Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289632.pdf: 1916144 bytes, checksum: 67af3bb6cca1c4c3c30dc049f92d0a4b (MD5) / O vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) causa uma doença progressiva em camarões de cultivo com substanciais perdas econômicas no Brasil e na Indonésia. Métodos imunológicos simples e rápidos para a detecção do IMNV ainda não são disponíveis devido à falta de anticorpos monoclonais (AcMo) contra o vírus. Neste trabalho, dois fragmentos do gene da proteína do capsídeo do IMNV, abrangendo os aminoácidos 105-297 (IMNV105-297) e 300-527 (IMNV300-527), foram clonados e expressos em Escherichia coli. Ambas sequências nucleotídicas e aminoacídicas deduzidas de IMNV105-297 e IMNV300-527 apresentaram elevada identidade com sequências de IMNV isolados no Brasil (99%) e na Indonésia (98%). Dentre os hibridomas que foram obtidos, seis AcMo anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) e dez AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) foram selecionados para se avaliar suas reatividades contra a proteína do capsídeo viral presente em lisado de camarões infectados por IMNV. Nos ensaios de imunodot-blot, cinco AcMo anti-rIMNV105-297 e oito AcMo anti-rIMNV300-527 apresentaram distintas sensibilidades contra lisados de tecido muscular infectado por IMNV, bem como contra rMNV105-297 ou rIMNV300-527. Dentre esses, três AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) e cinco AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstraram alta especificidade contra a proteína nativa do IMNV nos ensaios de Western-blot, visto que reconheceram somente uma proteína de 100 kDa - massa esperada para a proteína do capsídeo do IMNV. Nas imunohistoquímicas, dois AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) e quatro AcMo anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) ligaram-se a inclusões virais presentes em fibrose muscular e em áreas de necrose coagulativa. Concluindo, esses seis AcMo foram sensíveis e específicos em todos os imunoensaios realizados e poderão ser utilizados em testes de imunodiagnóstico de rotina para prevenção e controle da disseminação do IMNV. / Infectious myonecrosis virus (IMNV) has been causing a progressive disease in farm-reared shrimp with substantial economical loses in northeastern Brazil and Indonesia. Simple and rapid immunological methods for IMNV detection are not yet available due to the lack of monoclonal antibodies (MAbs) against the virus. In this report, two fragments of the IMNV major capsid protein gene, comprising amino acids 105-297 (IMNV105-297) and 300-527 (IMNV300-527), were cloned and expressed in Escherichia coli. Both nucleotide and deduced amino acid sequences of IMNV105-297 and IMNV300-527 displayed high identity to IMNV isolated from Brazil (99%) and Indonesia (98%). Among several clones secreting antibodies against the IMNV recombinant proteins, six MAbs anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) and ten MAbs anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) were selected to evaluate their reactivity against the native IMNV capsid protein from IMNV-infected shrimp. In immunodot-blot, five MAbs anti-rIMNV105-297 and eight MAbs anti-rIMNV300-527 presented distinct levels of sensitivities against IMNV-infected muscle tissue homogenate and against rIMNV105-297 or rIMNV300-527. From those, three MAbs anti-IMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) and five MAbs anti-IMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstrated high specificity against the native IMNV protein in Western-blot, since they only recognized a 100 kDa protein - the predicted mass of IMNV capsid protein. In immunohistochemistry, two MAbs anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) and four MAbs anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) bound to viral inclusions present in muscle fibrosis and coagulative necrosis areas. In conclusion, these six MAbs were sensitive and specific in all immunoassays performed herein, and can be used in routine immunodiagnostic tests to prevent and control IMNV dissemination.

Introdução: Desde a introdução do exame citológico cervical, em forma de programa de rastreamento populacional, que a morbidade e a mortalidade do câncer da cérvice vêm decrescendo. Considerado hoje como medida fortemente recomendada para mulheres sexualmente ativas, mostra desapontadoras sensibilidades médias no diagnóstico de alterações neoplásicas ou pré-neoplásicas cervicais. Justificativa: Dentre as várias alternativas diagnósticas em cérvice, o uso de anticorpos monoclonais no exame citológico cervical, como o anti-p16ink4a, vêm se mostrando útil no incremento da sensibilidade diagnóstica. Entretanto há carência de estudos utilizando o anticorpo em citologias coletadas na forma convencional (não meio-líquido) e associadas ao exame padrão-ouro cervical (biópsia dirigida por colposcopia). Objetivos: Avaliar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo do anticorpo anti-p16ink4a em citologia cervical coletada na forma convencional. Avaliar a variação inter-observador na leitura das lâminas de citologia coradas com o anticorpo. Método: Estudo de casos e controles realizado em ambulatório de patologia cervical. As lâminas de citologia, para imunocitoquímica com o anticorpo, foram coletadas com espátula de Ayre e escova tipo cytobrush. A leitura das lâminas foi realizada por dois patologistas independentes (P1 e P2). Foram considerados casos (n=61), as investigações cervicais que resultaram em biópsia diagnóstica compatível com lesão intra-epitelial de baixo grau (NIC 1), alto grau (NIC 2/3) ou carcinoma (CA). Foram considerados controles (n=87), as investigações que contavam com colposcopia normal e citologia, corada pelo método de Papanicolaou, negativas. Resultados: A sensibilidade para o diagnóstico das NIC 2/3 (n=23) foi de 100% (P1) e 95,7% (P2). Já o valor preditivo negativo nos diagnósticos de NIC 2 ou pior foi de 100 (P1) e 98,9 (P2). Nos dois casos de carcinoma epidermóide, a sensibilidade foi de 100% para ambos patologistas. A sensibilidade para o diagnóstico das NIC1 foi de 77,8% (P1) e 58,3% (P2). O valor preditivo negativo entre as NIC1 foi de 90,6 (P1) e 82,0 (P2). O índice kappa entre os dois patologistas foi de 0,74. Entre os casos de NIC 2/3 associado à positividade nuclear ao anticorpo, a diferença percentual entre os patologistas foi inferior a 5%; mesmo escore encontrado entre os casos de ausência de lesão cervical e negatividade para o anticorpo. Já entre as portadoras de NIC1, houve maior variação inter-observador. Conclusões: Os resultados apresentados apontam o anticorpo anti-p16ink4a como auxiliar no rastreamento de lesões precursoras ou neoplásicas em citologia cervical. / Introduction: Since the cytological cervical testing was introduced as a populational screening program, cervical cancer morbity and mortality has decreased. Nowadays it is considered to be a strongly recommended screening test for the diagnosis of neoplastic abnormalities or cervical pre-neoplastic lesions. Justification: Among the various alternatives for the diagnosis of cervical cancer, the use of monoclonal antibodies in the cytological cervical test, such as the antibody anti-p16ink4a, has shown increase the sensitivity of the cytological examination. However, there is a lack of studies using the monoclonal antibody in cervical cytology linked to the histological examination of the uterine cervix. Objectives: To evaluate sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the anti-p16ink4a in conventional sampled cervical cytology. To evaluate the inter-observer variation in reading of slides marked with the antibody. Method: A case-control study was carried out in a cervical pathology reference center. The cytology slides, submitted to the immunocytochemistry for the diagnostic antibody, were conventionally sampled with Ayre´s spatula and Cytobrush. The slides were read by two independent pathologists (P1 and P2). Cases (n=61) were all cervical investigations that had resulted in compatible diagnostic biopsy with CIN 1, CIN 2/3 or carcinoma. Controls (n=87), included all investigations presenting Papanicolaou cytology and colposcopy negative. Results: Sensitivity for the histological diagnosis of CIN 2/3 (n=23) was 100% and 95.7% for P1 and P2, respectively. The negative predictive value on the CIN 2/3 was 100% (P1) and 98.6% (P2). In two cases of squamous carcinoma, sensitivity was 100%, for both pathologists. Sensitivity for the diagnosis of CIN 1 was 77.8% (P1) and 58.3% (P2). The negative predictive value for CIN 1 was 90.6% (P1) and 83% (P2). The kappa index between the two pathologists was 0.74. Among the cases of CIN 2/3 associating the nuclear positivity to the antibody, the difference between pathologists was inferior to 5%. Exactly the 9 same scores were found among cases of absence of cervical lesion and negativity for the antibody. On the other hand in CIN 1 patients there was a greater inter-observer variation. Conclusions: Our results suggest that the antibody anti-p16ink4a could contribute as an adjuvant tool in the screenig of pre-neoplastic and neoplastic lesions in conventional sampled cervical cytology.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Objetivo: Estabelecer o diagnóstico laboratorial da leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia aguda indiferenciada (LAI) e leucemia aguda bifenotípica (LAB), através de um estudo prospectivo, observacional e descritivo de 62 pacientes atendidos consecutivamente na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas – FHEMOAM, no período de Setembro de 2000 a Setembro de 2003, avaliar a freqüência, características clínicas e laboratoriais com a finalidade de permitir um diagnóstico mais preciso com conseqüente melhor escolha terapêutica. Método: A classificação da LMA foi realizada utilizando os critérios morfológicos do grupo cooperativo franco-americano-britânico (FAB). Estudos imunológicos foram realizados utilizando a técnica imunoenzimática EnVision System Alkaline Phosphatase (DAKO), que permite identificar a reação nas células leucêmicas em esfregaços de medula óssea e/ou sangue periférico e em preparados de citocentrífugas (spins), com a utilização de um amplo painel de anticorpos monoclonais. Os subtipos FAB de LMA foram analisados em relação a características clínicas idade (crianças e adultos), sexo, linfonodomegalias (>2cm), esplenomegalia (≥3cm), dados laboratoriais (níveis de hemoglobina, contagem de glóbulos brancos e plaquetas, características morfológicas, citoquímicas e perfil imunofenotípico dos blastos). Resultados: A LMA ocorreu em 62 pacientes sendo 25 crianças (40,3%, idade mediana de 6 anos e 9 meses) e 37 adultos (59,7%, com idade mediana de 30 anos); houve predomínio do sexo masculino (41 pacientes - 66% dos casos). A distribuição dos casos de acordo com os subtipos FAB foi 1 caso M0, 12 M1(19%), 15 M2(24%), 8 M3(13%), 6 M4 (10%), 15 M5 (24%), 1 M6 e 4M7(6%). Entre as crianças M2 foi o tipo mais comum (32%) e entre os adultos a LMA M5 (27%). Os antígenos mielóides mais freqüentes foram CD13, CD33 e anti– MPO. A LAI ocorreu em 3 pacientes e a LAB em 1 paciente. Conclusão: Neste trabalho, observamos algumas diferenças em relação a estudos nacionais e internacionais como a faixa etária mais baixa e a menor freqüência da LMA M3 entre nossos pacientes. A classificação FAB é ainda de grande importância no diagnóstico da LMA, porém a contribuição dos dados da imunofenotipagem é fundamental na classificação da LMA subtipo M0 e M7, assim como na caracterização da leucemia aguda indiferenciada e bifenotípica. / Objective: The present study investigated the best laboratorial diagnosis methods to acute myeloid leukemia, acute undifferentiated leukemia and biphenotypic acute leukemia. We have prospective, observacional and descriptive study about 62 patients from Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas - FHEMOAM, in the period of September of 2000 at June of 2003. The frequency, clinical and laboratories characteristics was analyzed. .Methods: The classification of the acute myeloid leukemia – LMA was stablished by morphological and cytochemical criteria according by the French-American-British (FAB) classification and immunologic aspects using the imunoenzymatic technique from DAKO - EnVision System Alkaline Phosphatase, that allows to identify to leukemia subgroups in bone marrow smears and/or peripheral blood and in cytospins, with a large monoclonal antibody panel. The LMA subtypes had been analyzed according age (children and adults), sex, morphologic and cytochemistry characteristics, immunophenotipic profile, lymph node and a variety of organs masses occurrence (lymph node ≥ 2 cm, spleen and liver ≥ 3 cm), laboratories findings as leucocytes and platelets counts, hemoglobin, countings. Results: We observed that the LMA occurred in 62 patients, being 25 children (40,3%) and 37 adults (60%); with predominance of the masculine sex happening in 66% of the cases (41 patients). The most common subtypes had been the LMA M2 in children and LMA M5, in adults; the phenotype more common had been CD13, CD33 and anti – MPO myeloid antigens. Auer’rod occurred in 26 cases (42%) and the more frequent laboratories findings had been leucocyte and platelets accounts below of 100.000/mm3 and hemoglobin below of 10g/dl. Limph node with more than 2 cm of diameter, spleen and liver with size bigger than 3 cm was observed in less than half of cases. The LAI was observed in 3 patients and the LAB in only 1 patient. Conclusion: The results indicate that FAB classification was very important at LMA diagnostic, however immunophenotyping has a strong importance in the M0 and M7 subtype of LMA classification, as well as in the characterization of the undifferentiated and biphenotypic acute leukemia. In this work, we observed some differences between data of the northeast region and Southeastern of Brazil as the frequency of the LMA M3 lower between our patients. In order hand, in our region we observed that LMA occurs in more young patients in relation to described in literature about other countries / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Resumo não disponível.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 12/12/2016 / Inclui referências : f. 65-70 / Resumo: A ubiquitinação está envolvida em vários processos no organismo, desde ciclo celular até vias de sinalização de apoptose. Por esse amplo envolvimento, é de extrema importância uma fina regulação que é realizada por enzimas chamadas deubiquitinases (DUBs) que hidrolisam ligações isopeptídicas. Dentre todas as DUBs, USP é a família mais extensa tendo como membro USP2 que possui duas isoformas fruto de processamento alternativo: USP2a (de 69kDa) e USP2b (de 45kDa) que se diferenciam apenas na região N-terminal. Alguns estudos relacionam essas isoformas com a via da p53, miogênese, tumores de próstata, agressividade de tumores de mama e manutenção dos níveis de Na+ e pressão sanguínea. Apesar desses estudos, a distribuição tecidual da USP2 ainda não está completamente estabelecida. A presença de duas isoformas distintas de processamento e a inexistência de anticorpos comerciais que possam distinguir entre as duas isoformas justifica a produção de reagentes confiáveis para o estudo de USP2. Desde modo, o objetivo foi produzir anticorpo monoclonal, isoforma específico, para USP2a e clonar, produzir proteína recombinante em bactérias e superexpressar USP2b em células eucariontes. USP2a foi produzida em E. coli BL21(DE3)STAR fusionada com etiqueta de histidina e purificada por coluna de Ni-NTA. A proteína purificada foi usada para imunizar camundongos balb/c. O soro policlonal desses animais foi testado por western blot para a presença de anticorpo anti-USP2a quanto ao reconhecimento da proteína endógena e superexpressa em linhagens de próstata LNCaP e RWPE-1 tendo dois animais positivos usados para a fusão com mieloma. Os hibridomas após a diluição limitante foram varridos por ELISA chegando-se a um clone 4GD2 que reconheceu USP2a superexpressa em HEK293T e não reconheceu USP2b superexpressa em HEK293T, indicando que obteve-se sucesso na produção de um anticorpo monoclonal isoforma específico para USP2a. Além disso, a isoforma USP2b foi clonada com sucesso nos vetores pET28a(+) e pcDNA3.1(-)6his. Esta isoforma não foi expressa em E. coli mesmo com várias mudanças no sistema, desde cepa bacteriana até temperatura, meio e tempo de expressão, mas foi superexpressa em HEK293T. As ferramentas produzidas serão de extrema importância para estudos de mapeamento tecidual, análise de cinética e busca de novos parceiros moleculares para essas isoformas. Palavras-chave: USP2, USP2a, USP2b, anticorpo monoclonal, proteína recombinante. / Abstract: Several physiological processes involve ubiquitylating modification, from cell cycle to apoptosis pathways. Because this involvement has a large range, it is extremely important that this post-translational modification be tightly regulated. Enzymes called deubiquitinases (DUBs) hydrolyze isopeptide bond and have a pivotal role in this regulation. Among all DUBs, the USP is the largest family. USP2, a member of this family, has two isoforms from alternative splicing: USP2a (69kDa) and USP2b (45kDa) and differences rely within their N-terminal regions. These isoforms have related to p53 pathway, myogenesis, prostate tumors, breast tumors aggressiveness and maintenance of Na+ levels and blood pressure. Despite these studies, the tissue distribution of USP2 is not completely established. Absences of commercial antibody that recognize specific isoforms justify the production of reliable reagents to study USP2. Thus, the aims of this study were (1) to express both USP2a and USP2b in heterologous bacterial system; (2) to overexpress USP2b in mammalian cells and (3) to produce monoclonal antibodies specific to USP2a isoform. USP2a was produced in E. coli BL21(DE3)STAR fused with polyhistidine tag and purified by Ni-NTA column. The purified protein was used to immunize Balb/c mice strain. We have tested the polyclonal serum of these animals by western blot to the presence of antibody anti-USP2a that recognize endogenous and overexpressed protein in prostate line LNCaP and RWPE-1. Two animals were positive and employed in fusion procedures. After hybridoma supernatant screenings for anti-USP2a presence by ELISA, we isolated the clone 4GD2, which was stable and still secreting antibodies after several freeze-thaw cycles. Monoclonal antibody 4GD2 recognizes USP2a overexpressed in HEK293T cells and does not cross-react with USP2b, suggesting that MoAb 4GD2 is highly specific. In addition, USP2b was successfully cloned in pET28a(+) and pcDNA3.1(-)6his vectors, both expression vectors for prokaryotic and eukaryotic systems, respectively. We were not able to express successfully USP2b in E. coli under different protocols (e.g. temperature, medium and time parameters changes), however we expressed His-tagged USP2b in HEK293T cells. The produced tools will be extremely important in further studies, such as tissue and temporal USP2 expression mapping, USP2 expression and disappearing kinetics in cell lines and characterization of new molecular partners for this DUB. Key words: USP2, USP2a, USP2b, monoclonal antibody and recombinant protein.

Orientadora : Profª Drª Larissa M. Alvarenga / Coorientadoras : Profª Drª Adriana Oliveira Costa e Profª Drª Juliana F. de Moura / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 20/03/2012 / Inclui referências : f. 56-68 / Área de concentração: Patologia / Resumo: As amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba encontram-se amplamente distribuídas na natureza e são consideradas organismos potencialmente patogênicos. Ocasionalmente podem desencadear infecções humanas, como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite amebiana. A investigação de características diferenciais entre as linhagens patogênicas e aquelas não associadas à infecção pode auxiliar a determinar fatores relacionados à patogenicidade e desenvolvimento de testes de diagnóstico. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente, por meio de critérios fisiológicos, morfológicos e imunoquímicos, amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba. Trofozoítos de quatro isolados foram utilizados: uma amostra clínica, obtida de caso de ceratite amebiana, outra amostra ambiental, obtida da poeira da residência do mesmo paciente, e outras duas amostras de referência A. poliphaga #2, de ceratite amebiana (ATCC 30641) e A. poliphaga #4, de água de um lago (ATCC 30782). Os quatro isolados foram cultivados axenicamente em meio PYG (proteose-peptona, extrato de levedo e glicose) usados para análise por microscopia eletrônica de varredura e submetidos individualmente à lise em ultra-som para obtenção de extrato protéico bruto. Os extratos foram utilizados para determinação do perfil protéico por eletroforese e na imunização de camundongos para produção anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos produzidos foram caracterizados por ELISA, Western Blotting e imunofluorescência. A análise do perfil protéico apresentou distinções quanto à presença e expressão de algumas proteínas entre os isolados. Os resultados obtidos com os anticorpos policlonais sugerem a presença de proteínas específicas para cada uma das amostras estudadas, além de um perfil imunoquímico com anticorpos co-reativos para componentes conservados. Dez clones de anticorpos monoclonais foram obtidos, dos quais o mAb3 reconhece proteínas de três das quatro amostras estudadas. O conhecimento adquirido com a realização desse trabalho poderá ser empregado na padronização de novos critérios para identificação e caracterização de linhagens desse gênero. Além disso, permitirá que proteínas previamente caracterizadas imunoquimicamente possam ser utilizadas como marcadores de patogenicidade. Palavras - chaves: Acanthamoeba, ceratite amebiana, perfil protéico, anticorpos policlonais e monoclonais, patogenicidade. / Abstract: The free-living amoebae of the genus Acanthamoeba are widely distributed in nature and are considered potentially pathogenic organisms. Occasionally they can trigger human infections such as granulomatous amoebic encephalitis and amoebic keratitis. The investigation of differentiating characteristics between pathogenic strains and those not associated with infection may help to determine factors related to pathogenicity and the development of diagnostic tests. In this sense, the aim of this study was to perform a comparative evaluation; by means of physiological, morphological and immunochemical criteria; between clinical and environmental samples of Acanthamoeba. Trophozoites of four isolates were used: a clinical sample, obtained from a confirmed case of amoebic keratitis; an environmental sample, obtained from the dust of the residence of the same patient; and two reference samples A. poliphaga #2, obtained from an amoebic keratitis (ATCC 30641) and A. poliphaga #4, obtained from the water of a lake (ATCC 30782). The four isolates were axenically grown in PYG (proteose-peptone, yeast extract and glucose), used for analysis by scanning electron microscopy and individually submitted to lysis by ultrasound to obtain a crude protein extract. The extracts were used to determine the protein profile by electrophoresis and were used for the immunization of mice to produce polyclonal and monoclonal antibodies. The antibodies produced were characterized by ELISA, Western Blotting and Immunofluorescence. The analysis of the protein profile presented distinctions about the presence and expression of some proteins among the isolates. The results obtained with polyclonal antibodies suggest the presence of specific proteins for each of the studied samples, besides an immunochemical profile with co-reactive antibodies to conserved components. Ten clones of monoclonal antibodies were obtained, from which mAb3 recognizes three of the four samples studied. The knowledge acquired from the development of this work may be employed at the standardization of new criteria for identification and characterization of strains from this genus. Furthermore, it can enable that previously immunochemically characterized proteins could be used as markers for pathogenicity. Keywords: Acanthamoeba, amebic keratitis, protein profile, polyclonal and monoclonal antibodies, pathogenicity.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-05Bitstream added on 2015-05-14T16:59:06Z : No. of bitstreams: 1 000826915_20151206.pdf: 375653 bytes, checksum: adf2f78838ae81a4890f0a8019e9a279 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-07T09:44:40Z: 000826915_20151206.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-07T09:45:18Z : No. of bitstreams: 1 000826915.pdf: 1970838 bytes, checksum: 21816dd741b5f8f0d7c95dc3e252725a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Rede Nanobiotec / A cisticercose bovina é uma zoonose cosmopolita e presente nos rebanhos bovinos de corte no Brasil, que ocorre em países em desenvolvimento, onde a infraestrutura sanitária inadequada e as más práticas na criação de gado permitem a contaminação de pastagem e água com fezes humanas contendo ovos do parasita. Os prejuízos financeiros decorrem da condenação ou tratamento (salga ou da congelação) das carcaças infectadas, dependendo da intensidade da infecção. O diagnóstico da cisticercose bovina é realizado durante o abate, pela inspeção das carcaças e realização de cortes em locais de predileção do parasita como a língua, masseter, coração e diafragma. Assim, a fim de promover o diagnóstico ante-mortem e permitir o tratamento adequado de animais infectados, muitos estudos foram realizados utilizando-se técnicas de detecção de anticorpos ou antígenos em amostras de soro bovino. O teste ELISA baseado em anticorpos monoclonais (MAbs) para a detecção de antígeno circulante (Ag-ELISA) tem sido estudado, mas apresenta baixa sensibilidade em animais com infecção leve, e permite a sua realização apenas em laboratórios bem equipados. O uso de biossensores em medicina tem crescido nos últimos anos, permitindo a detecção e quantificação de metabólitos, bem como o uso de diversos biopolímeros como matriz de imobilização como quitosana e fibroína da seda. Imunossensores são biossensores cuja resposta bioquímica relaciona-se à interação antígeno-anticorpo, que podem ser utilizados para detectar anticorpos ou antígenos, tendo sido utilizados no diagnóstico de enfermidades. Nesta pesquisa, desenvolveu-se o primeiro imunossensor para o diagnóstico da cisticercose bovina, com filmes produzidos camada por camada (LbL) contendo um MAb dirigido contra antígeno bruto de metacestódeos de T. saginata (TAEB) e fibroína de seda (SF), imobilizados, que mostrou-se promissor ... / Bovine cysticercosis is a cosmopolitan zoonosis and very widespread in the Brazilian beef cattle. Cysticercosis usually occurs in developing countries, where poor sanitation and bad raising cattle practices allows the contamination of the pasture and water with human feces containing eggs. The financial losses are due to condemnation or treatment (salting or freezing) of infected carcasses, depending on the intensity of infection. Diagnosis of bovine cysticercosis is routinely done during slaughter by meat inspection of carcasses and incisions in predicted sites of muscles such as tongue, masseter, heart and diaphragm. Thus, in order to promote the ante-mortem diagnosis and allow appropriate treatment of infected animals, many studies have been performed using techniques to detect antibodies or antigens in bovine serum. ELISA using monoclonal antibodies (MAbs) for the detection of circulating antigen (Ag-ELISA) has been studied, but presents low sensitivity in animals with low parasite burden, and allows its realization only in well-equipped laboratories. The use of biosensors in medicine has grown in recent years, allowing detection and quantification of numerous metabolites, such as immobilization matrix having the most diverse biopolymers such as chitosan and silk fibroin. Immunosensors are biosensors which biochemical response is related to antigen-antibody interaction and can be used to detect antibodies or antigens, and has been tested for diseases diagnosis. In this research, we developed the first immunosensor for bovine cysticercosis diagnosis, produced with layer-by-layer (LbL) films containing a monoclonal antibody against crude Taenia saginata metacestode antigens (TAEB) and silk fibroin (SF) immobilized. Immunosensor showed to be a promising tool for further application in the ante-mortem bovine cysticercosis diagnosis

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.