Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1252229 bytes, checksum: 0b4593a2852a3887d9a7973222e702d8 (MD5) Previous issue date: 2009-02-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The soybean [Glycine max (L.) Merr.] is an important crop in the world with high economic and social value. The carterpillar Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) is the most important defoliator of soybean in North and South Americas and the search for useful insecticides to control this pest has been studied. The neem, Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) is the plant with high insecticide potential of the world. The azadirachtin, synthesized mainly in the fruits of this plant is the main component responsible for the lethal and sub-lethal action of the extracts obtained from neem. The objective of this study was evaluate the potential of products derived from A. indica on A. gemmatalis in the laboratory and greenhouse conditions. Third stage larvae of A. gemmatalis were fed for four days with artificial diet containing neem seed ethanol extract and oil trade, AzamaxTM. Mortality, food consumption, feces production, weight gain, weight and deformation of pupae at 24 hours old and the number of eggs per female emerged from larvae fed on sub-lethal doses of azadirachtin were evaluated in laboratory. The effects of neem seed extract and the oil trade on mortality and food consumption of larvae of A. gemmatalis in soybean plants in the greenhouse were also evaluated. The neem seed extract and trades Azamax, caused deleterious effects on the A. gemmatalis larvae, as larval and pupal mortality, reduction of food intake and weight gain, disruption of midgut cells and changes in the fat body. Lower dosages of neem seed extract reduced the egg productions of the A. gemmatalis moths. Soybean plants sprayed with both products from A. indica caused high mortality and reduced the damages by A. gemmatalis in greenhouse conditions. The neem products can be used in integrated program management of A. gemmatalis in the soybean crop. / A soja [Glicine max (L.) Merr.] é uma das mais importantes plantas cultivadas no mundo com grande valor econômico e social. Insetos pragas podem reduzir a produção dessa cultura, destacando-se Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae), como o desfolhador mais importante da soja nas Américas do Sul e Norte. O nim indiano, Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae), é a planta com maior potencial inseticida do mundo. A azadiractina, sintetizada principalmente nos frutos dessa planta, é o principal composto responsável pela ação letal e subletal dessa substância. Os efeitos da azadiractina sobre A. gemmatalis não foram, ainda, estudados, mas, essa praga demonstrada elevada suscetibilidade à inseticidas sintetizados por plantas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar o potencial de produtos derivados de A. indica sobre A. gemmatalis em condições de laboratório e casa de vegetação. Lagartas de terceiro estádio de A. gemmatalis foram alimentadas por quatro dias com dieta artificial contendo extrato etanólico de sementes de A. indica e óleo comercial, Azamax®. A mortalidade, consumo alimentar, produção de fezes, ganho de peso vivo, peso e deformação de pupas com 24 horas após o inicio desse estágio e sobrevivência e a quantidade de ovos produzidos por fêmea emergida a após a exposição ao estrato de nim na fase jovem foram avaliados em laboratório. Os efeitos da aplicação de extrato de sementes de nim e do óleo comercial, Azamax® sobre a mortalidade e consumo alimentar de lagartas de A. gemmatalis em plantas de soja, em casa de vegetação foram, também, avaliados. O extrato de sementes de nim e óleo comercial, Azamax, causaram efeitos deletérios nas lagartas de A. gemmatalis, como mortalidade larval e pupal, redução do consumo alimentar e do ganho de peso, desorganização nas células do intestino médio, modificações no corpo gorduroso e redução da síntese de proteínas no corpo gorduroso. Mariposas A. gemmatalis expostas ao extrato de nim apresentarm redução na quantidade de ovos produzidos. A pulverização de plantas de soja com produtos derivado de A. indica causou elevada mortalidade e reduziu os danos por A. gemmatalis nessa cultura. Isto torna possível a utilização desses produtos em programas de manejo integrado de A. gemmatalis na cultura da soja.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 726745 bytes, checksum: d7e859a904613b934042237a3091a958 (MD5) Previous issue date: 2011-07-27 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Brazilian cerrado plants are potential sources of substances insecticides in agricultural pest control. These substances should be toxic to pests and selective to natural enemies. The objective of this work was to select extracts and fractions of Brazilian cerrado plants in Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) and Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) and toxicity of the best materials to parasitoid Palmistichus elaeisis (Hymenoptera: Eulophidae) parasitizing pupae of this Coleoptera. These insects were obtained from the mass rearing of the same of the Federal University of Viçosa (UFV) in Viçosa, Minas Gerais State, Brazil and the crude extracts and fractions were made in the Federal University of Goiás (UFG) in Catalão, Goiás State, Brazil, after collection of plants of Acisanthera sp. (Melastomataceae), Bidens sulphurea (Cav.) Sch.Bip., Lepidoploa aurea Mart. ex DC. (Asteraceae), Dimorphandra mollis Benth (Fabaceae), Memora nodosa (Silva Manso) Miers (Bignoniaceae) and Salvertia convallariaeodora A.St.-Hill. (Vochysiaceae) in the cerrado in Catalão, Goiás State. Solutions to 0.1 or 0.01% were made of these crude extracts and fractions and applied on eggs of A. gemmatalis or pupae parasitized or not of T. molitor by P. elaeisis dipped in the solution of each product. These solutions were toxic to A. gemmatalis and T. molitor and selective to the natural enemy P. elaeisis. Extracts from species of Asteraceae and Fabaceae were chosen for further studies of Integrated Pest Management (IPM) because they were toxic to pests and selective to natural enemy. / Plantas do cerrado brasileiro são fontes potenciais de substâncias inseticidas no controle de pragas agrícolas. Essas substâncias devem ser tóxicas às pragas e seletivas aos inimigos naturais. O objetivo desse trabalho foi selecionar extratos brutos e frações de plantas do cerrado brasileiro em Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) e Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) e a toxicidade dos melhores materiais ao parasitoide Palmistichus elaeisis (Hymenoptera: Eulophidae) parasitando pupas desse Coleoptera. Esses insetos foram obtidos da criação massal dos mesmos da Universidade Federal de Viçosa (UFV) em Viçosa, Minas Gerais, Brasil e os extratos brutos e frações foram fabricados na Universidade Federal de Goiás (UFG) em Catalão, Goiás, Brasil, após coleta de plantas de Acisanthera sp. (Melastomataceae), Bidens sulphurea (Cav.) Sch.Bip., Lepidoploa aurea Mart. ex DC. (Asteraceae), Dimorphandra mollis Benth (Fabaceae), Memora nodosa (Silva Manso) Miers (Bignoniaceae) e Salvertia convallariaeodora A.St.-Hill. (Vochysiaceae) no cerrado em Catalão, Goiás. Soluções a 0,1 ou 0,01% foram fabricadas desses extratos brutos e frações e aplicadas sobre ovos de A. gemmatalis ou pupas parasitadas ou não de T. molitor pelo P. elaeisis mergulhadas na solução de cada produto. Essas soluções foram tóxicas à A. gemmatalis e T. molitor e seletivas ao inimigo natural P. elaeisis. Extratos das espécies de Asteraceae e Fabaceae foram escolhidos para futuros estudos de Manejo Integrado de Pragas (MIP) por terem sido tóxicos às pragas e seletivos ao inimigo natural.

O objetivo deste estudo foi produzir plantas transgênicas de soja resistentes à Anticarsia gemmatalis. Embriões somáticos da cultivar comercial IAS 5 [Glycine max (L.)] foram cotransformados, por bombardeamento de partículas, com o gene modificado cry1Ac de Bacillus thuringiensis, e com os genes gusA e hpt. A expressão do gene cry1Ac em soja foi controlada pelo promotor da ubiquitina-1 de milho. O co-bombardeamento resultou em uma eficiência de co-transformação de 44%. A integração e expressão dos transgenes gusA/hpt e cry1Ac nos genomas de uma amostra de embriões transformados e de todas as plantas T0, T1, T2 ,T3 e T4 foram confirmadas por atividade de GUS, PCR, Southern blot, Western blot e/ou ELISA. Duas das sete plantas T0 co-transformadas produziram sementes e foram analisadas quanto ao padrão de integração e herança até a geração T4. As progênies T1 de ambas as plantas T0 segregaram para menos plantas cry1Ac/gusA-positivas do que o predito pelos princípios Mendelianos para um único loco dominante (3:1). As famílias T2 e T3 continuaram a segregar de maneira excepcional, com uma vasta deficiência de plantas transgênicas. Além disso, a taxa de segregação indicou que as plantas T2 eram uniformemente heterozigotas para os traços transformados. No entanto, a condição homozigota foi obtida na geração T3 e 11 isolinhas transgênicas foram estabelecidas. As isolinhas transgênicas homozigotas foram avaliadas em relação aos possíveis efeitos do transgene na performance agronômica. Não foi detectada redução significativa de produtividade nas plantas transgênicas. A análise citogenética mostrou que as plantas transformadas apresentam cariótipo normal (2n=40). As plantas transgênicas também foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo para resistência à Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja). Dois controles negativos (IAS 5 não transgênica e isolinha homozigota gusA) foram utilizados. Em um bioensaio com folhas destacadas, as plantas cry1Ac exibiram completa eficácia contra A. gemmatalis, enquanto os controles negativos sofreram significante dano. Dados do ensaio com plantas inteiras demonstraram uma elevada proteção das plantas cry1Ac contra a lagarta-da-soja, enquanto as plantas não transgênicas e a isolinha homozigota gusA exibiram 56,5 e 71,5% de desfolhação, respectivamente. Os bioensaios indicaram que as plantas transgênicas foram altamente tóxicas à A. gemmatalis, oferecendo um efetivo potencial para resistência a insetos em soja. / The objective of this study was to produce soybean transgenic plants resistant to Anticarsia gemmatalis. Somatic embryos of IAS 5, a Glycine max (L.) commercial cultivar, were cotransformed using particle bombardment with the modified Bacillus thuringiensis cry1Ac, gusA and hpt genes. The expression of cry1Ac gene in the soybean was controlled by the ubiquitin-1 promoter from maize. The co-bombardment resulted in a co-transformation efficiency of 44%. The integration and expression of the gusA/hpt and cry1Ac transgenes into the genomes of a sample of transformed embryos and all T0, T1, T2, T3 and T4 plants were confirmed by GUS activity, PCR, Southern blot, Western blot and/or ELISA. Two T0 plants out of the seven co-transformed produced seeds and were analyzed for patterns of integration and inheritance until the T4 generation. The T1 progenies of both T0 plants segregated for fewer cry1Ac/gusA-positive plants than predicted by Mendelian principles for a single dominant locus (3:1). The T2 and T3 families continued to segregate in an exceptional manner, with a vast deficiency of transgenic plants. Moreover, the segregation ratios indicated that T2 plants were uniformly heterozygous for the transformed traits. However, the homozygous condition was obtained in the T3 generation and 11 transgenic isolines were established. The homozygous transgenic isolines were evaluated to test for possible effects the transgene might have on agronomic performance. No significant yield reduction was observed in transgenic plants. The cytogenetical analysis showed that transgenic plants present normal karyotype (2n=40). The transgenic plants were also evaluated by in vitro and in vivo assays for resistance to Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar). Two negative controls (non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline) were used. In a detached-leaf bioassay, cry1Ac plants exhibited complete efficacy against A. gemmatalis, whereas negative controls suffered significant damage. Whole plantfeeding assay data confirmed very high protection of cry1Ac plants against velvetbean caterpillar while non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline exhibited 56.5 and 71.5% defoliation, respectively. The bioassays indicated that the transgenic plants were highly toxic to A. gemmatalis, offering a potential for effective insect resistance in soybean.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-02-15T13:45:43Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 419660 bytes, checksum: e5b57e1bf91b05cd94f22bff2b654578 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T13:45:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 419660 bytes, checksum: e5b57e1bf91b05cd94f22bff2b654578 (MD5) Previous issue date: 2015-07-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Anticarsia gemmatalis Hubner (Lepidoptera: Erebidae), com ampla distribuição geográfica, pode causar desfolhas extremas em oleaginosas. Parasitoides são agentes de controle, que regulam populações de insetos-praga. Palmistichus elaeisis Delvare & LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) tem sido alvo de estudos devido à sua capacidade de parasitismo e de busca. Compostos naturais com atividade inseticidas são estratégias promissoras para o controle de pragas, serem menos nocivos a humanos e mais biodegradáveis ao ambiente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de extratos de Solanum habrochaites Knapp & Spooner (Solanaceae) para ovos e lagartas de A. gemmatalis e a seletividade ao parasitoide P. elaeisis. A pesquisa foi realizada no Laboratório de Análise e Síntese de Agroquímicos do Departamento de Química e no Laboratório de Controle Biológico de Insetos (LCBI) na Universidade Federal de Viçosa em Viçosa, Minas Gerais, Brasil. Indivíduos de A. gemmatalis e P. elaeisis foram obtidos das criações massal do LCBI. Folhas e ramos de S. habrochaites foram secas em estufa ventilada a 40 °C e a extração foi realizada por maceração a frio utilizando-se etanol 98%. Extratos brutos de S. habrochaites foram particionados em diclorometano (EDSH), acetato de etila (EASH) e metanol (EMSH) e submetidos ao fracionamento por cromatografia em coluna de sílica-gel. Ovos e lagartas de terceiro estádio de A. gemmatalis e adultos de P. elaeisis foram expostos aos concentrados de 1, 2, 10, 15 e 20% (v/v) dos extratos para obtenção das CL 50 e CL 90 . Análises do extrato de S. habrochaites em diclorometano por cromatografia a gás acoplada a espetrometria de massas permitiram identificar 14 moléculas, entre elas, hidrocarbonetos de cadeia longa, ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, metil cetonas e aldeídos. O extrato bruto e as frações em diclorometano de S. habrochaites, foram tóxicos para ovos de A. gemmatalis, CL 50 e CL 90 de 1,67% e 7,27%; 2,83% e 6,95%, respectivamente. Extrato em acetato de etila foi toxico para P. elaeisis, com CL 50 15,07% e CL 90 37,05%, os demais extratos foram seletivos ao parasitoide. O extrato em diclorometano foi letal para imaturos de A. gemmatalis com CL 50 de 5,70% e CL 90 28,52% e seletivo para P. elaeisis. A eficiência do extrato de S. habrochaites em diclorometano para ovos e imaturos de A. gemmatalis e sua seletividade a P. elaeisis mostram seu potencial para programas de controle de pragas. / Anticarsia gemmatalis Hubner (Lepidoptera: Erebidae), with wide distribution, can cause extreme defoliation in soybean plants. Parasitoids are biocontrol agents that regulate populations of insect pests. Palmistichus elaeisis Delvare & LaSalle (Hymenoptera: Eulophidae) has been investigated due to its searching and parasitism capacity. Natural compounds with insecticidal activity are promising strategies for pest control, being less harmful to humans and the environment and more biodegradable. The objective of this study was to evaluate the toxicity of Solanum habrochaites Knapp & Spooner (Solanaceae) extracts to eggs and caterpillars of A. gemmatalis and selectivity to the parasitoid P. elaeisis. The survey was conducted in the Laboratory of Analysis and Agrochemical Synthesis of the Department of Chemical and at the Laboratory of Biological Control of Insects (LCBI) in Viçosa Universidade Federal de Viçosa in Viçosa, Minas Gerais, Brazil. Individuals of A. gemmatalis and P. elaeisis were obtained from mass rearing of the LCBI. Leaves and stems of S. habrochaites were dried in a ventilated oven at 40 °C and the extraction performed by cold maceration using 98% ethanol. Crude extracts of S. habrochaites was partitioned in dichloromethane (EDSH), ethyl acetate (EASH) and methanol (EMSH) and subjected to fractioning by silica gel column chromatography. Eggs and third instar A. gemmatalis larvae and adults P. elaeisis were exposed to the concentrations of 1, 2, 10, 15 and 20% (v/v) to obtain the CL 50 and CL 90 for S. habrochaites extracts. Analysis of S. habrochaites in dichloromethane extract by gas chromatography coupled to mass spectrometry permitted the identification of 14 molecules, including long chain hydrocarbons, esters of long chain fatty acids, methyl ketones and aldehydes. The crude extract and fractions in dichloromethane of S. habrochaites were toxic to A. gemmatalis eggs with LC 50 and LC 90 of 1.67% and 7.27%; 2.83% and 6.95%, respectively. Extract in ethyl acetate was toxic to P. elaeisis with CL 50 CL 90 15.07% and 37.05%, the remaining extracts were selective to the parasitoid. The dichloromethane extract was lethal to immature A. gemmatalis with CL 50 CL 90 of 5.70% and 28.52% and selective for P. elaeisis. The efficiency of S. habrochaites extract in dichloromethane to eggs and immature A. gemmatalis and its selectivity to P. elaeisis show its potential for pest control programs.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-06T15:07:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T15:07:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3732467 bytes, checksum: 247973bf48da051a9a1fe62db84cfc55 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), é considerada uma das principais pragas da sojicultura, causando enormes prejuízos devido ao seu ataque. As proteases digestivas desempenham papel importante na fisiologia das larvas e o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. Para a utilização dessa estratégia de controle é necessário conhecer a estrutura dessas enzimas, além de entender as interações químicas com esses inibidores. O uso de programas computacionais são ferramentas úteis para contornarem os problemas relacionados às técnicas de elucidação estrutural e avaliam in silico as principais interações entre as enzimas e os ligantes. Após esse processo a caracterização cinética do complexo enzimático contribuem para a melhor compreensão dos centros ativos e dos mecanismos de ação da enzima. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar a modelagem molecular por homologia das serino-proteases intestinais de A. gemmatalis, avaliar as possíveis interações com peptídeos sintéticos utilizando estudos de docking e propôr um modelo de inibição enzimática das serino-proteases utilizando os peptídeos. As sequências obtidas foram utilizadas na modelagem molecular com o programa I-TASSER. Os três melhores modelos estruturais foram validados através dos parâmetros de C-score e B-factor profile. A análise do C-scoreEC classificou as enzimas como serino-proteases. No estudo de docking, dos sete ligantes testados, somente Gor K, Gor R e Gor 5 apresentaram valores de energia livre de ligação para a formação de complexos estáveis. As principais interações observadas foram em regiões do centro ativo e sítio secundário das enzimas. Para a caracterização cinética utilizando diferentes substratos peptídicos as enzimas foram purificadas por cromotagrafia de afinidade utilizando coluna de p-aminobenzamidina agarose em sistema FPLC. Pelas análises dos parâmetros cinéticos foi possível constatar que as serino-proteases intestinais tripsina- like de Anticarsia gemmatalis têm preferência na hidrólise de substratos contendo arginina na posição P1. Nos estudos de cinética de inibição utilizando os peptídeos sintéticos Gor 3, Gor 4 e Gor 5 em presença do substrato cromogênico L-BApNA observou-se que a inibição é do tipo competitiva linear nas concentrações utilizadas. A melhor Ki foi observada para o peptídeo Gor 5 que apresentou uma inibição mais eficiente em comparação aos peptídeos Gor 3 e Gor 4. No geral, a eficiência na inibição da atividade enzimática está relacionada à capacidade de ligação ao centro ativo da enzima. / The velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), is considered the main pest of soybean culture, causing huge losses due to its attack. Digestive proteases play an important role in the physiology of the larvae and the study of protease inhibitors as pest control agents has received continuous attention. The use of this control strategy requires knowledge of the structure of these enzymes, besides understanding the chemical interactions with those inhibitors. Computer programs are useful tools to overcome problems related to structural elucidation techniques and also evaluate in silico the main interactions between enzymes and ligands. After this process the kinetic characterization of the enzyme complex contribute to a better understanding of the active centers of the enzyme and mechanisms of action. In this context, this study aimed to perform homology modeling of intestinal serine proteases A. gemmatalis, to evaluate possible interactions with synthetic peptides utilizing docking studies and to propose one enzyme inhibition model of serine proteases using peptides. The sequences obtained were used in molecular modeling with I-TASSER program. The top three structural models were validated through the C-score parameters and B-factor profile. Analysis of C-scoreEC ranked enzymes like serine proteases. In the docking study of the seven tested ligands, only Gor K, Gor R and Gor 5 showed binding free energy values for the formation of stable complexes. The main interactions were observed in regions of the active site and secondary site of the enzyme. For kinetic characterization using different peptides substrates the crude extract were purified by affinity cromotagraphy using p-aminobenzamidine agarose column FPLC system. From the analysis of the kinetic parameters was noted that the trypsin-like serine proteases from Anticarsia gemmatalis prefer hydrolyse substrates containing arginine at position P1. In inhibition kinetic studies using synthetic peptides Gor 3, Gor 4 and Gor 5 in the presence of chromogenic substrate L-BApNA was observed that the inhibition is linear competitive in the concentration range used. The best Ki was observed for Gor 5 peptide that showed more efficient inhibition compared to peptides Gor 3 and Gor 4. Overall, the efficient inhibition of enzyme activity is related to the binding capacity to the active center of the enzyme.

O objetivo deste estudo foi produzir plantas transgênicas de soja resistentes à Anticarsia gemmatalis. Embriões somáticos da cultivar comercial IAS 5 [Glycine max (L.)] foram cotransformados, por bombardeamento de partículas, com o gene modificado cry1Ac de Bacillus thuringiensis, e com os genes gusA e hpt. A expressão do gene cry1Ac em soja foi controlada pelo promotor da ubiquitina-1 de milho. O co-bombardeamento resultou em uma eficiência de co-transformação de 44%. A integração e expressão dos transgenes gusA/hpt e cry1Ac nos genomas de uma amostra de embriões transformados e de todas as plantas T0, T1, T2 ,T3 e T4 foram confirmadas por atividade de GUS, PCR, Southern blot, Western blot e/ou ELISA. Duas das sete plantas T0 co-transformadas produziram sementes e foram analisadas quanto ao padrão de integração e herança até a geração T4. As progênies T1 de ambas as plantas T0 segregaram para menos plantas cry1Ac/gusA-positivas do que o predito pelos princípios Mendelianos para um único loco dominante (3:1). As famílias T2 e T3 continuaram a segregar de maneira excepcional, com uma vasta deficiência de plantas transgênicas. Além disso, a taxa de segregação indicou que as plantas T2 eram uniformemente heterozigotas para os traços transformados. No entanto, a condição homozigota foi obtida na geração T3 e 11 isolinhas transgênicas foram estabelecidas. As isolinhas transgênicas homozigotas foram avaliadas em relação aos possíveis efeitos do transgene na performance agronômica. Não foi detectada redução significativa de produtividade nas plantas transgênicas. A análise citogenética mostrou que as plantas transformadas apresentam cariótipo normal (2n=40). As plantas transgênicas também foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo para resistência à Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja). Dois controles negativos (IAS 5 não transgênica e isolinha homozigota gusA) foram utilizados. Em um bioensaio com folhas destacadas, as plantas cry1Ac exibiram completa eficácia contra A. gemmatalis, enquanto os controles negativos sofreram significante dano. Dados do ensaio com plantas inteiras demonstraram uma elevada proteção das plantas cry1Ac contra a lagarta-da-soja, enquanto as plantas não transgênicas e a isolinha homozigota gusA exibiram 56,5 e 71,5% de desfolhação, respectivamente. Os bioensaios indicaram que as plantas transgênicas foram altamente tóxicas à A. gemmatalis, oferecendo um efetivo potencial para resistência a insetos em soja. / The objective of this study was to produce soybean transgenic plants resistant to Anticarsia gemmatalis. Somatic embryos of IAS 5, a Glycine max (L.) commercial cultivar, were cotransformed using particle bombardment with the modified Bacillus thuringiensis cry1Ac, gusA and hpt genes. The expression of cry1Ac gene in the soybean was controlled by the ubiquitin-1 promoter from maize. The co-bombardment resulted in a co-transformation efficiency of 44%. The integration and expression of the gusA/hpt and cry1Ac transgenes into the genomes of a sample of transformed embryos and all T0, T1, T2, T3 and T4 plants were confirmed by GUS activity, PCR, Southern blot, Western blot and/or ELISA. Two T0 plants out of the seven co-transformed produced seeds and were analyzed for patterns of integration and inheritance until the T4 generation. The T1 progenies of both T0 plants segregated for fewer cry1Ac/gusA-positive plants than predicted by Mendelian principles for a single dominant locus (3:1). The T2 and T3 families continued to segregate in an exceptional manner, with a vast deficiency of transgenic plants. Moreover, the segregation ratios indicated that T2 plants were uniformly heterozygous for the transformed traits. However, the homozygous condition was obtained in the T3 generation and 11 transgenic isolines were established. The homozygous transgenic isolines were evaluated to test for possible effects the transgene might have on agronomic performance. No significant yield reduction was observed in transgenic plants. The cytogenetical analysis showed that transgenic plants present normal karyotype (2n=40). The transgenic plants were also evaluated by in vitro and in vivo assays for resistance to Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar). Two negative controls (non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline) were used. In a detached-leaf bioassay, cry1Ac plants exhibited complete efficacy against A. gemmatalis, whereas negative controls suffered significant damage. Whole plantfeeding assay data confirmed very high protection of cry1Ac plants against velvetbean caterpillar while non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline exhibited 56.5 and 71.5% defoliation, respectively. The bioassays indicated that the transgenic plants were highly toxic to A. gemmatalis, offering a potential for effective insect resistance in soybean.

The population outbreak of caterpillar in soybeans has been linked with entomopathogenic elimination of fungi by fungicides. Many experiments were conducted to understand the effect of fungicides Azoxystrobin + Cyproconazole on Nomuraea rileyi. The experiments were: (a) N. rileyi activity time; (b) effect of fungicide application on N. rileyi; (c) the natural occurrence of N. rileyi; and (d) the spectrum of action of N. rileyi on soybean caterpillars. Anticarsia gemmatalis mortality achieved 100% at 48 hours when N. riley was inoculated in powder form. N. rileyi in powder form showed higher time activity in comparison to application of N. rileyi in liquid form. Fungicide application on N. rileyi caused a delay on A. gemmatalis mortality. However, when evaluation was later the mortality of A. gemmatalis by N. rileyi was not affected. The occurrence of N. rileyi in caterpillars was different among local sampled, and it was mainly associated with the weather conditions. N. rileyi showed to be entomopathogenic to A. gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera and Chrysodeixis includens, however, the mortality ranged among species. The major factor that impacted on non-occurrence of N. rileyi in some years may be the weather conditions, rather than fungicide applications. Therefore, fungicides were not the main cause of non-occurrence of N. rileyi and therefore it was not the main cause of caterpillars outbreaks in soybean. / O aumento populacional de lagartas tidas como secundárias na cultura da soja pode estar ligado a eliminação de fungos entomopatogênicos pelos fungicidas. Para compreender o efeito do fungicida Azoxistrobina + Ciproconazol sobre Nomuraea rileyi foram realizados um conjunto de ensaios para determinar o tempo de atividade da N. rileyi; o impacto da aplicação do fungicida em N. rileyi; a ocorrência natural de N. rileyi; e a determinação do espectro de ação de N. rileyi sobre lagartas desfolhadoras da soja. A mortalidade de Anticarsia gemmatalis infestada em folhas inoculadas com N. rileyi na forma de aplicação em pó foi de 100% após 48 horas, apresentando maior tempo de atividade em relação a forma de aplicação líquida. Com relação a aplicação do fungicida sobre N. rileyi, essa causou um retardo na mortalidade de A. gemmatalis. Porém, quando a avaliação da mortalidade foi realizada em um tempo maior a aplicação do fungicida não afetou a mortalidade de A. gemmatalis. A ocorrência de N. rileyi variou entre os locais amostrados, sendo associada principalmente as condições climáticas. N. rileyi mostrou ser um fungo entomopatogênico para A. gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa armigera e Chrysodeixis includens, contudo, o tempo de mortalidade variou entre as espécies. Com isso, o fator de maior influência pela não ocorrência de N. rileyi em alguns anos pode estar mais relacionado as condições climáticas, do que as aplicações de fungicidas. Portanto, os fungicidas não são a principal causa da não ocorrência de N. rileyi e consequentemente das explosões populacionais de lagartas em soja.

O objetivo deste estudo foi produzir plantas transgênicas de soja resistentes à Anticarsia gemmatalis. Embriões somáticos da cultivar comercial IAS 5 [Glycine max (L.)] foram cotransformados, por bombardeamento de partículas, com o gene modificado cry1Ac de Bacillus thuringiensis, e com os genes gusA e hpt. A expressão do gene cry1Ac em soja foi controlada pelo promotor da ubiquitina-1 de milho. O co-bombardeamento resultou em uma eficiência de co-transformação de 44%. A integração e expressão dos transgenes gusA/hpt e cry1Ac nos genomas de uma amostra de embriões transformados e de todas as plantas T0, T1, T2 ,T3 e T4 foram confirmadas por atividade de GUS, PCR, Southern blot, Western blot e/ou ELISA. Duas das sete plantas T0 co-transformadas produziram sementes e foram analisadas quanto ao padrão de integração e herança até a geração T4. As progênies T1 de ambas as plantas T0 segregaram para menos plantas cry1Ac/gusA-positivas do que o predito pelos princípios Mendelianos para um único loco dominante (3:1). As famílias T2 e T3 continuaram a segregar de maneira excepcional, com uma vasta deficiência de plantas transgênicas. Além disso, a taxa de segregação indicou que as plantas T2 eram uniformemente heterozigotas para os traços transformados. No entanto, a condição homozigota foi obtida na geração T3 e 11 isolinhas transgênicas foram estabelecidas. As isolinhas transgênicas homozigotas foram avaliadas em relação aos possíveis efeitos do transgene na performance agronômica. Não foi detectada redução significativa de produtividade nas plantas transgênicas. A análise citogenética mostrou que as plantas transformadas apresentam cariótipo normal (2n=40). As plantas transgênicas também foram avaliadas em ensaios in vitro e in vivo para resistência à Anticarsia gemmatalis (lagarta-da-soja). Dois controles negativos (IAS 5 não transgênica e isolinha homozigota gusA) foram utilizados. Em um bioensaio com folhas destacadas, as plantas cry1Ac exibiram completa eficácia contra A. gemmatalis, enquanto os controles negativos sofreram significante dano. Dados do ensaio com plantas inteiras demonstraram uma elevada proteção das plantas cry1Ac contra a lagarta-da-soja, enquanto as plantas não transgênicas e a isolinha homozigota gusA exibiram 56,5 e 71,5% de desfolhação, respectivamente. Os bioensaios indicaram que as plantas transgênicas foram altamente tóxicas à A. gemmatalis, oferecendo um efetivo potencial para resistência a insetos em soja. / The objective of this study was to produce soybean transgenic plants resistant to Anticarsia gemmatalis. Somatic embryos of IAS 5, a Glycine max (L.) commercial cultivar, were cotransformed using particle bombardment with the modified Bacillus thuringiensis cry1Ac, gusA and hpt genes. The expression of cry1Ac gene in the soybean was controlled by the ubiquitin-1 promoter from maize. The co-bombardment resulted in a co-transformation efficiency of 44%. The integration and expression of the gusA/hpt and cry1Ac transgenes into the genomes of a sample of transformed embryos and all T0, T1, T2, T3 and T4 plants were confirmed by GUS activity, PCR, Southern blot, Western blot and/or ELISA. Two T0 plants out of the seven co-transformed produced seeds and were analyzed for patterns of integration and inheritance until the T4 generation. The T1 progenies of both T0 plants segregated for fewer cry1Ac/gusA-positive plants than predicted by Mendelian principles for a single dominant locus (3:1). The T2 and T3 families continued to segregate in an exceptional manner, with a vast deficiency of transgenic plants. Moreover, the segregation ratios indicated that T2 plants were uniformly heterozygous for the transformed traits. However, the homozygous condition was obtained in the T3 generation and 11 transgenic isolines were established. The homozygous transgenic isolines were evaluated to test for possible effects the transgene might have on agronomic performance. No significant yield reduction was observed in transgenic plants. The cytogenetical analysis showed that transgenic plants present normal karyotype (2n=40). The transgenic plants were also evaluated by in vitro and in vivo assays for resistance to Anticarsia gemmatalis (velvetbean caterpillar). Two negative controls (non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline) were used. In a detached-leaf bioassay, cry1Ac plants exhibited complete efficacy against A. gemmatalis, whereas negative controls suffered significant damage. Whole plantfeeding assay data confirmed very high protection of cry1Ac plants against velvetbean caterpillar while non-transgenic IAS 5 and homozygous gusA isoline exhibited 56.5 and 71.5% defoliation, respectively. The bioassays indicated that the transgenic plants were highly toxic to A. gemmatalis, offering a potential for effective insect resistance in soybean.

Orientadores: Maria Ligia Rodrigues Macedo, Goran Nesic / Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_DesireeSoaresda_M.pdf: 1615013 bytes, checksum: e404c15f23a6cd6027750ac4c6e28c69 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As sementes são ricas fontes de inibidores de proteinases, que prejudicam sua qualidade nutricional, reduzindo a digestibilidade das proteínas e sua absorção. Neste estudo, um inibidor de tripsina (ApTI) foi purificado a partir de sementes de Adenanthera pavonina e testado seu efeito no crescimento e desenvolvimento de dois lepidópteros. Larvas de Anagasta kuehniella alimentadas com ApTI 1% mostraram redução de 50% na sobrevivência e no peso médio. Larvas de Anticarsia gemmatalis alimentadas com dieta contendo ApTI 0,5% apresentaram diminuição de 31% na sobrevivência e de 22% no peso médio. O tempo de desenvolvimento larval e pupal de Anagasta kuehniella alimentadas com a dieta contendo ApTI 1% foi maior, enquanto a porcentagem de adultos sobreviventes diminuiu em relação ao grupo controle. A avaliação nutricional de ApTI sobre o desenvolvimento larval de A. kuehniella mostrou redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e alimento digerido (ECD), e aumento na digestibilidade aproximada (AD) e no custo metabólico (CM). Em relação as larvas de A. gemmatalis, não houve efeito na (ECI), porém foi observado redução na (ECD) e aumento na (AD) e no (CM). Para examinar o efeito in vivo de ApTI sobre os insetos, as atividades das proteinases intestinais das larvas que se alimentaram com dietas livres do inibidor e contendo o inibidor a 0,25 - 1% foram comparadas através de ensaios enzimáticos e eletroforese em gel de atividade enzimática. Larvas de quarto instar de A. kuehniella alimentadas com dieta contendo ApTI 1% apresentaram diminuição na atividade tríptica do intestino e manutenção dessa nas fezes. Larvas de A. gemmatalis alimentadas em dieta contendo ApTI 0,5% mostraram diminuição da atividade tríptica do intestino e das fezes. Estes resultados sugerem que ApTI possui efeitos anti-metabólicos quando ingeridos por A. kuehniella e A.gemmatalis. / Abstract: Seeds are a major source of proteinases inhibitors, which cause nutrition quality damage and reduce the absorption and digestibility of proteins. In this study, a trypsin inhibitor (ApTI) was purified from Adenanthera pavonina seeds and their effect on growth and development tested in two Lepidoptera. Anagasta kuehniella larvae were fed with ApTI 1% showing a significant decrease in survival and larval weight (50%). A. gemmatalis fed with 0.5% ApTI showed a survival of 31% and decrease in weight of 22%, when compared with the control group. Larval and pupal developmental time of Anagasta kuehniella larvae, fed on an ApTI diet at 1% was significantly longer, and the percentage of surviving adults decreased. The nutritional effect of ApTI on A. kuehniella larval development was to decrease the conversion of ingested food (ECI) and digested food (ECD) efficiency, and increase estimated digestibility (AD) and metabolic cost (CM). ApTI had no effect on A. gemmatalis conversion of ingested food efficiency. However, a decrease in the conversion of digested food efficiency (ECD) and increase in estimated digestibility (AD) and metabolic cost (CM) were observed. Enzymatic assays and electrophoreses were performed in order to evaluate the in vivo ApTI effect of larval intestinal proteinase activities between those that were not fed with the inhibitor and those fed with inhibitor (0.25 - 1%). A. kuehniella four instars larvae fed with 1% ApTI showed a reduction in intestinal tryptic activity and maintenance of feces tryptic activity. A. gemmatalis fed with 0.5% ApTI suffered a reduction in intestinal and feces tryptic activities. These results suggest that ApTI presents considerable anti-metabolic effects in A. kuehniella and A. gemmatalis. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A planta Calotropis procera pertencente à famÃlia Asclepiadaceae à encontrada em vasta extensÃo do Nordeste Brasileiro. à uma planta laticÃfera e sua produÃÃo endÃgena de lÃtex à extraordinÃria. Embora haja na literatura cientÃfica diversas publicaÃÃes que relatam o potencial medicinal de diversas partes da planta, principalmente de seu lÃtex, nÃo hà ainda uma abordagem bioquÃmica e funcional de seu fluido laticÃfero. Esta pesquisa foi desenvolvida no sentido de proceder a um estudo bioquÃmico parcial de atividades endÃgenas da fraÃÃo protÃica majoritÃria do lÃtex e de avaliar seus efeitos inseticidas sobre diferentes modelos de pragas agrÃcolas. A fraÃÃo protÃica majoritÃria do lÃtex foi preparada a partir de um protocolo previamente desenvolvido no laboratÃrio em que sÃo envolvidas etapas de centrifugaÃÃo e diÃlise. A fraÃÃo protÃica isenta de borracha e de molÃculas de baixa massa molecular foi testada para atividades enzimÃticas endÃgenas proteolÃticas, quitinÃsicas e a-amilÃsica e atividades inibitÃrias para proteases e a-amilase. Ensaios enzimÃticos de digestÃo das proteÃnas do lÃtex por extratos digestivos de insetos foram tambÃm realizados. Bioensaios utilizando-se dietas artificiais contendo diferentes proporÃÃes das proteÃnas do lÃtex Ãntegras, digeridas por pronase ou aquecidas a 98 ÂC foram realizados com seis insetos pertencentes a quatro ordens. Nos bioensaios foram avaliados parÃmetros tais como desenvolvimento, sobrevivÃncia, tempo de emergÃncia dos indivÃduos alÃm de ser avaliado o efeito cumulativo de proteÃnas do lÃtex na dieta por sucessivas geraÃÃes. Na fraÃÃo protÃica do lÃtex foram encontradas atividades proteolÃticas do tipo cisteÃnica e serÃnica, alÃm de atividade quitinolÃtica. NÃo foi detectada atividade a-amilÃsica. SoluÃÃes de proteÃnas do lÃtex nÃo exibiram atividade inibitÃria do tipo a-amilÃsica e tripsÃnica ou quimiotripsÃnica. ApÃs tratamento tÃrmico, proteÃnas do lÃtex ainda solÃveis foram capazes de inibir a atividade da papaÃna. Posteriormente esta atividade inibitÃria foi capaz de inibir as atividades proteolÃticas de Callosobruchus maculatus e Dysdercus peruvianus. As proteÃnas do lÃtex foram inseticidas para C. maculatus, Zabrotes subfasciatus, Anticarsia gemmatalis e Ceratitis capitata enquanto que nÃo foram para Spodoptera frugiperda e D. peruvianus. NÃo houve efeito deletÃrio acumulativo em insetos submetidos a uma dieta contendo proteÃnas do lÃtex durante seis geraÃÃes. Quando digeridas por pronase e aquecidas por 30 min a 98 ÂC, a aÃÃo inseticida das proteÃnas do lÃtex ainda foi mantida sobre o C. maculatus. As proteÃnas do lÃtex foram completamente resistentes à proteÃlise por enzimas digestivas de Dysdercus peruvianus e Callosobruchus maculatus. Entretanto, a aÃÃo proteolÃtica endÃgena do lÃtex promoveu a proteÃlise do extrato enzimÃtico de C. maculatus embora isto nÃo tenha ocorrido no extrato intestinal de D. peruvianus. O lÃtex de C. procera apresenta forte atividade proteolÃtica e resistÃncia à proteÃlise por enzimas digestivas de insetos. Atividade quitinolÃtica foi tambÃm observada. O lÃtex possui atividade inseticida para diferentes pragas agrÃcolas e esta atividade parece estar associada à presenÃa de um inibidor de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica, alÃm da presenÃa de quitinases e elevada atividade proteolÃtica endÃgena. Assim, a fraÃÃo protÃica do lÃtex pode ser considera como parte constituinte da defesa da planta contra insetos. / The plant Calotropis procera belonging to Asclepiadaceae is found around a vast extension of the Northeast from Brazil. It is a lactifers plant and its endogenous production of latex is admirable. Despite continuous reports appearing in the literature give mention to the medicinal properties of different parts of the plant, including the latex, there is not scientific approaches comprising biochemical of functional aspects of the latex from C. procera. The aims this work was determine the presence of endogenous enzymatic activities and inhibitory activity against different proteases and a-amylase, to evaluate insecticidal properties against different crop pests and to correlate enzymatic content and insecticidal action with possible role of the latex in protecting the plant to insect pathogens. The major soluble protein fraction from the latex was prepared following the protocol previously defined that includes centrifugations and dialysis steps. The protein fraction devoided of rubber and low molecular mass molecules was assayed to the presence of endogenous proteolytic activities as well as a-amylase activity. Even, the presence of inhibitor of such activities was investigated. Additionally the latex proteins were submitted to proteolysis by digestive content of different insects. Bioassays base on artificial diets with different contents of native, pronase digested or heated treated (98 ÂC) latex proteins were performed against six insects belonging to 4 different orders. Increment in bodyweight of larvae, time of development and percentage of survive were the parameters considered to analyze detrimental effects of latex proteins upon insects. The effect of latex proteins upon Callosbruchus maculatus insects by continuous exposure until F-6 generation was reached was performed. It was found strong endogenous proteolytic activity and latex proteins were resistent to proteolysis by insect digestive extracts. In addition chitinolytic activity was also detected. The latex exhibited insecticidal activity against different insect groups and this effect may be correlated to the presence of a cysteine protease inhibitor associated to its proteolytic properties and chitinolytic activity. It is suggested that the protein fraction of the latex from Calotropis procera plays a relevant role in defending the plant against pathogens.