名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 博士(医学)(論文) 学位授与年月日:平成3年9月14日 安田公氏の博士論文として提出された

Gene expression underlies all important biological processes in a cell and mis-regulated gene expression plays a causal or contributory role in several diseases including cancers. Towards identifying molecular determinants that confer susceptibility and resistance to tumor promoter induced neoplastic transformation, we analyzed the gene expression profile differences among tumor promoter TPA treated and untreated mouse epidermal JB6 cells by means of cDNA microarray analyses. The expression patterns for several genes were validated by real time PCR analyses. Seventy-four genes belonging to six functional categories were found to be differentially expressed. Data from this study implicate pathways which mediate cell adhesion, migration and interferon signalling, tumor suppressors, apoptotic proteins and transcription factors and includes twenty-six genes whose involvement has not been previously implicated in cancer. In a second study we used a DNA affinity chromatography based assay to purify two proteins that bound specifically to the AP-1 DNA binding site. Analyses of the purified proteins by mass spectrometric sequencing determined the identities of these proteins as nucleolin and Y-box binding protein 1 (YB-1). We tested the hypothesis that these proteins regulate transactivation at the AP-1 site. Overexpression of nucleolin and YB-1, both alone or in combination, repressed AP-1 dependent gene transactivation. To understand the mechanism of transrepression, we analyzed whether nucleolin and/or YB-1 affected the levels and/or disrupted the intracellular localization of the AP-1 protein subunits. Western blot analyses of all the AP-1 subunits revealed that the levels of AP-1 were unaffected. Cell fractionation confirmed that the AP-1 levels were not altered in the nuclear or cytoplasmic compartments. We further tested the hypothesis that nucleolin and YB-1 repressed AP-1 transactivation by competing with AP-1 proteins for the AP-1 site. The results from this experiment were inconclusive and the precise mechanism of repression is currently under investigation.

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) has been celebrated as a soft ionization method for analyzing very diverse biological species including large proteins, peptides, carbohydrates, lipids and metabolites. The fact that MALDI is tolerant to salts and buffers and that it mostly produces singly charged ions from intact biomolecules is considered highly advantageous over electrospray ionization (ESI). Almost two decades after the introduction of vacuum MALDI, the technique was successfully implemented under atmospheric pressure (AP) conditions by Laiko and co-workers. Some of the most salient advantages of AP-MALDI over vacuum MALDI are its ability to generate intact ions from labile species with minimal fragmentation due to collisional cooling under AP, the ability of performing MSn experiments, and its exchangeability with other ion sources. However, AP-MALDI suffers from limited sensitivity due to low ion transmission efficiency under AP conditions. Because sensitivity is a function of the sample pretreatment method of choice, both preconcentration and selective sample fractionation can be used during the initial stages of the analytical pipeline to improve detectability. To that end, the first part of the work presented in this thesis is aimed at investigating various approaches to improve the sensitivity of AP-MALDI for mass spectrometric analysis of biomolecules. Chapter 1 reviews the history of laser desorption ionization (LDI), presenting salient features of vacuum MALDI and AP-MALDI, and concludes with a brief overview of leading ambient ionization techniques, such as Direct Analysis in Real Time (DART) ionization. Chapter 2 presents an investigation of an on chip sample preconcentration approach coupled to AP-MALDI for high-sensitivity analysis of neuropeptides extracted from Aedes aegypti mosquito heads. The theme of exploring efficient and reproducible purification methods for complex biosamples is continued in Chapter 3, where an evaluation of new on-tip solid-phase extraction (SPE) micro columns with various functional groups is presented. A second approach for enhancing AP-MALDI sensitivity by constructing a new pneumatically-assisted (PA) AP-MALDI ion source is presented in Chapter 4, where various factors affecting the performance of this device are investigated. Chapter 5 describes work involving the evaluation of DART ionization as a high-throughput method for the detection and identification of small terpene molecules central to the Aedes aegypti mosquito lifecycle.

Notch signaling is important for cell-cell signaling during development. Notch signaling is highly conserved across all metazoans and failure in Notch signaling is causative in many human diseases. In the Drosophila eye, activation of the Notch pathway requires Lqf (Drosophila Epsin)-dependent and Clathrin-dependent internalization of the Notch receptor ligands, Delta or Serrate, by the signal-sending cells. However, it is unclear why ligand must be internalized into the signal-sending cells to activate Notch signaling in the signal-receiving cells. Evidence suggests that in addition to Clathrin and Epsin, Auxilin is essential for signaling and is indirectly required for internalization of the Notch receptor ligand Delta. Auxilin functions in uncoating Clathrin-coated vesicles to maintain a pool of free Clathrin and Epsin in the cell. auxilin mutants were used as an entryway to identify previously unknown components of the Notch signaling pathway. An F1, FLP/FRT, EMS screen was performed and enhancers of an auxilin mutant rough eye defect were isolated. The enhancers ultimately formed one complementation group on the 2nd chromosome and fourteen complementation groups on the 3rd chromosome. Three of the 3rd chromosome complementation groups were each identified as Delta, lqf, or hsc70. A single allele was identified as faf. Delta and Epsin have known roles in signaling cells to activate Notch as described above. Hsc70 is an ATPase that functions with Auxilin to uncoat Clathrin-coated vesicles and Faf is a deubiquitinating enzyme that maintains levels of active Epsin in the cell. These results suggest I have isolated mutations in genes closely tied to Notch signaling or functioning directly with Auxilin. Mutations in two genes previously undescribed in Notch signaling in the developing Drosophila eye were also isolated from the screen and identified. The second chromosome complementation group was identified as α-adaptin. α-Adaptin is a subunit of the heterotetrameric Clathrin adaptor protein AP-2. One of the third chromosome complementation groups was identified as crumbs. Crumbs is an integral membrane protein that functions at adherens junctions and in establishing apical/basal polarity in cells. Characterizing roles for α-Adaptin and Crumbs during Notch signaling may elucidate the purpose for Delta internalization to activate Notch signaling. / text

The intent of this study was to determine what students perceive as caring behaviors in teachers, whether those views match teachers’ perceptions, whether these vary depending on students’ academic track, and whether teachers are observed to exhibit the behaviors identified by their students as indicative of caring. Eighty-two majority Hispanic high school students and eight teachers completed a four-section survey about caring behavior. These teachers and students were also observed four times in the classroom. The survey contained Likert scale and open-ended questions about teachers’ caring behaviors. It also probed how the students’ own teachers interacted with them daily in the classroom and their personal open-ended opinion about how teachers show that they care or do not care about them. Two groups were studied, specifically Advanced Placement (AP) and Regular students, to find out whether academic placement caused students’ to categorize caring behaviors of teachers differently. Results of the study indicated a significant difference in AP and Regular students’ attitudes about how teachers treat them. Teachers’ perceptions were also compared to students’ perception and differences were found. Differences included how often teachers interact in one-on-one conversations about certain issues with students, such as the need to complete homework assignments. Within these conversations some issues were reported to occur more frequently by teachers than students. On other issues, like disrupting class, there was agreement, but only for specific teachers and subjects. In addition, STEM and non-STEM classes were investigated and it was discovered that these students responded differently about the frequency with which their teachers had conversations with them about specific issues. Differences included disrupting class, not completing assignments, interests and things that are important to students, and plans for college and work. Observations made by this researcher further support the idea that there is similarity in how students define caring behaviors, but what behaviors they experience, like assisting in homework or listening to personal needs, is different. Although trends observed in this study are suggestive, more research is required to support the idea that academic placement and subject make a difference in students’ experiences of caring behaviors in teachers. / text

published_or_final_version / Architecture / Master / Master of Architecture

Les plantes sont exposées, à chaque étape de leur cycle de vie, à différents stress abiotiques notamment la sécheresse, le froid et la salinité. Bien que ces différents types de stress aient des effets spécifiques pour chacun d'entre eux, ils ont tous la capacité d'induire un effet commun soit le déficit hydrique qui affecte la croissance et le développement des plantes. Certaines plantes s'adaptent au déficit hydrique en modifiant leurs métabolismes ainsi que l'expression de leurs gènes afin de synchroniser leur développement avec les conditions de stress. Cette modification se traduit par la synthèse de nouvelles protéines, particulièrement régulée par le déficit hydrique, notamment les protéines de type Ap2/EREBP. Chez Arabidopsis thaliana, ces protéines forment une famille de facteurs de transcription de 145 membres. Certains membres jouent des rôles essentiels de régulateur dans plusieurs processus de développement tandis que d'autres sont impliqués dans les mécanismes de réponses des plantes aux stress. Chez les céréales, très peu de gènes Ap2/EREBP avec des fonctions connues ont été identifiés. Ce projet de recherche vise à identifier cette famille de gènes chez le blé hexaploid (Triticum aestivum L.). Le choix de ce type de blé comme modèle d'étude réside dans sa capacité de tolérance au gel et sa grande variabilité de réponses aux stress abiotiques. Le blé est la céréale la plus importante au monde puisqu'il représente environ 73% de la production céréalière mondiale. Il est cultivé dans divers types d'environnements climatiques, de productions et de fermes. De plus, il représente la principale source d'énergie alimentaire, d'emploi et de revenu dans plusieurs pays en voie de développement. Le blé agronomique est plus nutritif et économique qu'Arabidopsis. Cependant, le choix entre les deux espèces est influencé par la taille et la complexité de leurs génomes. Le premier chapitre décrit l'identification, la phylogénie et la localisation chromosomique des gènes Ap2/EREBP du blé. Une approche génomique combinant une recherche de bases de données de séquences suivie d'une analyse bioinformatique, un criblage de banques d'ADNc et des amplifications par réaction de polymérisation en chaîne a permis d'identifier 107 ADNc du blé qui codent potentiellement pour des facteurs de transcription de type Ap2/EREBP. Leur localisation chromosomique montre que ces gènes sont dispersés sur tout le génome du blé. Cependant, quelques gènes de cette famille, appelés CBFs (C-repeat Binding Factors), sont regroupés principalement sur le long bras du groupe de chromosomes 5 et ont été associés directement à des déterminants génétiques (QTLs) contrôlant les réponses aux stress et divers aspects du développement floral. Le deuxième chapitre présente la caractérisation de la sous-famille de gènes CBFs. L'analyse phylogénétique a indiqué que les espèces de blé contiennent au moins 23 gènes différents de type CBF. Chez les Poaceae, les CBFs sont classés dans 10 groupes qui partagent une origine phylogénétique commune et des caractéristiques structurales semblables. Six de ces groupes (3C, 3D, 4A, 4B, 4C et 4D) sont trouvés seulement chez les Pooideae, suggérant ainsi qu'ils représentent les mécanismes de réponse de CBF qui ont évolué récemment pendant la colonisation des habitats tempérés. Les études menées sur le profil d'expression de ces gènes démontrent que 5 des groupes spécifiques aux Pooideae montrent une expression constitutive élevée et une expression inductible par les basses températures chez le cultivar d'hiver. Par contre à des températures modérées, la régulation de l'expression varie en fonction de la période de la journée. L'expression inductible et non héritée au sein des groupes de CBF a possiblement joué un rôle prédominant dans l'aptitude des cultivars d'hiver à tolérer les basses températures et elle est probablement à la base de la variabilité génétique de la tolérance au gel chez les Pooideae. Le troisième article décrit l'identification de deux gènes chez le blé, ICE1-like (Inducteur de l'expression de CBF 1) codant pour un facteur de transcription qui régule l'expression des gènes CBF. TaICE87 et TaICE41 codent pour un activateur de transcription de type MYC-like bHLH. TaICE87 et TaICE41 se lient spécifiquement à différentes séquences de reconnaissance MYC du promoteur de TaCBFIVd-B9. TaICE87 and TaICE41 sont constitutivement exprimés chez le blé et leur surexpression chez Arabidopsis mène à l'augmentation du niveau d'expression des gènes AtCOR et AtCBF3 et de la tolérance des plantes au gel. Ces résultats suggèrent que TaICE87 and TaICE41 sont des orthologues fonctionnels d'AtICE1 et peuvent réguler la transcription d'AtCBF3. La structure complexe des éléments MYC au niveau des promoteurs CBF et la différence d'affinité entre TalCE87 et TalCE41 pour les éléments MYC suggèrent que ces 2 protéines peuvent différentiellement activer CBF chez le blé. En résumé, le clonage de la famille de gènes Ap2/EREBP chez le blé a permis d'identifier et de caractériser les membres CBF régulés par les basses températures. De plus, les résultats de cette étude démontrent que l'expression des gènes CBF est amplifiée chez les Pooideae, suggérant ainsi un rôle plausible dans la tolérance au froid des cultivars d'hiver. L'analyse des gènes CBFs pourrait nous conduire à améliorer la tolérance au gel chez le blé, et par conséquent faciliter l'établissement de nouvelles stratégies visant à améliorer la productivité des céréales et leur adaptation aux changements climatiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Blé, Acclimatation au froid, Tolérance au gel, Facteurs de transcription, Ap2/EREBP.

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base. / Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are a form of highly mutagenic DNA damage that arise either spontaneously or by a variety of DNA damaging agents. To preserve genomic stability two AP endonuclease families, endo-IV and exo-III, evolved to counteract the mutagenic effect of AP sites. While members of both families were identified in multiple unicellular organisms, notably E. coli and S. cerevisiae, no members of the endo-IV family were identified in multicellular ones, with the exception of C. elegans and its close relatives, particularly C. briggsae. We set out to investigate the biological importance of APN-1 in C. elegans using gene knockdown approach. In our study, we showed that the knockdown of C. elegans apn-1 gene, using RNAi causes the accumulation of spontaneous and drug induced mutations, resulting in a delay in egg hatching, decreased survival and longevity. Furthermore, we have showed that the accumulated mutations lead to delays in cell cycle progression during early embryogenesis, thus providing a possible explanation for the observed delay in hatching. Although we showed increased mutations in the gut of the worm, we were unable to confirm APN-1 distribution tagged with GFP. The transgenic APN-1-GFP animal did not express enough of this fusion protein to be visualized by fluorescent microscopy, although it was detected by Western blot analysis. The transgenic animals over-expressing APN-1-GFP were unstable and showed phenotypes consistent with genetic defects. In conclusion, it would seem that C. elegans has evolved to retain a balanced level of APN-1, which plays a versatile role in maintaining genetic integrity, since this organism lacks a full complement of the enzymes in the base-excision repair pathway.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Syfte: Uppsatsens syfte är att undersöka hur den kris, som uppdagades i samband med tv-programmet Uppdrag gransknings inslag om fastighetsbolaget Norrporten, hanterades och kommunicerades externt. Metod: I studien har en metodtriangulering utförts genom att kombinera kvalitativ informantintervju, som utfördes med Norrportens informationschef, med kvalitativa textanalyser av de pressmeddelanden som publicerats i samband med krisen. Resultat: Studien visar att krishanteringen och kriskommunikationen fungerade bäst i fasen efter krisen. Krisarbetet före krisen bestod av förebyggande och förberedande aktiviteter såsom omvärldsbevakning, identifiering och att förekomma medier.Medarbetare, kunder och allmänheten informerades. Totalt publicerades tre pressmeddelanden som i huvudsak förnekar och hävdar företagets oskuld till den information som framkommit i Uppdrag granskning.Krisarbetet under krisen består av att kommunicera och vidta åtgärder. Regelverk tillsätts och omstruktureringar i företagets styrelse sker. Tre pressmeddelanden publiceras, varav ett av dem på Andra AP-fondens hemsida. Norrporten informerar om åtgärder som skall vidtas medan Andra AP- fonden ber om ursäkt, kritiserar och lovar förändring.Krisarbetet efter krisen består av att implementera de åtgärder man vidtagit och att informera allmänheten om dem. Under den här fasen finns ett stort fokus på attförmedla företagets nya ledord som handlar om måttfullhet. Man kommunicerar genom en kombination av kommunikationskanaler. Totalt publiceras tre pressmeddelanden.