Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Andrei Munhoz / Banca: Juliana Barbosa Coitinho Gonçalves / Banca: Julhiany de Fátima da Silva / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Maria Célia Bertolini / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, micose sistêmica de grande importância na América Latina devido a incidência. Durante a interação com o hospedeiro, P. brasiliensis sintetiza diversas moléculas que auxiliam no processo infeccioso, entre elas, a proteína Pb14-3-3 desempenha um importante papel no estabelecimento da infecção. Este estudo teve como objetivo aprofundar o conhecimento sobre esta proteína através de caracterização biofísica e estrutural, identificar proteínas ligantes tanto de P. brasiliensis quanto de células humanas e avaliar seu potencial imunogênico em G. mellonella. Para isso, a proteína Pb14-3-3 recombinante foi produzida e purificada por técnicas cromatográficas. O conteúdo de estrutura secundária e a avaliação da estrutura terciária foram avaliados por dicroísmo circular e fluorescência intrínseca do triptofano, respectivamente onde foi observado que a proteína obtida é composta majoritariamente por estruturas α-hélices e apresenta estrutura terciária. A estabilidade térmica também foi avaliada e a Pb14-3-3 recombinante mantém sua estrutura secundária até a temperatura 55°C, temperatura muito superior as utilizadas nos experimentos posteriores. A resolução da estrutura tridimensional por cristalografia de raios-X demonstrou que a proteína é composta por nove estruturas α-hélices dispostas em arranjo antiparalelo, formando um canal de ligação característico das proteínas da família 14-3-3. Curiosamente, obs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:Paracoccidioides brasiliensis is one the etiological agents of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of great importance in Latin America due its incidence. During the interaction with the host, P. brasiliensis synthetizes several molecules that assist in the infectious process, among them the Pb14-3-3 plays a crucial role in the establishment of the infection. This study aimed to increase the knowledge about this protein by performing the biophysical and structural characterization, identify binding protein from P. brasiliensis and host cells and evaluate its immunogenic potential in G. mellonella. For this, the Pb14-3-3 recombinant protein was produced in E. coli and purified by chromatography techniques. The secondary structure content and evaluation of tertiary structure was performed by circular dichroism and intrinsic tryptophan fluorescence, respectively and it was observed that the obtained protein is mainly composed by structures and presents tertiary structure. The thermal stability was also evaluated and the Pb14-3-3 recombinant protein maintains its secondary structure until 55°C, which is higher than the temperatures used in subsequent experiments. The resolution of the 3D structure by X-ray crystallography revealed that the protein is composed by nine α-helix, in antiparallel arrangement, forming a binding groove that is characteristic from 14-3-3 proteins family; Interestingly, it was observed that during the crystallization process the Pb14-3-3 interacts with a peptide, which dissociates when crosslinked with glutaraldehyde. The peptide sequence was predicted in silico and presented the binding motif mode II proposed for 14-3-3 proteins. The interactions assays showed that Pb14-3-3 interacts with several proteins from both P. brasiliensis and host cells (ATCC MRC-5). Among the biding proteins from P. brasiliensis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Determina la resistencia microbiana y capacidad de formar biopelículas de las cepas de Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes aisladas de carnes frescas provenientes de tres mercados de Lima Metropolitana. Por eso se recolectaron 60 muestras que se distribuyó en tres grupos de 20 muestras de carne fresca (10 de pollo y 10 de cerdo) por cada mercado y se realizó el respectivo análisis microbiológico para identificarlos. Luego, se determinó la sensibilidad antimicrobiana por el método de Kirby Bauer según la CLSI y la formación de biopelículas por el método de microtitulación en placa, según las recomendaciones de Stepanovic et al. Se encontró incidencia de 75% para S. aureus y 13,33% para L. monocytogenes. Las cepas de S. aureus, presentaron resistencia a la penicilina (75,56%) y tetraciclina (28,89%); 97,78% al sulfametoxazol-trimetoprim, 82,22% para gentamicina y ciprofloxacino y 77,78% a la clindamicina. El 75% de las cepas de L. monocytogenes presentaron una resistencia a la clindamicina y ninguna presentó resistencia a la ampicilina, penicilina, tetraciclina, sulfametoxazol-trimetoprim, gentamicina, eritromicina y vancomicina. Se determinó que 33,33% de las cepas de S. aureus tienen capacidad fuerte, 28,89% capacidad moderada, 33,33% capacidad débil y 4,45% no tenían capacidad de formar biopelículas. En el caso de las cepas de L. monocytogenes, 100% presentó capacidad débil de formar biopelículas. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la incidencia de E. coli formadora de biopelículas y resistente a antibióticos aisladas del Hospital Cayetano Heredia, se lleva a cabo un estudio observacional, descriptivo, prospectivo y serie de casos donde se recolectaron 100 cepas de E.coli aisladas de muestras de orina de pacientes con ITU del Hospital de biopelículas por microtitulación con tinción de CV, durante noviembre a diciembre del 2017, se verifican sus características fenotípicas en agar MacConkey y la prueba bioquímica IMVIC, además se realiza el ensayo caracterización molecular por PCR convencional para el gen usp, y Multiplex PCR para los genes fim H, hly A, agn 43, electroforesis y antibiograma mediante difusión de discos. / Tesis

El control de residuos de sustancias antimicrobianas en productos de origen animal, entre los que se encuentra la leche, es de gran importancia, ya que pueden ocasionar problemas al consumidor (alergias, trastornos digestivos, resistencias a medicamentos, etc.) y, además, causar interferencias en la fabricación de productos lácteos ocasionando graves pérdidas económicas en la industria láctea. Por ello, resulta conveniente establecer un adecuado sistema de control de la presencia de residuos de aquellos antimicrobianos más utilizados en el ganado vacuno lechero, mediante métodos eficaces y prácticos que pueden ser utilizados en las explotaciones ganaderas y centros lácteos, y así evitar su llegada al consumidor. Devido a la diversidad de métodos analíticos disponibles en el mercado para la detección de antibióticos se planteó el estudio de la selectividad y sensibilidad de los métodos microbiológicos y específicos más utilizados en la etapa de cribado. En el estudio de selectividad se emplearon 14 métodos (7 microbiológicos y 7 específicos) y se analizaron, por triplicado, 100 muestras de leche procedentes de animales no tratados con ningún medicamento. La selectividad obtenida para los métodos microbiológicos fué muy elevada: BRT AiM (99%), Blue Yellow (100%) Delvotest MCS Accelerator (98%), Delvotest SP-NT (98%), Eclipse 50 (99%) y Eclipse 100 (99%) y no presentó diferencias significativas entre los métodos. También la sellectividad calculada para los métodos específicos alcanzó valores elevados: Beta Star (97%), Delvo XP (99%), Rosa MRL BL (100%), Rosa TET (99%), Snap BL y Snap TET (100%) y Twinsensor (98%) que no presentaron diferencias significativas (p<0,05), mientras que el método Penzym fue el único en el que la selectividad resultó más baja (82%) con un elevado porcentaje de resultados dudosos y estadísticamente fue diferente al resto de métodos específicos. En cuanto a la sensibilidad se calculó utilizando muestras de leche, procedentes de la mezcla de 30 / Borràs Llopis, M. (2011). Evaluación de los métodos de cribado para el control de la presencia de antibióticos en la leche cruda de vaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14011

Orientador: Saulo Santesso Garrido / Resumo: Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma alternativa interessante como bioconservantes de alimentos devido a sua eficiência e, principalmente, à baixa toxicidade quando comparados aos conservantes químicos tradicionais. As bacteriocinas, uma classe de PAMs, têm atividade antimicrobiana em espécies responsáveis pela degradação de alimentos e, portanto, atualmente são exploradas como bioconservadores. A Leucocina C-TA33a (LeuC), um tipo de bacteriocina produzida pela cepa bacteriana Leuconostoc mesenteroides TA33a, é conhecida por ter um amplo espectro antimicrobiano. Estudos de alinhamento da estrutura primária de diferentes bacteriocinas revelaram que LeuC conserva em sua estrutura regiões homólogas também compartilhadas por outras bacteriocinas, como Sacacina P, Bavaricina A e Enterocina A, possivelmente revelando uma importante relação entre essas sequências de aminoácidos e suas atividades antimicrobianas. Este estudo tem como objetivo sintetizar diferentes peptídeos baseados na estrutura primária da Leucocina CTA33a, a fim de identificar as principais regiões responsáveis pela atividade antimicrobiana. Os peptídeos LeuC-Nt, LeuC-0Cys, LeuC-Ala9, LeuC-Ala14 e LeuC-Cys9,14 foram sintetizados por metodologia de fase sólida, purificados e analisados por HPLC e caracterizados por ESI-MS. Ensaios em meio líquido foram realizados para a determinação do percentual de inibição de crescimento microbianos dos peptídeos sobre espécies patogênicas. Os micro-organismos testados fora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Antimicrobial peptides (PAMs) are an interesting alternative, because biopreservatives present high efficiency and low toxicity when compared to classic preservatives. Bacteriocins, a class of PAMs, have antimicrobial activity in species responsible for food degradation and are currently being exploited as biopreservatives. The Leucocin C-TA33a (LeuC), a type of bacteriocin, is produced by the Leuconostoc mesenteroides TA33a strain and is known for a broad antimicrobial spectrum. Studies of alignment of the primary structure of different bacteriocins revealed that LeuC retains in its structure homologous regions also shared by other bacteriocins, such as Sacacin P, Bavaricin A and Enterocin A, possibly revealing an important relationship between these amino acid sequences and their antimicrobial activities. This study aims to synthesize different peptides based on the primary structure of Leucocin C-TA33a, with the objective of identifying the main regions responsible for antimicrobial activity. The peptides LeuC-Nt, LeuC-0Cys, LeuC-Ala9, LeuC-Ala14 and LeuC-Cys9,14 were synthesized by solid phase methodology, purified by HPLC and characterized by ESI-MS. Liquid assays were performed to determine the percentage of inhibition of microorganisms of the peptides on pathogenic species. The microorganisms tested were Salmonella serotype Typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Listeria monocytogenes. Studies were also conducted through circular dichroism, molecular ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

INTRODUÇÃO: Embora a lista dos microrganismos envolvidos em fungemias esteja em expansão, as espécies de Candida permanecem como os principais agentes etiológicos, causando morbidade e mortalidade significativas. A introdução de novos antifúngicos na prática clínica tem reforçado a necessidade de estudos que monitorem mudanças na epidemiologia e no perfil de sensibilidade de Candida spp. a nível local e global. OBJETIVO: Avaliar a prevalência e incidência de candidemia no HC-FMUSP durante o ano de 2006 e determinar o perfil de suscetibilidade das espécies isoladas. MÉTODOS: Foi realizado um estudo retrospectivo no qual os pacientes identificados foram caracterizados de acordo com variáveis clinicas disponíveis nos sistemas laboratoriais. A concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada pelo método de microdiluição Sensititre YeastOne Ò, considerado como referência, além do Etest Ò. As seguintes drogas foram avaliadas: anfotericina B (AMB), caspofungina (CAS), fluconazol (FLU), itraconazol (ITR), voriconazol (VOR) e posaconazol (POS). O método de disco difusão (DD) também foi utilizado para FLU e VOR. Os resultados obtidos pelas três metodologias foram comparados entre si. RESULTADOS: A prevalência de Candida em hemocultura foi de 3,5%. Foram identificados 136 casos de candidemia e a incidência global foi de 1,87 casos/1.000 admissões hospitalares e 0,27 casos por 1.000 pacientes dia. A mediana de idade foi de 40 anos e 58,1% dos pacientes eram homens. Neoplasia foi a doença de base mais frequente. Na distribuição das espécies, C. albicans foi a espécie mais isolada (52,2%), seguida por C. parapsilosis (22,1%), C. tropicalis (14,8%) e C. glabrata (6,6%). O perfil de sensibilidade foi determinado em 100 cepas de Candida. Destas, 100% mostraram-se suscetíveis a AMB e CAS; 98 % ao VOR; 91%, ao FLU e 66% ao ITR. Para o POS, MIC90 foi de 0,25 µg/mL. O percentual de concordância essencial (CE) e concordância categórica (CC) entre o teste de referência e o Etest Ò foi > 93%, exceto para o itraconazol (CE 80%, CC 70%). O percentual de CC para o fluconazol e voriconazol pelo DD versus Sensititre Ò e Etest Ò foi, respectivamente: FLU 94%, 95% e VOR 96%, 98%. CONCLUSÃO: A prevalência a incidência de candidemia encontrada e a distribuição das espécies concordaram com outros dados nacionais. Observou-se uma boa atividade in vitro da maioria das drogas para Candida spp., exceto itraconazol. Houve uma boa concordância essencial entre os métodos utilizados, exceto também para itraconazol. As discordâncias de categoria observadas entre os métodos resultaram em erros menores na maior parte dos casos / INTRODUCTION: Although the spectrum of fungi causing bloodstream infections continues to expand, Candida species remain responsible for the majority of cases, causing significant morbidity and mortality. The introduction of new antifungal agents in the clinical practice has increased the need for new studies for monitoring changes in the epidemiology and susceptibility profiles of candidemia at a local and global level. PURPOSE: To determine the prevalence and incidence of candidemia, species distribution and antifungal susceptibility patterns at large Brazilian tertiary public hospital during 2006. METHODS: Data were collected retrospectively. Patients were evaluated for selected variables. The minimal inhibitory concentrations (MIC) were determined using Sensititre YeastOne Ò, considered the reference method, and Etest Ò. The following drugs were tested: amphotericin B (AMB); caspofungin (CAS); and posaconazole (POS),fluconazole (FLU) and voriconazole (VOR). The disk diffusion method was also employed for FLU and VOR. MIC results obtained by Etest Ò, Sensititre YeastOne Ò and disk diffusion were compared. RESULTS: The prevalence of Candida spp. from blood cultures was 3,5%. One hundred and thirty-six cases of candidemia were identified. The overall incidence of candidemia was 1,87 cases per 1.000 admissions and 0,27 cases per 1.000 patient-days. 58.1% patients were male and the median age was 40 years. Cancer was the most frequent underlying disease. C. albicans was the most commonly identified species (52,2%), followed by C. parapsilosis (22,1%), C. tropicalis (14,8%) and C. glabrata (6,6%). The susceptibility profile of 100 Candida spp. isolates was: 100% to AMB B and CAS; 98 % to voriconazole; 91% to fluconazole; and 66% itraconazole. For posaconazole MIC90 was 0,25 µg/mL. The percentage of essential agreement (EA) and categorical agreement (CA) between the reference and test methods was > 93%, except for itraconazole (EA 80%, CA 70%). The (CA) between Sensititre YeastOne Ò versus disk diffusion and Etest Ò versus disk diffusion were respectively: FLU (94%) (95%) and VOR (96%) (98%). Minor errors accounted for the majority of all categorical errors. CONCLUSION: The prevalence and incidence of candidemia found in this study were in agreement with previous national reports. There was a good in vitro activity for most drugs tested against Candida spp. except for itraconazole. A good EA was demonstrated between methods except again for itraconazole. Minor errors accounted for the majority of all categorical errors for between methods.

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.

A apramicina é um antibiótico aminoglicosídeo produzido por uma cepa de Streptomyces Tenebrarius, utilizada na medicina veterinária na forma de sulfato para tratar e prevenir doenças infecciosas produzidas por bactérias gram-negativas em porcos, bezerros e aves domésticas. As preparações comercialmente disponíveis são injetável, premix para adição em rações e pó oral solúvel, sendo esta última objeto de estudo deste trabalho. A Farmacopéia Britânica é o único compêndio oficial que descreve a apramicina (tanto a matéria-prima quanto as preparações) e recomenda o método microbiológico turbidimétrico para o seu doseamento. Embora os métodos microbiológicos ainda sejam os métodos de escolha na determinação da potência de antibióticos, há uma tendência crescente em substituí-los pelos métodos físico-químicos, sobretudo a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a qual proporciona sensibilidade, especificidade, exatidão e precisão; ela já vem sendo usada com sucesso na determinação do teor de antibióticos, embora a sua potência possa estar sujeita a confirmação por um método microbiológico. Considerando-se as vantagens da CLAE, bem como a inexistência de métodos físico-químicos oficiais para a análise de apramicina, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e validar um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência para a quantificação de apramicina em pó oral solúvel, bem como correlacioná-lo com o método turbidimétrico. Foi desenvolvido um método por CLAE empregando fase reversa com o uso de uma coluna C18 de 150 mm x 4,6 mm x 4 &#181;m, derivatização pré-coluna com o-ftalaldeído (OPA) e detecção por UV em 332 nm. A metodologia proposta foi validada de acordo com normas dos compêndios oficiais e apresentou: boa robustez; linearidade no intervalo de 0,02 a 0,05 mg/mL com obtenção de uma curva de calibração de equação igual a y = 132887304,980x + 127223,837 e coeficiente de correlação linear de 0,9999; boa precisão, sendo o DPR<1,0% para a precisão intra-dia e DPR = 1,1% para a precisão inter-dia; 99,33% de recuperação média, demonstrando exatidão; sensibilidade, com limites de detecção e de quantificação de 0,08 e 0,25 &#181;g/mL, respectivamente. Três lotes de apramicina pó oral solúvel foram analisados pelo método por CLAE e pelo método microbiológico oficial e a comparação estatística entre os resultados obtidos através do Teste T demonstrou que não houve diferença significativa entre ambos no nível de &#945; = 0,05. / Apramycin is an aminoglycoside antibiotic produced by Streptomyces tenebrarius strain, widely used in veterinary medicine under sulfate form to treat and prevent infectious diseases induced by gram-negative bacteria in swines, calves and poultry. The commercially available preparations consist of injections, additive feed (premix) and soluble oral powder, being the latter the aim of this work. British Pharmacopoeia is the only official compendium that describes apramycin (bulk pharmaceutical and its formulations) recommending the microbiological turbidimetric method for its dosage. Although microbiological methods are still of chosen for the determination of antibiotics potency, there is an increasing tendency of replacing them by physico-chemical methods, mainly high performance liquid chromatography (HPLC), which offers sensitivity, specificity, accuracy, and precision; it has been successfully used in the determination of antibiotic assay, although its potency may be subjected to confirmation by a microbiological method. Taking into account the advantages of HPLC as well as the absence of official physicochemical methods to analyze apramycin, the aim of the present work was to develop and validate a method employing high performance liquid chromatography to the quantification of soluble oral powder, as well as to compare it with the turbidimetric method. A HPLC method was developed employing reverse phase with a C18 column of 150 mm x 4,6 mm x 4 &#181;m, pre-column derivatization with OPA (o-phthalaldehyde) and UV detection at 332 nm. The proposed method was validated according to official compendia guidelines, having demonstrated: good robustness; linearity in the concentration range of 0,02 to 0,05 mg/mL with linear equation of y = 132887304,980x + 127223,837 and correlation coeficient of 0,999; good precision, being RSD<1,0% for intra-day precision and = 1,1% for inter-day precision; average recuperation of 99,33%, what demonstrates accuracy; sensitivity, with quantification and detection limits of 0,08 and 0,25 &#181;L/mL, respectively. Three batches of apramycin soluble oral powder were analyzed by HPLC method and by the official microbiological method having the statistical comparison between the obtained results by T test demonstrated that there are no significant differences between both of them at &#945; = 0,05 level.

Manguezais são ecossistemas localizados na confluência de terra e mar, característicos de áreas tropicais e subtropicais, cobrindo cerca de 18,1 milhões de hectares do planeta. A grande biodiversidade encontrada nestes ambientes ressalta a importância da busca por conhecimentos à seu respeito, como o estudo sobre novos princípios ativos derivados de microrganismos endofíticos presentes nas plantas de manguezais. Desta forma, o propósito do presente trabalho foi determinar a diversidade genética da comunidade de fungos endofíticos presentes em folhas e ramos das principais espécies arbóreas de manguezais de Cananéia e Bertioga (situados no estado de São Paulo, Brasil), e avaliar o potencial biotecnológico destes fungos em relação à produção de antibióticos contra os patógenos humanos Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e contra o fitopatógeno Xanthomonas axonopodis citri . Os resultados da primeira etapa do trabalho, que envolveu o isolamento e a caracterização de fungos endofíticos filamentosos, mostraram que a comunidade fúngica associada às plantas de manguezais é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, sendo que os gêneros mais frequentes foram Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum e Xylaria. Grande parte dos gêneros encontrados neste trabalho é de fungos de solo, indicando que eles estão adaptados às condições adversas dos manguezais. Os resultados mostraram que, dentre as linhagens produtoras de antibiótico, 29,41% pertencem ao gênero Diaporthe, o qual apresentou maior frequência na comunidade fúngica estudada. Após a avaliação de 344 fungos quanto ao potencial de atividade antimicrobiana, foi selecionada a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum, um endófito de folha de Laguncularia racemosa, para elucidação da estrutura química do seu antibiótico purificado. Por meio das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear e de Espectrometria de Massas o antibiótico foi identificado como ácido 3-hidroxipropiônico o qual apresentou atividade frente aos patógenos humanos Staphylococcus aureus e Salmonella tiphy. A estrutura química deste antibiótico foi modificada por meio de reação química de esterificação de Fischer-Speier para avaliar a relação da estrutura química e atividade biológica deste composto. O produto final da reação química de esterificação do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico não apresentou atividade antimicrobiana, indicando que o grupo hidroxila removido na reação é importante na atividade farmacológica desse composto. Além disso, a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum foi transformada geneticamente pelo sistema Agrobacterium tumefaciens, visando a obtenção de transformantes deficientes para produção de antibiótico e, com isso, a identificação de genes relacionados com a via de biossíntese do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico. A análise das sequências que flanqueiam o T-DNA, obtidas por TAIL-PCR, mostraram que os genes interrompidos nos transformantes estão relacionados com proteínas de domínios conservados envolvidos com diferentes funções como: translação de proteínas, homeostase do íon orgânico Mg2+, transporte intracelular, migração, adesão e proliferação celular e outras funções celulares. A caracterização da biblioteca de agrotransformantes constitui uma ferramenta importante para o estudo da biologia molecular de fungos que produzem compostos bioativos por meio do seu metabolismo secundário. / Mangroves are ecosystems situated beyond land and sea. They are more frequently found in tropical and subtropical areas englobing around 18.1 millions of hectares in the planet. The great biodiversity found in these ecosystems shows the importance of researching them, including studies regarding new compounds derived from endophytic fungi that inhabit these ecosystems. Therefore, the goal of this study was to determine the genetic diversity of the fungal endophytic community found in leaves and branches of the main arboreal species from mangrove of Cananéia and Bertioga (situated in São Paulo state, Brazil), and to evaluate the biotechnological potential of these fungi concerning the production of antibiotics against the human pathogens Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and against the phytopathogen Xanthomonas axonopodis citri . The results of the first part of this work, including the isolation and characterization of the filamentous endophytic fungi, showed that the mangrove fungal community is made up of at least 35 different genera, from which the most frequent are Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum and Xylaria. Most of the fungal genera found in this study come from soil, which suggests that they are adapted to the adverse conditions of mangroves. The results show that among the antibiotic-produncing strains, 29.41% belong to the genus Diaporthe, which was the most frequently found in the studied fungal community. After the analysis of 344 fungi regarding the antibiotic activity potential, a strain of D. phaseolorum (a leaf endophyte of Laguncularia racemosa) was selected to unveil the chemical structure of their purified antibiotic. The nuclear magnetic resonance and the mass spectrometry techniques allowed the identification of the antibiotic as 3-hidroxypropionic acid, which displayed activity against the pathogens Staphylococcus aureus and Salmonella tiphy. The chemical structure of this antibiotic was modifyed by the chemical reaction of Fischer-Speier sterification in order to evaluate the chemical structure and biological activity of this compound. The final product of the chemical reaction of 3-hidroxipropionic acid sterification had no antibiotic activity, which suggests that the hydroxil group removed from the reaction is important to the pharmachological activity of this compound. Additionally, the strain 41.1(1) of D. phaseolorum was genetically transformed by the Agrobacterium tumefaciens system, in order to generate antibioticdeficient transformants, which would help to identify genes related to the biosynthesis pathway of the 3- hidroxypropionic acid antibiotic. The TAIL-PCR analysis revealed that the interrupted genes in the tranformants are related to proteins from conserved domains involved in different functions such as protein translation, Mg2+ ion homeostasis, intracellular transport, migration, adhesion and cellular proliferation and other cellular functions. The characterization of the agrotransformants library is an important tool to unveiling the molecular biology of fungi that produce bioactive compounds by the secondary metabolism.

A espécie Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produz o complexo antibiótico retamicina, que apresenta atividade contra leucemia em seres humanos mas possui limitações de uso devido ao seu grande efeito cardiotóxico. Uma linhagem mutante de S. olindensis, So20, obtida por tratamento da linhagem selvagem com MMS (metanossulfonato de metila), apresentou diferença qualitativa quanto à produção deste complexo antibiótico. O extrato metanólico das células desta linhagem mutante sofreu diversos tratamentos com solventes orgânicos e foi submetido a diversas técnicas de separação cromatográfica. Algumas substâncias foram parcialmente isoladas e foram submetidas a análise espectrométrica, que indicaram diferenças nas suas estruturas com relação ao complexo obtido da linhagem selvagem DAUFPE 5622. Algumas destas frações parcialmente purificadas da linhagem mutante foram testadas quanto a sua atividade antimicrobiana, contra Bacillus subtilis 007, e quanto sua capacidade de intercalação em fragmentos de DNA em gel de eletroforese, no ICB-USP, indicando resultados promissores. / Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 species produces the antibiotic complex retamycin, which are active against human leukemia, but is still not used in human treatments due to its cardiotoxic effects. The S. olindensis mutant, So20, obtained by treatment with MMS (methyl methanesulfonate), showed qualitative differences in the antibiotic production. The methanolic extract from these mutant strains cells was purified by means of solvent partition and by chromatographic purification techniques. Some compounds were partially purified and the analysis of their spectrometric data indicated structural differences from that obtained from DAUFPE 5622 strains. Some of these partially purified substances from mutant strains were tested for their antimicrobian activity, against Bacillus Subtilis 007, and for their DNA intercalation ability on eletroforesis gel, in the ICB-USP laboratories, showing promising results.