, are of particular interest since these associations were validated in an independent SJLIFE replication cohort (St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA). The association analyses were complemented by an exome-wide association study, which identified several additional genes as potential modulators of the risk of developing treatment-related neurocognitive complications (genes AK8 and ZNF382), as well as anxiety and depression (genes PTPRZ1, MUC16, TNRC6C-AS1, APOL2, C6orf165, EXO5, CYP2W1, and PCMTD1). Variant rs61732180 in the ZNF382 gene was further validated in the replication SJLIFE cohort. To a great extent, we performed association analyses regarding treatment-related cardiac complications which identified several novel markers associated with these toxicities in the TTN, NOS1, ABCG2, CBR1, ABCC5, AKR1C3, NOD2, and ZNF267 genes in survivors of childhood ALL. In addition, we summarized the current knowledge on pharmacogenomic markers related to anthracycline-induced cardiotoxicity affecting pediatric cancer patients. We also included a brief overview of the applicability of reported findings to the PETALE cohort, validating several of them. Besides, we were interested in the complications that arise after a hematopoietic stem cell transplantation. We applied similar bioinformatics and statistical approaches to gain a more complete insight into the genetic component behind these life-threatening complications. Thus, an exome-wide association study was performed in a cohort of pediatric patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation following a conditioning regimen containing busulfan. Our results identified new genetic variations conferring a higher risk of sinusoidal obstruction syndrome (notably in the UGT2B10, BHLHE22, and KIAA1715 genes) and acute graft-versus-host disease (ERC1, PLEK, NOP9, and SPRED1 genes), which could be useful for personalized prevention and treatment strategies. This work contributes to the understanding of the influence of genetic factors on the risk of developing treatment-related complications, both during treatment and in the long term. Furthermore, the reported genetic markers along with other known risk factors can lead to prediction models identifying patients at increased risk for these complications.