As enterobactérias são importantes pátogenos comunitários e hospitalares e o aparecimento cada vez mais frequente de cepas multirresistentes tem sido motivo de preocupação em hospitais e instituições de saúde por todo o mundo, devido às opções terapêuticas restritas. Nas últimas décadas, o aumento global de cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais induzíveis e β-lactamases de espectro estendido (ESBL), fizeram com que os carbapenêmicos fossem considerados a primeira opção para o tratamento de infecções graves. No entanto, a resistência aos carbapenêmicos já é considerada um problema de saúde pública em diversos países e a produção da enzima Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) tem sido descrita como o principal mecanismo de resistência a esta classe de antibióticos na família Enterobacteriaceae. Considerando que apenas relatos esporádicos de cepas produtoras de KPC têm sido reportados no Rio Grande do Sul (RS), em contraste à situação de muitos estados brasileiros, este estudo teve por objetivo estabelecer a prevalência de KPC entre isolados com reduzida sensibilidade aos carbapenêmicos provenientes de 11 hospitais do RS, promover a caracterização molecular destes isolados, bem como avaliar as principais metodologias fenotípicas utilizadas na sua detecção. Diferenças significativas foram observadas entre os perfis de sensibilidade a imipenem (IPM) e meropenem (MEM), quando comparados ao de ertapenem (ERT), sendo que para este último menos de 10% dos isolados foram considerados sensíveis em comparação a mais de 73% para os dois primeiros. Nossos resultados também demonstraram que a redução de sensibilidade aos carbapenêmicos esteve associada à produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL, em detrimento de carbapenemases. Dentre as principais carbapenemases encontradas em enterobactérias, apenas cepas produtoras de KPC foram detectadas entre os isolados estudados, cuja prevalência foi de 4%. Entre os produtores de KPC, foram identificadas espécies de E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens e K. georgiana, provenientes de quatro hospitais distintos. A análise por sequenciamento revelou que todos foram produtores da enzima KPC-2. Quanto ao perfil de sensibilidade, a maioria foi altamente resistente aos β-lactâmicos e às quinolonas, enquanto que, amicacina e polimixima foram os antibióticos mais efetivos contra os isolados in vitro. Dois grupos clonais foram evidenciados entre os isolados de E. cloacae e S. marcescens e quatro entre os isolados de K. pneumoniae, na análise por PFGE. Com relação ao contexto genético que envolve o blaKPC-2, apenas uma caracterização parcial foi possível, evidenciando uma plataforma alterada em relação ao ambiente genético clássico (Tn4401). A análise plasmidial dos produtores de KPC resultou em plasmídeos de tamanhos variáveis, evidenciando a maior prevalência de plasmídeos de ~20Kb no carreamento do gene. A análise também revelou que todos foram não- tipáveis pela técnica de PBRT. Com relação às metodologias fenotípicas utilizadas na detecção de KPC, o IPM apresentou melhor desempenho que o MEM na realização do teste de discos combinados com ácido borônico (AB), resultando em 100% de sensibilidade (SN) e 96.1% de especificidade (SP). A quantificação do Teste Modificado de Hodge (MHT), proposta neste trabalho, eliminou a subjetividade na sua interpretação e evidenciou um aumento considerável na SP do teste em relação à metodologia convencional. Em conclusão, nossos resultados confirmaramm a elevada plasticidade genética e os diversos fenótipos observados na família Enterobacteriaceae; contribuíram para o conhecimento da epidemiologia local de resistência aos carbapenêmicos e dos isolados produtores de KPC; bem como reforçaram o valor das metodologias fenotípicas como ferramenta capaz de discriminar os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos. / The Enterobacteriaceae family includes important community and nosocomial pathogens frequently associated to multirresistance. Multidrug-resistant strains represent an important concern among hospitals and healthcare institutions around the world, due to the limited therapeutic options. In recent decades, the overall increase of strains producing inducible β-lactamases and extended spectrum β-lactamases (ESBL) has lead to the use of carbapenems as the first option for the treatment of serious infections. However, the carbapenem resistance has been considered a public health problem in many countries and the production of the enzyme Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) has been described as the major resistance mechanism to carbapenems in this family. Whereas only sporadic reports of KPC-producing strains have been reported in Rio Grande do Sul (RS), in contrast to the situation in many Brazilian states, this study aimed to establish the prevalence of KPC among isolates with reduced susceptibility to carbapenems from 11 disctinct hospitals of RS, promote the molecular characterization of these isolates, as well as evaluate the main phenotypic methods used for KPC detection. Significant differences were observed among the susceptibility profiles of imipenem (IPM) and meropenem (MEM), when compared to ertapenem (ERT): less than 10% of the isolates were classified as susceptible to ERT compared to over 73% to IPM and MEM. Our results demonstrated that the reduced susceptibility to carbapenems, was mainly due to the production of AmpC β-lactamases and ESBL, instead of true carbapenemases. Regarding the major carbapenemases found in Enterobacteriaceae, only KPC was detected among the isolates studied, at a prevalence of 4%. KPC producers included the species E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens and K. georgiana, from four different hospitals. The sequencing analysis demonstrated that all of them were KPC-2 producers. According to the susceptibility profile, most were highly resistant to β-lactams and quinolones, whereas polymyxin and amikacin were the most effective drugs in vitro. Two clonal groups were detected among isolates of E. cloacae and S. marcescens and four among isolates of K. pneumoniae, by PFGE analysis. Only a partial characterization of the genetic context that involves the blaKPC-2 gene was possible for these isolates, indicating an altered platform compared to the classic genetic environment (Tn4401). The plasmid analysis indicated plasmids of variable sizes, with a higher prevalence of those of ~ 20Kb involved with the blaKPC-2 gene. The analysis also showed that all of them were non-typable by PBRT technique. With respect to the phenotypic methods used for KPC detection, IPM proved to present a better performance than MEM in the combined-disc test with boronic acid (AB), resulting in 100% of sensitivity (SN) and 96.1% of specificity (SP). The quantification of Modified Hodge Test (MHT), proposed in this study, eliminated the subjectivity of this test leading to a considerable increase in the SP of the test compared to the conventional methodology. In conclusion, our results confirmed the high genetic plasticity and the distinct phenotypes observed in the Enterobacteriaceae family; contributed to the knowledge of the local epidemiology of carbapenem resistance and for KPC-producing isolates; as well as reinforced the use of phenotypic methods as an useful tool able to discriminate the mechanisms involved in carbapenem resistance.

Orientador: Helena Teixeira Godoy / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-13T20:44:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_MariemRodriguesRibeiroda_D.pdf: 2999287 bytes, checksum: e5698d30a669305197d9916533cf295f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A presença de resíduos de antibióticos no leite resulta da aplicação de diferentes substâncias antimicrobianas no gado leiteiro para o tratamento de infecções e uso profilático na prevenção de doenças e como aditivos adicionados à ração para promover o crescimento do animal. A utilização indiscriminada dos antibióticos pode estar associada à presença de resíduos no leite e em seus derivados acima dos Limites Máximos de Resíduos (LMR) permitidos. A demanda por um controle da qualidade deste produto levou a necessidade de métodos analíticos confiáveis que permitam avaliar o teor desses resíduos, visando garantir a qualidade dos alimentos, a segurança do consumidor e o reconhecimento mútuo a nível internacional. Esta pesquisa descreve o procedimento de validação intralaboratorial de um método para identificar e quantificar resíduos de anfenicóis e de treze antibióticos da classe dos B-lactâmicos em leite UHT e em pó integrais por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas (CLAE/EM), de acordo com os critérios de validação preconizados pela Diretiva 2002/657/EC. Foram analisadas 475 amostras de leites integrais UHT e 140 em pó, perfazendo um total de 615 amostras. A coleta foi realizada pela Vigilância Sanitária dos estados de MG, RJ, SP, PR, RS, SC, ES, GO, MS, BA, PA e RO no período de julho/2006 a junho/2007. As amostras foram previamente submetidas ao ensaio de Kit SNAP e Kit ELIZA para cloranfenicol e B-Lactâmicos, respectivamente. O método por CLAE/EM foi utilizado para confirmar quantitativamente os antibióticos cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol, e qualitativamente os B-lactâmicos (ampiclina, amoxicilina, cloxacilina, dicloxacilina, oxacilina, penicilinas G e V, cefapirina, cefalotin, cefazolin, cefoperazone e ceftiofur). Observou-se que 0,65% do total de amostras de leite UHT foram confirmadas, enquanto na triagem 4,11% foram reagentes. Para o leite em pó somente 1,44% do total de amostras foram confirmadas para florfenicol, enquanto na triagem 30,9% das amostras foram reagentes. Na triagem foi detectada a presença de resíduos de ß-lactâmicos em 3 amostras de leite UHT e 3 amostras de leite em pó. Em todas foi confirmada a presença do resíduo de cefapirina, representando, respectivamente, 0,65% e 2,14% do total das amostras. Os resultados mostraram que o método desenvolvido apresentou eficiência satisfatória ao uso pretendido / Abstract: The presence of antibiotic residues in milk resulting from the application of various antimicrobial substances in dairy cattle for the treatment of infections and prophylactic use in prevention of disease, before or after exposure, and added to feed additives to promote growth of the animal. Their indiscriminate use can be associated to the presence of residues in the milk and milk derivatives above the Maximum Limits of Residues (LMR) allowed. The demand for a control of the quality of this product, took to the development of reliable analytic methods that allow to evaluate the residue of antibiotics seeking to guarantee the quality of the victuals, the consumer's safety and the mutual recognition at international level. This study describes the procedure for intralaboratory validation of the method to identify and quantify residues amphenicols and thirteen antibiotics of the class of B¿lactams in UHT and powder milk by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometer. They were analyzed 475 UHT milk samples and 140 powder milk samples, covering a total of 615. The collection was carried by the Sanitary Surveillances of States of MG, RJ, SP, Pr, RS, SC, ES, GO, MS, BA and PA in the period from july 2006 to june 2007. The samples were previously submitted to Kit SNAP rehearsal and of Kit ELISA for chloranphenicol and B-lactamics respectively.The method of high performance liquid chromatography coupled with simple quadrupole mass detection (HPLC/MS) it was used to confirm quantitatively the chloranphenicol, thiamphenicol and florphenicol antibiotics and qualitatively the B-lactamics ampicillins, amoxicillin, cloxacillin, oxacillin, penicillins G and V, cephapirin, cephalothin, cefoperazone and ceftiofur antibiotics. It was found that 0.65% of total samples of milk were confirmed, while 4.11% were in the screening reagents. For milk powder only 1.44% of total samples were confirmed to florphenicol, while 30.9% in the screening of samples were reactive. Sorting to detected in the presence for residues of B-lactamics in three samples of milk an three samples of milk powder. In all samples the cephapirin, a B-lactamics class of cephalosporins, was aconfirmed, representin respectively 065% and 2.14 of total samples. The results showed that the method developed showed satisfactory performance to intended use / Doutorado / Mestre em Ciência de Alimentos

As tetraciclinas são compostos antibacterianos utilizados no gado leiteiro para tratamento de doenças infecciosas, como a mastite e também como aditivos em ração animal para melhorar a conversão alimentar. O uso das tetraciclinas pode resultar na presença de resíduos destes fármacos no leite, principalmente se não forem utilizados de acordo com as indicações e se não for respeitado o período mínimo de eliminação dos antibióticos pelo leite. A presença de resíduos de antibióticos no leite interfere no processo industrial de derivados, inibindo fermentos láticos usados na produção de iogurtes e queijos, o que, consequentemente, causa sérios prejuízos econômicos. Resíduos de antibióticos no leite de consumo podem representar riscos à saúde humana, podendo causar reações alérgicas em indivíduos sensíveis, efeitos adversos à flora intestinal humana prejudicando sua ação protetora local, além de propiciar a seleção de populações de bactérias resistentes. O Food and Drug Administration (FDA) estabelece limite máximo de resíduo (LMR) para as tetraciclinas em leite de 300ppb, enquanto a Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) e o Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal do Ministério da Agricultura brasileiro estabelecem LMR de 100 ppb·. O objetivo deste estudo foi validar um método multirresíduo para determinação de oxitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina e doxiciclina em leite por extração com desproteinização acídica e identificação e quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos. O método apresentou limite de detecção e quantificação, respectivamente de 37,5 e 50ng/ml, lineridade de 50-1600ng/ml e coeficientes de determinação de 0,9996; 0,9994; 0,9996 e 0,9996 para oxitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina e doxiciclina, respectivamente, recuperação entre 66,6 e 89,6%, com precisão e exatidão adequadas. Para avaliar a aplicabilidade do método foram analisadas 231 amostras de leite in natura, obtidas em um laticínio, em três coletas consecutivas e mensais. O índice de amostras positivas para oxitetraciclina manteve-se superior a 11%. Na primeira coleta 19% das amostras foram positivas para oxitetraciclina, na segunda coleta 11,5% e na terceira coleta 12,2%. Os resultados indicam que o método validado mostrou-se apropriado para monitorização da qualidade do leite. / The tetracyclines are antimicrobial agent used in dairy cattle to treat infection diseases, as mastitis and also as additives in animal food to produce improvements in feed efficiency and growth. The use of tetracyclines can result in presence of residue of these antimicrobials in the milk, especially if they are not used according to the label directions and if the minimum period of their elimination is not respected. The presence of antibiotic residues in the milk interferes in the dairy industrial process diminishing starter culture growth used in the yogurt and cheese production, what causes strong economic loss. Antibiotic residue in the consumer milk can represent risk to the human health, being possible to cause allergic reactions in sensitives human beans, disorders of the intestinal flora damaging its local protection action besides to provide antibiotic resistance development. The Food and Drug Administration (FDA) establishes maximum residue limit (MRL) of 300ppb for tetracycline in milk while the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) and the National Plan of Biological Residue Control in animal products of Brazilian Agricultural Bureau establishe MRL of 100ppb. The objective of this study was to validate the multiresidue method to determine the oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in milk by acidic desproteinization extraction and to identify and quantify by high performance liquid chromatography with photo-diode array detector. The method presented detection limit and quantification limit respectively of 37,5 and 50 ng/ml, linearity from 50 to 1600ng/ml and correlation coefficient of 0,9996, 0,9994, 0,9996 and 0,9996 to the oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline respectively; recovery between 66,6 and 89,2%, with good precisions and accurancy. There were analyzed 231 samples of milk in nature obtained in a dairy industrie, in three stages consecutive and monthly. The indices of positive samples for oxytetacycline remained superior to 11%. In the first stage 19% of the samples were positive for oxytetracycline, in the second stage 11,5% and in the third stage 12,2%. The results show that the validated method is appropriated for the monitoring the quality of the milk.

As tecnologias utilizadas em estações de tratamento de água e efluentes não são eficientes para a remoção total de resíduos farmacêuticos e os efeitos dessas substâncias sobre o meio ambiente e a saúde humana ainda não são bem conhecidos. No presente trabalho, estudou-se a degradação do antibiótico enrofloxacina (ENRO) por fotólise e pelo processo H2O2/UV na presença de compostos bio-orgânicos (BOS), que têm se apresentado como interessantes promotores da oxidação de poluentes. Os experimentos foram realizados em um reator fotoquímico tubular de imersão com fonte radiante (lâmpada de xenônio) concêntrica, operado em batelada com recirculação. Utilizaram-se concentrações iniciais de ENRO e de BOS iguais a 50 mg L-1 e 20 mg L-1, respectivamente. Para todos os pH mantidos constantes (3, 5, 7 ou 9), a solução foi irradiada por 240 minutos. Os resultados indicam que o antibiótico não sofreu hidrólise em qualquer dos pH estudados em um período de 24 horas. Por sua vez, a fotólise da enrofloxacina mostrou-se eficiente somente na presença do composto bioorgânico CVT 230 (BOS C), com remoção de ENRO de quase 90% em meio neutro (pH 7). Resultados da literatura, associados a experimento realizado em meio anóxico, sugerem a participação de oxigênio singlete como principal espécie oxidante da enrofloxacina. Por outro lado, a degradação da ENRO pelo processo H2O2/UV apresentou remoção máxima do fármaco de 48% em pH 7, o que sugere que a ação de oxigênio singlete e/ou radicais hidroxila não foi eficaz na presença de peróxido de hidrogênio. Portanto, o BOS C pode ser empregado como promotor no tratamento de águas e efluentes aquosos contaminados com enrofloxacina sob baixas potências radiantes ou em sistemas irradiados por luz solar. / The technologies used in water and wastewater treatment plants are not efficient for the total removal of pharmaceutical compounds whose effect to the environment and to human health are still not well known. In this work, the degradation of the antibiotic enrofloxacin (ENRO) was studied by photolysis and by the H2O2/UV process in the presence of bio-organic substances (BOS), which have been identified as interesting promoters of pollutant oxidation. The experiments were carried out in a tubular immersion photochemical reactor equipped with a concentric radiant source (xenon lamp), and operated in batch mode with recirculation. Initial ENRO and BOS concentrations of 50 mg L-1 and 20 mg L-1 were used, respectively. The solution was irradiated for 240 minutes for all pH studied at constant values (3, 5, 7, and 9). The results show that the antibiotic did not undergo hydrolysis at any pH after 24 hours. The photolysis of enrofloxacin showed to be efficient only in the presence of the bio-organic substance CVT 230 (BOS C), with almost 90% ENRO removal in neutral solution (pH 7). Results from the literature, associated with an experiment carried out in anoxic conditions, suggest singlet oxygen as the main species responsible for enrofloxacin oxidation. On the other hand, ENRO degradation by the H2O2/UV process showed a maximum removal of 48% at pH 7, suggesting that the action of singlet oxygen and/or hydroxyl radicals was not effective in the presence of hydrogen peroxide. BOS C can therefore be used as an efficient promoter for the treatment of enrofloxacin-containing water and wastewater under low irradiant power or in solar-irradiated systems.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-03-09T19:11:49Z No. of bitstreams: 2 Érica_Taguti2014.pdf: 1522601 bytes, checksum: 0c0c5940962174392fdd910bcc90e985 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-09T19:11:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Érica_Taguti2014.pdf: 1522601 bytes, checksum: 0c0c5940962174392fdd910bcc90e985 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The aims of this research were update systematic reviews available about partial and complete economic studies of linezolid and estimate differential cost between intravenous and oral administration with hypothetical linezolid switch therapy (intravenous to oral or nasogastric tube). A systematic review was conducted using the terms "clinical outcomes", "analysis cost", "economic outcomes" and "pharmacoeconomic studies" and "linezolid" in the databases Cochrane, IPA, Medline and Scopus, associated with manual search. It was also conducted a cost-minimization analysis among hospitalized patients who used oral and/or intravenous linezolid forms between August, 2009 and August, 2013 in a public hospital in southern Brazil. The research was presented in three different papers. For systematic review were found 1352 articles, of which 24 fulfilled inclusion criteria for the systematic review of partial economic studies and 43 for systematic review of complete economic evaluations. In general, linezolid showed better clinical and economic outcomes compared to antimicrobials such as vancomycin, daptomycin, teicoplanin, particularly in cases of pneumonia patients, infections of skin and soft tissues, infections of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, for systematic review of partil and complete economic evaluations, due to the possibility switch therapy. In study of cost-minimization were evaluated records of 152 patients, 103 (67.8%) were treated with linezolid exclusively intravenous route and in 33 (31.7%) opportunities could have been the exchange to oral form administration of antimicrobial. The total cost per patient (mean) after changing from intravenous to oral administration was significantly lower than the real cost paid per patient (mean) (p<0.001). The cost savings associated with switching to oral linezolid administration would be US$14,328.32 over four years. / Os objetivos dessa pesquisa foram atualizar as revisões sistemáticas existentes de estudos econômicos parciais e completos da linezolida e descrever a economia de recursos com a hipotética troca da via de administração do medicamento (endovenosa para oral ou sonda nasoenteral) entre pacientes tratados em um hospital público. Foi conduzida uma revisão sistemática de estudos com os termos “clinical outcomes”, “cost analysis”, “economic outcomes” e “pharmacoeconomic studies” e “linezolid”, nas bases de dados Cochrane, IPA, Medline e Scopus, associado a busca manual. Também foi conduzida uma análise de custo-minimização entre pacientes hospitalizados que utilizaram as formas oral e/ou endovenosa de linezolida entre agosto de 2009 e agosto de 2013 em um hospital público paranaense. As pesquisa foram apresentadas em três diferentes artigos. Para a revisão sistemática foram encontrados 1352 artigos, sendo que 24 preencheram os critérios de inclusão para a revisão sistemática de estudos econômicos parciais e 43 para a revisão sistemática de avaliações econômicas completas. No geral, a linezolida mostrou melhores resultados clínicos e econômicos frente a antimicrobianos como vancomicina, daptomicina, teicoplanina, especialmente nos casos de pacientes com pneumonia, infeções de pele e tecidos moles e infeções por Staphylococcus aureus resistente a meticilina, para estudos econômicos parciais e completos, sendo um dos motivos relacionados à troca da via de administração endovenosa para oral. No estudo de custo-minimização, foram avaliados os prontuários de 152 pacientes, sendo 103 (67,8%) deles foram tratados com linezolida exclusivamente pela via endovenosa e em 33 (31,7%) oportunidades poderia ter ocorrido a troca para a forma oral de administração do antimicrobiano. O custo médio por paciente após a troca hipotética seria significativamente menor do que o valor real gasto (p<0,01) e a economia seria de R$ 32.680,03 em quatro anos.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-25T12:11:00Z No. of bitstreams: 2 Waleska Yana Lazaretti.pdf: 953419 bytes, checksum: 36f62c7ad6ece04a0ae6842c9d0df45c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-25T12:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Waleska Yana Lazaretti.pdf: 953419 bytes, checksum: 36f62c7ad6ece04a0ae6842c9d0df45c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-08 / Acinetobacter baumannii (A. baumannii) is an important opportunistic, Gram-negative pathogen responsible for severe nosocomial infections such as pneumonia, septicemia, urinary tract infections and meningitis. Strains of A. baumannii have been identified in an endemic and epidemic manner in hospitals, being verified the occurrence of multiresistant strains in these environments, with important ability to adapt to selective changes and environmental pressures. Furthermore, multidrug resistance to antibiotics has been continuously studied because it is a global public health problem, resulting in failure of therapy, prolongation of hospitalization, increase of mortality and morbidity rates, and increase in the financial costs of treatment. This pathogen has varied strategies involved with antimicrobial resistance, but it is known that the bacteria are able to respond to unfavorable conditions in the medium through the rapid expression of heat shock proteins (HSP) and also appear to be involved with the stress response caused by the presence of antibiotics. Among the HSPs is ClpB, an ATP-dependent molecular chaperone belonging to the HSP100 family that is associated with several cellular activities, with the remarkable ability to rescue proteins damaged by stress. The objective of this work was to investigate the role of the clpB gene responsible for the coding of a heat shock protein through qPCR in response to stress generated by thermal shock and antibiotics in cells of a multidrug resistant strain of A. baumannii (RS4). Tests performed included analysis of the structure of the clpB gene with bioinformatics tools and analysis of the expression of the same gene by qRT-PCR in response to exposure to heat shock and subinhibitory concentrations of the following antibiotics: ampicillin (30 g mL-1 ), amoxicillin + sulbactam (12 g mL-1), cefepime (30 g mL-1), sulfamethoxazole + trimethoprim (120/8 g mL-1) and meropenem (18 g mL-1).The analysis of the qPCR results showed a transient increase in the induction of the clpB gene in the different treatments used in this study and repression of mRNA-clpB in the presence of cefepime. In addition, in the presence of ampicillin and amoxicillin associated with sulbactam the increase in mRNA-clpB synthesis was around 1.4 times higher after 20 min of incubation with the antibiotics than in the complete absence of the antibiotics. Surprisingly, in the presence of meropenen the induction of mRNA-clpB expression was more than 30-fold higher after 10 minutes of incubation with the antibiotic and more than 8-fold higher in the presence of sulfamethoxazole associated with trimetropin. These data suggest that A. baumannii through thermal stress and antibiotic exposure, adjusts transcription levels of gene clpB allowing the bacterium to survive unfavorable conditions of the medium. Consequently, it can be stated that the protein encoded by the clpB gene is an important virulence factor in response to antibiotics in this pathogen. / Acinetobacter baumannii (A. baumannii) é um importante patógeno oportunista, Gram-negativo e responsável por infecções nosocomiais severas como pneumonias, septicemias, infecções urinárias e meningites. Cepas de A. baumannii têm sido identificadas de maneira endêmica e epidêmica nos hospitais, sendo verificada a ocorrência de cepas multirresistentes nesses ambientes, com importante habilidade de adaptação a mudanças seletivas e pressões ambientais. Ainda, a multirresistência a antibióticos vem sendo estudada continuamente, por se tratar de um problema de saúde pública global, resultando em falha na terapia, no prolongamento da internação hospitalar, no aumento das taxas de mortalidade e morbidade e na elevação dos custos financeiros do tratamento. Esse patógeno possui estratégias variadas envolvidas com a resistência aos antimicrobianos, porém, sabe-se que as bactérias apresentam habilidade de responder a condições desfavoráveis do meio em que se encontram por meio da rápida expressão de proteínas de choque térmico (HSP) e parecem também estar envolvidas com a resposta a estresse causado pela presença de antibióticos. Dentre as HSPs, está a ClpB, chaperone molecular dependente de ATP, pertencente à família HSP100 que está associada a diversas atividades celulares, com a capacidade notável para resgatar proteínas danificadas pelo estresse. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel do gene clpB em resposta a estresse gerado por choque térmico e antibióticos em células de uma cepa multirresistente de A. baumannii (RS4). Os testes realizados englobaram análise da estrutura do gene clpB com ferramentas de bioinformática e análise da expressão do mesmo gene por qRT-PCR em resposta à exposição a choque térmico e a concentrações subinibitórias dos seguintes antibióticos: ampicilina (30 g mL-1), amoxacilina+ sulbactam (12 g mL-1), cefepime (30 g mL-1), sulfametoxazol + trimetoprima (120/8 g/mL-1) e meropenem (18 g mL-1). Os resultados apontados por análise de bioinformática sugerem uma conservação da estrutura global de ClpB dentro do gênero Acinetobacter sp. A análise dos resultados de qPCR evidenciou aumento transitório na indução do gene clpB nos diferentes tratamentos utilizados neste estudo e repressão do mRNA-clpB na presença de cefepime. Em adição, tanto na presença de ampicilina como de amoxicilina associada à sulbactam o aumento na síntese de mRNA-clpB foi em torno de 1,4 vezes superior após 20 min de incubação com os antibióticos do que na completa ausência dos antibióticos. Surpreendentemente, na presença de meropenen, a indução da expressão do mRNA-clpB foi mais que 30 vezes superior após 10 minutos de incubação com o antibiótico e mais que 8 vezes superior na presença de sulfametoxaxol associado à trimetropina. Esses dados sugerem que A. baumannii, mediante estresse térmico e exposição a antibióticos, ajusta os níveis de transcrição do gene clpB, permitindo que a bactéria sobreviva a condições desfavoráveis do meio. Consequentemente, pode-se afirmar que a proteína codificada pelo gene clpB figura como importante fator de virulência em resposta a antibióticos neste patógeno.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O camu-camuzeiro (Myrciaria dubia (H. B. K.) McVaugh) é uma espécie frutífera pertencente à família Myrtaceae, de ocorrência espontânea nas margens de rios e lagos da Amazônia. Apresenta potencial econômico, uma vez que o fruto é considerado a maior fonte natural de vitamina C, chegando a atingir 6112 mg de ácido ascórbico por 100 g de polpa, despertando interesse comercial por parte dos produtores e consumidores. Apesar da importância econômica, pouco se sabe sobre os aspectos da multiplicação in vitro desta espécie, o que poderia elevar significativamente a sua produtividade. Neste sentido, objetivou-se com o presente trabalho testar diferentes concentrações de produtos pra desinfestação e estabelecimento de uma cultura asséptica, utilizando explantes de segmentos caulinares de camu-camu provenientes de plantas mães, mantidas em ambiente ex vitro. O trabalho foi dividido em quatro experimentos: 1) Avaliação do efeito do hipoclorito de sódio na assepsia dos explantes de segmentos caulinares de camu-camu in vitro; 2) Avaliação de diferentes concentrações de cloreto de mercúrio na desinfestação in vitro de segmentos caulinares de camu-camu; 3) Determinação da melhor concentração e tempo de imersão de dióxido de cloro na desinfestação in vitro de segmentos caulinares de camu-camu; 4) Uso de antibióticos para o controle da contaminação bacteriana em culturas in vitro de segmentos caulinares de camu-camu. Após 30 dias, avaliou-se o percentual de contaminação e a porcentagem de explantes estabelecidos. A utilização de hipoclorito de sódio a 1,5 % de cloro ativo, por 12 minutos, proporcionou maiores porcentagens de descontaminação (98%), o que resultou na obtenção de bons índices de estabelecimento (87,9%). O cloreto de mercúrio mostrou-se tóxicos aos explantes, mesmo nas menores concentrações. Com a utilização do dióxido de cloro na concentração de 50%, em exposição no tempo de 30 minutos, obteve-se 60% dos explantes desinfestados e 60% estabelecidos. Quanto aos antibióticos, menores índices de contaminação e maiores de estabelecimento (0% e 50% respectivamente) foram obtidos quando utilizou ampicilina na concentração de 100 mg.L-1. Portanto, para desinfestação in vitro de camu-camuzeiro, via segmentos caulinares, deve-se utilizar hipoclorito de sódio a 1,5 % por 12 minutos, com adição no meio de cultura de 100 mg.L-1 de antibiótico ampicilina. / The camu-camu tree (Myrciaria dubia (H.B.K.) McVaugh) is a fruit-bearing species belonging to the family Myrtaceae of spontaneous occurrence on the banks of rivers and lakes of Amazonia. It presents economic potential, since its fruits are thought the greatest natural source of vitamin C, bordering 6,112g of ascorbic acid per 100 g of pulp, arising commercial interest on the part of the farmers and consumers. In spite of the economic importance, little is known about the aspects of the in vitro multiplication of this species, which could raise significantly its yield. In this sense, it was aimed through this work to test different concentrations of products for disinfestation and establishment of an aseptic culture by utilizing explants of stem segments of camu-camu coming from mother plants kept in ex vitro environment. The work was divided into four experiments: 1) evaluation of the effect of sodium hypochlorite upon the asepsis of the explants of stem segments of camu-camu in vitro; 2) to evaluate different concentrations of mercury chlorite in the in vitro disinfestation of camu-camu stem segments; 3) to determine the best concentration and immersion time of chlorine dioxide in the in vitro disinfestations of camum-camu stem segments; 4) Use of antibiotics for the control of bacterial contamination in in vitro cultures of camu-camu stem segments. After 30 days&#8223; time, the percent of contamination and the percentage of established explants were evaluated. The use of sodium hypochlorite at 1.5%of active chlorine for 12 minutes provided highest percentages of decontamination (98%), which resulted into the obtaining of good establishment indices (87.9%). Mercury chlorite proved toxic to the explants even at the lowest concentrations. Through the use of chlorine dioxide at the concentration of 50% under exposition in the 30 minutes&#8223; time, 60% of the disinfected explants and 50% of the established ones were obtained. As to the antibiotics, decreased contamination indices and increased establishment indices (0% and 50%, respectively) were reached when ampicillin at the concentration of 100 mg/ L was utilized. Therefore, for in vitro disinfection of camu-camu tree via stem segments, one should utilize 1.5% sodium hypochlorite for 12 minutes, with addition in the culture medium of 100 mg/ L of antibiotic ampicillin.

A presente tese estudou o diagnóstico e tratamento da mastite bovina pela avaliação do uso de um teste prático de CCS, pela utilização de cultura bacteriológica a campo e pela definição de protocolos de tratamento. Para rápida determinação da CCS, o teste Somaticell® foi usado em amostras de leite tendo o resultado comparado à contagem eletrônica e avaliado por tipo de amostra e pessoa. O Somaticell determinou corretamente a CCS de amostras frescas de leite de quartos mamários. A correlação registrada entre o Somaticell e a CCS eletrônica foi 0,92 e o coeficiente de concordância 0,82. O teste mostrou adequada validade para determinar infecções intramamárias (sensibilidade 91,3%; especificidade 96,0%) e apresentou contagens mais elevadas em amostras contendo patógenos. Pequena variação foi verificada nos resultados do teste quando realizado em duplicata. Entretanto na análise geral dos dados, a variação observada não foi significativa nem afetou a quantidade de amostras com mastite subclínica. Amostras de leite conservadas a 4 ºC por até 5 horas não influenciaram os resultados do Somaticell, mas amostras congeladas ou adicionadas do conservante bronopol não devem ser usadas. Quanto ao diagnóstico da mastite clínica, as infecções causadas por bactérias Gram positivas foram em maioria isoladas de casos clínicos com alteração visual do leite e edema de úbere, de vacas reincidentes e com CCS mensal média maior de 200.000 céls/mL. Por outro lado, as mastites causadas por bactérias Gram negativas apresentaram em maioria casos clínicos com comprometimento sistêmico em vacas de alta produção. Enquanto isso, as amostras mastíticas com ausência de crescimento na cultura laboratorial apresentaram grau da mastite e perfil do animal variado. A cultura bacteriológica realizada na propriedade leiteira com o conjunto dos meios Sangue Base Azida, MacConkey e Vogel-Johnson, mostrou adequada recuperação dos patógenos causadores de mastite clínica. Do total de 203 cultivos realizados na fazenda e em laboratório 79,3% mostraram concordância. A taxa de concordância das culturas foi afetada pelo número de unidades formadoras de colônia presente na amostra de leite. A sensibilidade e especificidade registradas para a cultura a campo foram 83,0 e 76,5%, respectivamente, as quais foram positivamente influenciadas pelo isolamento de bactérias Gram positivas, e negativamente pelo isolamento de bactérias Gram negativas e resultados com ausência de crescimento. O cultivo feito na fazenda mostrou vantagens em usar amostras de leite frescas, porém a leitura precoce do crescimento bacteriano e a metodologia simples reduzem sua acurácia. Para o tratamento das mastites clínicas com base no resultado da cultura a campo, foi encontrada taxa geral de cura bacteriológica de 69,7%. A CCS da maioria dos tetos que apresentaram mastite se manteve elevada até 21 dias pós-detecção da doença. Mastites causadas por bactérias Gram negativas mostraram taxas de cura mais altas. Já as mastites causadas por Staphylococcus aureus tiveram as menores taxas de cura apesar da utilização de tratamento antibiótico estendido. As mastites de grau 1 e 2, com isolamento de bactérias Gram negativas e ausência de crescimento na cultura bacteriológica, não apresentaram diferença em cura sendo ou não tratadas com antibiótico intramamário. / The present thesis investigated the diagnosis and treatment of bovine mastitis by using a simple test for somatic cell count, on-farm bacteriological culture and guided treatment protocols. To rapidly determine SCC, Somaticell® test was used on milk samples having the results compared to electronic count and evaluated by sample type and reader. The Somaticell test correctly determined the SCC in fresh milk samples of mammary quarters. The correlation between Somaticell and electronic SCC was 0.92, being kappa coefficient equals to 0.82. This test presented good reliability to determine intramammary infections using a threshold of 205.000 cells/mL (sensitivity = 91.3% and specificity = 96.0%) and showed greater SCC in samples containing major mastitis pathogens. Minor intra-individual variation was detected when performing the test. Probably, the homogenization procedure of the test is the most likely explanation for the observed variation. However, the final analysis indicated that this variation was not significant and did not affect the amount of samples classified as having subclinical mastitis. Milk samples preserved at 4 ºC up to 5 hours did not change test results. Nevertheless, frozen or bronopol preserved samples were not suitable for this test. Clinical mastitis data indicated that infections caused by Gram positive bacteria were mainly seen on clinical cases with visual milk abnormalities and udder edema of clinical recurrent animals showing monthly average SCC greater than 200,000 cells/mL. In contrast, clinical mastitis caused by Gram negative bacteria was frequently associated with systemic signs in high producing cows. In addition, mastitic samples without bacterial growth in the laboratory did not present a defined pattern in relation to mastitis grade and animal characteristic. The on-farm bacteriological culture using Azide Blood Agar Base, MacConkey Agar and Vogel-Johnson Agar, showed adequate recovery of mastitis causing pathogens. In 79.3% of the cultures (n = 203) the on-farm results agreed with the standard laboratory culture. Interestingly, the concordance rate was affected by the number of colony forming units in the milk sample. The sensitivity and specificity of on-farm culture were 83.0 and 76.5%, respectively. These results were positively influenced by growth of Gram positive bacteria and negatively influenced by growth of Gram negative bacteria and samples with no growth. The use of fresh milk samples in on-farm culture seemed advantageous for bacterial recovery, although premature plate reading of bacterial growth and simplicity of this methodology might reduce its accuracy. Mastitis treatment guided by on-farm culture showed an overall bacteriological cure rate of 69.7%. In the majority of quarters, SCC remained elevated within 21 days after detection of clinical mastitis. Gram negative bacteria presented greater cure rates. On the contrary, Staphylococcus aureus mastitis displayed the lowest cure rate even by using extended antibiotic treatment. Intramammary antibiotic treatment did not show effect on cure rates of grade 1 and 2 clinical mastitis caused by Gram negative bacteria or with negative growth in the on-farm culture.

A administração de medicamentos por via subcutânea é considerada segura, de manuseio simples e descrita como alternativa às vias intravenosa e intramuscular em pacientes em cuidados paliativos (CP) com difícil acesso venoso. A escassez de estudos e a pouca divulgação dessa via parenteral para administração de antibióticos restringem o seu uso. Portanto, realizou-se uma revisão integrativa da literatura, com objetivo de identificar e analisar as evidências disponíveis na literatura científica sobre o uso de antibióticos por via subcutânea em pacientes com difícil acesso venoso em CP quanto à tolerância local e à eficácia terapêutica, utilizando-se como referencial teórico a Prática Baseada em Evidências. Para a busca e seleção dos estudos, foram utilizadas 5 bases de dados: LILACS, CINAHL, PUBMED, EMBASE e Biblioteca Cochrane. A amostra foi de 17 estudos, sendo 4 com nível de evidência forte (nível II), 5 com nível de evidência moderada (nível III) e 8 com nível de evidência fraca (nível V e VI). Foram encontrados 10 antibióticos: Ertapenem, Ceftriaxona, Cefepime, Teicoplanina, Ampicilina, Tobramicina, Amicacina, Netilmicina, Gentamicina e Sisomicina, sendo Ceftriaxona o antibiótico mais estudado. A eficácia terapêutica foi satisfatória por via subcutânea a partir dos parâmetros farmacocinéticos, quando comparados às vias intravenosa e intramuscular, variando de um estudo para o outro de acordo com características da população estudada, dose e concentração do antibiótico. A confirmação da eficácia terapêutica por parâmetros clínicos foi avaliada em 1 estudo sobre Ceftriaxona com melhora dos sintomas clínicos dos pacientes. Sobre a tolerância local, constatou-se que, quanto maior a diluição do antibiótico, melhor a tolerância. Exceto a Tobramicina, todos os Aminoglicosídeos foram associados a lesões graves com evolução para necrose tecidual. A baixa tolerância reforça a restrição de uso apenas para essa classe de antibióticos. Para Ampicilina e Ertapenem não se observou intolerância local. Com Teicoplanina, a tolerância local foi boa: apenas 1 relato de dor e eritema quando se utilizou água para injeção como diluente. Com Cefepime, foram observados 2 casos de edema leve com eritema seguido de mínima dor, e 1 caso de prurido local. Para Ceftriaxona com 2 g associado a lidocaína a 1% observou-se dor e necrose tecidual; com 0,5 g não se observou intolerância alguma, e com 1 g observou-se boa tolerância, porém, em todos os casos com placebo salino ou hialuronidase prévios houve queixa de dor. As previsões de eficácia terapêutica e a boa tolerância constatadas para os antibióticos por via subcutânea sugerem uma possibilidade a ser considerada quando se deseja uma via de administração parenteral alternativa. Entretanto, recomenda-se cautela e avaliação criteriosa devido à lacuna existente sobre o uso de antibióticos por via subcutânea em pacientes em CP e suas necessidades e condições específicas. Embora os dados evidenciados fortaleçam o corpo de conhecimento de enfermagem na tomada de decisão para a implementação da assistência, faz-se necessária a realização de mais estudos com nível de evidência forte e de boa qualidade metodológica que comprovem ou refutem a efetividade desses antibióticos por via subcutânea para os pacientes em CP. / The administration of medication by subcutaneous route is considered safe, simple to handle and described as an alternative to intravenous and intramuscular routes in patients in palliative care (PC) with difficult venous access. The lack of studies and the little disclosure of this parenteral route to administer antibiotics restrict its use. Therefore, this integrative literature review aimed to identify and analyze the evidences available in scientific literature on the use of antibiotics by subcutaneous route in patients with difficult venous access in PC regarding the local tolerance and therapeutic efficacy, using as theoretical framework Evidence-Based Practice. The following five databases were used in the search and selection of studies: LILACS, CINAHL, PUBMED, EMBASE and Cochrane Library. The sample consisted of 17 studies, 4 with strong level of evidence (level II), 5 with moderate level of evidence (level III) and 8 with low level of evidence (level V and VI). Ten antibiotics were found: Ertapenem, Ceftriaxone, Cefepime, Teicoplanin, Ampicillin, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin, Sisomicin and Gentamicin. The antibiotic Ceftriaxone was studied the most. The therapeutic efficacy was satisfactory via subcutaneous route, according to the pharmacokinetic parameters when compared to intravenous and intramuscular routes, varying from study to study according to characteristics of the studied population, dose and concentration of the antibiotics. Confirmation of the therapeutic efficacy by clinical parameters was evaluated in one study about Ceftriaxone with improvement of clinical symptoms of patients and cure of the infection. With regard to local tolerance, it was found that the higher the dilution of the antibiotic, the better the tolerance. Except for Tobramycin, all aminoglycosides have been associated with severe injury progressing to tissue necrosis. The low tolerance reinforces the restriction of use only to this class of antibiotics. No local intolerance was observed for Ampicillin and Ertapenem. Teicoplanin showed good local tolerance: there was only one report of pain and erythema when using water as diluent for injection. With Cefepime, the following was observed: 2 cases of mild edema with erythema followed by minimal pain, and 1 case of local itching. For Ceftriaxone 2 g associated with Lidocaine 1%, pain and tissue necrosis was observed, with 0.5 g no intolerance was observed, and with 1 g there was good tolerance, however, in all cases with previous saline placebo or Hyaluronidase there was complaint of pain. Predictions of therapeutic efficacy and good tolerability observed for antibiotics with subcutaneous route suggest a possibility to be considered when there is need of an alternative parenteral route for administration. However, there is for caution and careful evaluation as there is a gap on the use of antibiotics vie subcutaneous route in PC and their specific needs and conditions. Although the evidenced data strengthen the body of knowledge for nursing in decision making for the implementation of care, there is need of further studies with strong level of evidence and good methodological quality that can prove or refute the effectiveness of these antibiotics through subcutaneous route to patients in PC.

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O presente estudo objetivou caracterizar as populações de protozoários ciliados no rúmen de novilhos alimentados com dietas adicionadas de monensina ou produtos à base de própolis LLOS, avaliando o impacto da suplementação desses aditivos em curto prazo de tempo sobre as populações de ciliados. Cinco novilhos, fistulados no rúmen e distribuídos no delineamento quadrado latino (5X5) receberam dieta constituída por 47% de silagem de milho e 53% de concentrado à base de milho moído e farelo de soja. Foram testadas dietas sem aditivos (controle), com adição de monensina ou produtos à base de própolis LLOSB1+, LLOSC1+ ou LLOSC1++. As amostras do conteúdo ruminal foram coletadas antes do inicio de cada período amostral (dia 0) e 8, 15 e 21 dias após o início de cada período amostral, sendo que, no dia de cada coleta foram retiradas amostras antes do fornecimento da dieta experimental (0h) e 3 e 6 horas depois da suplementação. O gênero predominante nas dietas foi o Entodinium, representando valor acima de 97% da densidade total de ciliados. As populações de ciliados no rúmen dos novilhos não foram alteradas pela suplementação com o aditivo monensina ou produtos à base de própolis LLOS. O pH ruminal alterou-se apenas entre os tempos de amostragem. As populações de Entodinium aumentaram após 15 dias da adição do produto à base de propolis LLOSB1+ e após 21 dias foi verificado um efeito negativo desse aditivo sobre os ciliados, que aumentaram, retornando aos níveis iniciais. Os ciliados diminuíram após 8 dias de adição de monensina na dieta, restabelecendo-se apos 15 da suplementação e tornando a diminuir no final do experimento. As populações do gênero Entodinium ao longo do experimento foram alteradas durante os períodos experimentais, especialmente com a suplementação dos produtos à base de própolis LLOS o que pode ter influenciado os resultados encontrados. Sugere-se assim, o aumento do período experimental e substituição do delineamento quadrado latino em trabalhos futuros. / The ciliated protozoa are part of the rumen microbial and together with bacteria, fungi and flagellate protozoa play important biochemical and physiological functions for ruminants, especially in the metabolism of nutrients. However, its role in the rumen yet is not entirely clear, and it may bring both beneficial and harmful effects to animal production. This study aimed to characterize the ciliated protozoa population in the rumen of steers fed with diets containing monensin or products based on propolis LLOS, evaluating the impact of supplementation of these additives in a short period of time on the abundance of ciliates. Five steers, fistulated in the rumen and distributed in Latin square design (5X5) were fed with a diet consisting of 47% corn silage and 53% concentrate based on grinded corn and bran soybean. Diets were tested without additives (control), with the addition of monensin or products based on propolis LLOSB1+, LLOSC1+ and LLOSC1++. The samples of rumen contents were collected before the start of each sampling period (day 0) and 8, 15 and 21 days after the start of each sampling period, whereas, on each collect day were collected samples before the supply of experimental diet (0 h) and 3 and 6 hours later supplementation. The predominant genus in the diets was the Entodinium, representing a value above 97% of the total density of ciliates. The ciliate population in the rumen of steers were not altered by supplementation with the additive monensin or products based on propolis LLOS. Rumen pH changed only between times of sampling. The Entodinium population increased after 15 days of the products addition based on propolis LLOSB1+ and after 21 days it was observed a negative effect of this additive on the ciliates. They increased, returning to their initial levels. The ciliates got shorter after 8 days of monensina addition in the diet, reestablishing after 15 days of supplementation and getting shorter again at the end of the experiment. The genus Entodinium population throughout the experiment were altered during the experimental periods, especially with the addition of the products based on propolis LLOS which may have affected the results. It is therefore suggested, an increase of the experimental period and the replacement of the Latin square design in future works.