As hiperhomocisteinemias (HHcy), leve e moderada são consideradas um fator de risco para doenças cardiovasculares e cerebrais, entretanto os mecanismos e as complicações decorrentes dessa condição ainda não estão bem estabelecidos. Ela ocorre em 5-10% da população geral e em 40% dos pacientes com doenças vascular periférica e doenças cerebrovasculares. Estudos recentes têm demonstrado que a vitamina D (calcitriol) possui efeitos protetores em diversos modelos experimentais que enfatizam suas possíveis ações antioxidantes. O objetivo principal dessa tese de doutorado foi estabelecer um protocolo experimental com diferentes concentrações de homocisteína em fatias de cortex cerebral e coração e em cultura de astrócitos de ratos adultos. Seguindo esses modelos experimentais, investigamos alguns parâmetros bioquímicos em córtex cerebral e coração de ratos. Posteriormente foi analisado o efeito protetor do calcitriol. No primeiro capítulo da presente tese, observamos que a incubação de 30 μM de Hcy por 30 min e 60 min em fatias de coração, alterou a função e a permeabilidade mitocondrial, o estado redox e a atividade das enzimas da cadeia respiratória; o calcitriol foi capaz de prevenir a maioria dos efeitos da Hcy. No segundo capítulo, vimos que em fatias de córtex cerebral a Hcy prejudica o metabolismo energético, aumentando a morte neuronal e induzindo estresse oxidativo. Todavia, o calcitriol atenuou esses efeitos deletérios induzidos pela Hcy através da ativação do receptor de vitamina D. No último capítulo desta tese, realizamos um estudo em cultura primária de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos. Nossos resultados demonstram que a Hcy ativa a via do fator nuclear kappa B (NFκB), inibindo a expressão de heme oxigenase 1 (HO-1), promovendo alterações morfológicas, aumentando a resposta inflamatória e diminuindo as defesas antioxidantes e a atividade da Na+, K+ - ATPase. Em resumo, em todos modelos experimentais estudados nesta tese, a Hcy, mesmo em concentrações leves e moderadas causou alterações na homeostasia celular. A vitamina D preveniu parte destes efeitos, tornando-se um possível ferramenta terapêutica no intuito de atenuar os efeitos da Hcy. / Hyperhomocysteinemia (HHcy), mild and moderate are a risk factor for cardiovascular and cerebral diseases, but the mechanisms and complications of this condition are not yet well established. It occurs in 5-10% of the general population and 40% of patients with peripheral vascular and cerebrovascular disease. Recent studies have shown that vitamin D (calcitriol) has protective effects in various experimental models which emphasize their potential antioxidant actions. The main objective of this PhD thesis was to establish an experimental with different concentrations of homocysteine in slices of cerebral cortex and heart in adult rat astrocyte cultures. Following this experimental model, we investigated some biochemical parameters in the cerebral cortex and heart of rats. It was subsequently examined the protective effect of calcitriol. In the first chapter of this thesis, we found that incubation of 30 μM of Hcy for 30 min and 60 min in heart slices change the function and mitochondrial permeability, redox state and activity of the enzymes of the respiratory chain; calcitriol was able to prevent most of the effects of Hcy. In the second chapter, we demonstrated that Hcy in the cerebral cortex slices impairs energy metabolism, increasing neuronal death and inducing oxidative stress. However, calcitriol attenuated these Hcy-induced deleterious by activation of vitamin receptor D. In the last chapter of this thesis, we conducted a study in primary culture of cortical astrocytes. Our results demonstrate that the Hcy active the pathway of nuclear factor kappa B (NFκB) inhibiting heme oxygenase expression 1 (HO-1), promoting morphological changes, increasing the inflammatory response and decreased antioxidant defenses and activity of the Na +, K + - ATPase. In summary, in all experimental models studied in this PhD thesis, Hcy, even in mild and moderate concentrations caused deleterious actions in cellular homeostasis. Vitamin D warned of these effects, becoming a potential therapeutic target in order to attenuate the effects of Hcy.

O diabetes mellitus tipo I é uma enfermidade autoimune relacionada com anormalidades genéticas, influenciada por fatores ambientais, que resultam na destruição de células β-pancreáticas, mediadas por células T. O diabetes durante a gravidez aumenta o risco a alterações no sistema nervoso central. O processo de gliogênese é importante para o desenvolvimento e funcionamento do SNC e começa na segunda semana de gestação, em ratos. A glia é composta por astrócitos, oligodendrócitos, células ependimais e microglia. Os astrócitos são as células mais abundantes e responsáveis pela integração do cérebro com o sistema vascular e imunológico, estando relacionados com as funções cognitivas, além de uma importância física e estrutural na barreira hemato-encefálica. Duas proteínas astrocíticas foram estudadas aqui: a proteína glial fibrilar acida e a S100B, uma proteína ligante de cálcio, produzida e secretada por astrócitos. A S100B está envolvida na comunicação neurônio-glia, possuindo propriedades neurotróficas ou neurotóxicas de acordo com a concentração extracelular. A expressão da proteína glial fibrilar ácida é essencial para a estrutura encefálica e para a integridade da barreira hemato-encefálica. Assim avaliamos essas proteínas gliais na prole oriunda de mães diabéticas (PoD) no desenvolvimento corporal e do sistema nervoso central. Foram utilizadas ratas Wistar-Kyoto diabéticas induzidas por estreptozotocina para obtenção da prole. As fêmeas diabéticas induzidas apresentaram ninhadas menores do que o controle, e os filhotes apresentam menor peso ao nascer A hiperglicemia materna induz aumento da produção insulínica no feto, que leva a um quadro de hipoglicemia pós-natal. Os níveis glicêmicos do PoD foram superiores ao controle (PoC) com 1 dia, e inferiores com 21 dias. A mensuração da proteína S100B no soro de animais PoD14 apresentou diminuição em relação ao controle. A S100B no líquor mostrou valores foram maiores no PoD7. Já a S100B no hipocampo mostrou um crescimento progressivo, com diminuição no PoD14 e um aumento no PoD28. Na quantificação da proteína glial fibrilar acida os animais do grupo PoD7 e PoD14 apresentaram valores menores, em seguida os níveis começaram a subir. No teste de campo aberto os animais PoD apresentaram comportamento ansioso. Já no reconhecimento de objetos os ratos PoD exploraram menos o objeto novo, tanto na memória de curta como de longa duração. As mudanças astrogliais observadas nos animais do grupo PoD estão muito provavelmente relacionadas a alterações da plasticidade neuroglial e ao déficit cognitivo observado. / The type I diabetes mellitus is an autoimmune disease associated with genetic abnormalities, influenced by environmental factors which result in the destruction of pancreatic β-cells, mediated by T cells. Diabetes during pregnancy increases the risk of changes in the central nervous system. The gliogenesis process is important to the development and functioning of the central nervous system and starts the second week of rat gestation. The glia is composed of astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells and microglia. The astrocytes are more abundant cells and responsible for the integration of the brain with vascular and immune systems, being connected with the cognitive functions, as well as a physical and structural importance of the blood-brain barrier. Two astrocity proteins were studied: glial acidic fribrilar protein and S100B, a binding protein of calcium produced and secreted by astrocytes. S100B is involved in neuron-glia communication, having neurotoxic or neurotrophic properties according to the extracellular concentration. Expression of glial acidic fribrilar protein is essential for brain structure and integrity of the blood-brain barrier. So we evaluated this glial proteins the offspring derived from diabetic mothers (PoD) on body development and central nervous system. Wistar-Kyoto rats with diabetes induced by streptozotocin to obtain offspring. Induced diabetic females had smaller litters then the control, and the offsprig have a lower birth weigth Maternal hyperglycemia induces increased insulin production in the fetus. Blood glucose levels were higher in PoD than the control (PoC) with 1 day and less than 21 days. The measurement of S100B protein in PoD14 animal serum showed a decrease compared to the control. The S100B in cerebrospinal fluid showed values were higher in PoD7. Since S100B in the hippocampus showed a progressive increase with decrease in PoD14 and increase in PoD28. Glial acidic fribrilar protein quantification in animals of PoD7 and PoD14 group showed lower values, and then levels began to rise. In the open field test the PoD animals showed anxious behavior. Since the object recognition (RO) least rats explored the new object in both short and long term memory. Induced diabetic females had smaller litters than the control, and the chicks have a lower birth weight. Maternal hyperglycaemia induces increased insulin production in the fetus, which leads to a postnatal hypoglycemia. The variations observed in the animals of group PoD caused biochemical changes related to astroglial plasticity, which caused cognitive impairment.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

O hipotálamo é uma região cerebral fundamental na detecção e na integração de sinais nutricionais e hormonais da periferia, proporcionando mudanças fisiológicas adequadas para a manutenção da homeostase energética, além de estar envolvido em outras funções essenciais aos organismos, tais como a regulação do balanço energético, da temperatura corporal, do ritmo circadiano e da reprodução. O hipotálamo também é uma estrutura crucial durante o envelhecimento, em virtude do papel dominante que desempenha no organismo e, considerando-se o aumento da expectativa de vida da população mundial, entender as alterações ocorridas nesta região cerebral pode ajudar a elucidar mecanismos patofisiológicos de doenças neurometabólicas, bem como levar a uma melhora na qualidade de vida dos indivíduos. Os astrócitos hipotalâmicos desempenham várias funções que podem afetar diretamente a homeostase energética, pois estas células estão envolvidas na detecção e no transporte de nutrientes, e expressam receptores para hormônios metabólicos e neuropeptídios, podendo modular a atividade dos neurônios responsáveis pelo controle do apetite e saciedade. Além disso, este tipo celular participa da resposta inflamatória na região hipotalâmica, podendo levar à resistência à leptina e à intolerância à glicose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar as características morfofuncionais de culturas primárias de astrócitos hipotalâmicos de ratos Wistar recém-nascidos, adultos e envelhecidos (1-2 dias, 90 dias e 180 dias, respectivamente). Foram observadas alterações idade-dependentes na regulação da homeostase glutamatérgica, biossíntese da glutationa, perfil de aminoácidos, metabolismo da glicose, suporte trófico, resposta inflamatória e sensibilidade à leptina. Além disso, verificou-se que importantes vias de sinalização, tais como Nrf-2/HO-1, p38 MAPK, NFκB, COX-2, iNOS e PI3K/Akt, apresentaram alterações com o passar da idade. Portanto, este estudo evidencia que a capacidade homeostática dos astrócitos hipotalâmicos se mostra alterada ao longo do processo de envelhecimento e que, consequentemente, estas células podem estar envolvidas no desenvolvimento de distúrbios metabólicos, tornando-se alvos terapêuticos em potencial. / The hypothalamus is a fundamental brain region in the detection and integration of nutritional and hormonal signals from the periphery, providing adequate physiological changes to maintain energy homeostasis, besides being involved in other essential functions to the organisms, such as: energy balance, temperature, circadian rythm and reproduction. Additionally, the hypothalamus is crucial in the aging process, due its neurometabolic role, and considering the extending human life span, understanding the changes in this brain region might contribute to elucidate the patho(phisio)logical mechanisms of neurometabolic diseases, as well as might improve the healthy of individuals. Hypothalamic astrocytes perform various functions that may directly affect energy homeostasis, since these cells are involved in the detection and transport of nutrients, and express receptors for metabolic hormones and neuropeptides, thus modulating the activity of neurons responsible for controlling appetite and satiety. In addition, these cells participate in the inflammatory response in the hypothalamic region, and may lead to leptin resistance and glucose intolerance. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphofunctional properties of primary cultures of hypothalamic astrocytes from newborn, adult and aged Wistar rats (1-2 days, 90 days and 180 days, respectively). Age-dependent changes in the regulation of glutamatergic homeostasis, glutathione biosynthesis, amino acid profile, glucose metabolism, trophic support, inflammatory response and leptin sensitivity were observed. Furthermore, important signaling pathways, such as Nrf-2/HO-1, p38 MAPK, NFκB, COX-2, iNOS and PI3K/Akt, changed with age. Therefore, this study showed that the homeostatic capacity of hypothalamic astrocytes is altered throughout the aging process and that, consequently, these cells may be involved in metabolic disorders, becoming potential therapeutic targets.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.

Orientador: Antonio Carlos Alessi / Banca: Gisele Fabrino Machado / Banca: Márcio Botelho de Castro / Resumo: Os astrócitos são células nervosas que participam da patogenia de diversas neuropatias que acometem os animais domésticos. Nas aves, a principal doença neurológica é a Encefalomalácia Nutricional causada pela deficiência de vitamina E. Com o objetivo de se estudar o comportamento do astrócitos, pelo exame imunoistoquímico, na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus, foi realizada a tentativa de indução desta doença. Utilizou-se para isto rações contendo deficiência de vitamina E no suplemento vitamínico-mineral e fontes de gordura oxidadas. Nos experimentos realizados não se obteve sucesso na indução da Encefalomalácia Nutricional, porém, em casos naturais reavaliados, constatou-se que os astrócitos participam na patogenia apresentando astrogliose e astrocitose nas "áreas lesionadas e ao redor de vasos sangüíneos (barreira hemato-encefálica). Portanto, conclui-se que os astrócitos participam na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus e que, a etiologia da doença não é atribuída somente à deficiência de vitamina E na dieta. / Abstract: The astrocytes are nervous cells which participate in the pathogenesis of various neuropathies of domestic animais. In poultry; the main neurologic disorder is Nutricional Encephalomalacia, caused by vitamin E deficiency. With the aim to study the behavior of astrocytes in the Nutricional Encephalomalacia pathogenesis in Gallus gallus domesticus, by immunohistochemistry, a trial of induction of the disorder was realized. Low vitamin E and oxidized oi! rations were prepared. There was no success in the experimental induction of Nutricional Encephalomalacia, however, in re-evaluated naturally occurring cases, it could be observed that astrocytes undergo astrogliosis and astocytosis in the lesioned area and around blood vessels (hemato-encephalic barrier). Altogether, it may be concluded that astrocytes participate in the pathogenesis of the poultry's Nutricional Encephalomalacia, and that the disorder is not only caused by diets with the lack of vitamin E. / Mestre

Durante o desenvolvimento fetal, o sistema nervoso central (SNC) apresenta-se mais vulnerável aos efeitos tóxicos do etanol. Sabe-se que a exposição pré-natal sob altas doses de álcool aumenta a propensão de síndromes fetais. No entanto, muitas gestantes optam por manter o “beber social”, mesmo que estudos mostrem que doses moderadas de etanol na fase do desenvolvimento possa causar danos ao SNC associados a transtornos cognitivos, sociais e neuroquímicos. O objetivo desta tese é avaliar parâmetros astrogliais e comportamentais no período da adolescência em fatias hipocampais de ratos Wistar machos submetidos a um modelo animal de exposição pré e pós-natal sob doses moderadas de etanol. O modelo animal utilizou cerveja sem álcool para administração por via oral de etanol. As ratas foram expostas ao tratamento durante toda a gestação até o final do desmame. Ratas prenhas foram divididas em três grupos de tratamento: apenas água (grupo controle), cerveja sem álcool (grupo veículo) ou cerveja sem álcool adicionado de 10%v.v. etanol (MPAE group 9 moderate prenatal alcohol exposure). Filhotes adolescentes machos foram submetidos a tarefa de esquiva discriminativa passiva com o objetivo de avaliar o comportamento de aprendizado/memória e de ansiedade. No dia pós-natal 30 (DPN 30) o hipocampo foi dissecado e fatias foram obtidas para a imunoquantificação de GFAP, NeuN, S100B, receptores NMDA e para os transportadores gliais de glutamato, EAAT1 e EAAT2. O ensaio para dosagem da captação de glutamato, bem como o conteúdo de glutationa (GSH) também foram realizados. Os filhotes do grupo MPAE apresentaram comportamento do tipo ansiolítico, mesmo tendo aprendido a evitar o braço aversivo. Observamos neste grupo uma diminuição da captação de glutamato, que parece ser dose 9 dependente, além de alterações na quantificação dos receptores NMDA e dos transportadores de glutamato EAAT1 e EAAT2, que podem ter contribuído para os efeitos comportamentais encontrados. Os níveis da proteína S100B estavam claramente elevados no líquido cefalorraquidiano apenas no grupo MPAE e alterações na expressão de GFAP também foram evidenciadas neste grupo. Contudo, este trabalho mostra que mesmo doses moderadas de etanol, administradas durante o período do desenvolvimento fetal, podem interferir no comportamento de risco associado a diminuição da ansiedade, visto na fase da adolescência. Além disso, os resultados ressaltam uma maior vulnerabilidade do sistema glutamatérgico à toxicidade do etanol, bem como da possibilidade das células da glia participarem de uma resposta de ativação e reparo após o tratamento pré-natal com etanol. / The central nervous system (CNS) is more vulnerable to ethanol effects during fetal development. It is known that high doses of prenatal ethanol exposure increases the probability of fetal alcohol syndromes. Women have chosen to continue drinking socially despite being pregnant, even with studies demonstrating that moderate doses of ethanol during development can impact the CNS leading to cogitive, social and neurochemical impairments. The aim of this thesis is evaluate glial and behavior parameters during adolescence period on hippocampal slices of male Wistar rats submitted to an animal model of prenatal and postnatal ethanol exposure under moderate dose. An animal model of oral self-administration of etanol through a non-alcoholic beer was performed during the role gestation period until weaning. The pregnant rats were divided in three treatment groups: only water (control group), non-alcoholic beer (vehicle group) or non-alcoholic beer with 10% v.v. added (MPAE group – moderate prenatal alcohol exposure). Adolescent male offspring were subjected to the discriminative passive avoidance task to evaluate the learning/memory and anxiety-like behavior. On postnatal day 30 (PND 30) hippocampi were dissected and slices were obtained for immunoquantification of GFAP, NeuN, S100B, NMDA receptors and for glial glutamate transporters, EAAT1 and EAAT2. In addition, we measured the glutamate uptake, as well as the GSH content. Offspring from MPAE group presented an anxiolytic-like behavior, even though they had learned how to avoid the aversive arm. We observed a decrease in glutamate uptake, that seems to be dose-dependent, and alterations in the quantification of glutamate NMDA receptors and EAAT1 and EAAT2 transporters, that could contribute to the behavior findings. The S100B protein levels were clearly increased in the cerebrospinalfluid only for MPAE group and alterations in GFAP expression were also seen for this group. Nevertheless, this thesis shows that even moderate ethanol doses administred during fetal development can impact the rink taking behavior associated to reducement in anxiety, common seen during adolescence. Moreover, the results highlight a vulnerability of glutamate system associated to etanol toxicity, as well as the possibility of glial cells are involved in an activated and repair response after prenatal etanol treatment.

Os astrócitos são células conhecidas por sua capacidade dinâmica e versatilidade, participando não somente da manutenção da homeostase cerebral em condições fisiológicas, mas também respondendo em condições patológicas, como por exemplo, na encefalopatia hepática (EH). Esta patologia neurológica está associada principalmente à hiperamonemia, decorrente de uma falência hepática aguda ou crônica. A toxicidade da amônia no sistema nervoso central (SNC) é mediada por uma série de alterações celulares e metabólicas, principalmente nas células astrogliais. Nesse sentido, a busca por moléculas com potencial terapêutico no SNC é extremamente relevante. Trabalhos do nosso grupo mostraram que o resveratrol e o ácido lipoico, duas moléculas conhecidas pelos seus efeitos antioxidantes, modulam importantes funções gliais, relacionadas principalmente ao metabolismo glutamatérgico, à defesa antioxidante e à resposta inflamatória. Neste sentido, esta tese teve como objetivo avaliar os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico em células astrogliais e neuronais expostas à amônia, assim como seus possíveis mecanismos protetores. Primeiramente, nós observamos que o resveratrol e o ácido lipoico foram capazes de prevenir as alterações induzidas pela amônia em células astrogliais C6, sobre parâmetros do metabolismo glutamatérgico, dentre os quais podemos destacar a captação de glutamato, a atividade da enzima glutamina sintetase (GS) e o conteúdo de glutationa (GSH). Além disso, o ácido lipoico também exerceu um efeito antiinflamatório nestas células, prevenindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL- 1β, IL-6, IL-18) e da proteína S100B, através da diminuição da ativação do fator de transcrição NFκB. Nós também verificamos que a maioria dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico foram dependentes da heme oxigenase 1 (HO1), uma enzima associada com a defesa celular em situações de estresse. Por fim, foram avaliados os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico sobre células neuronais expostas à amônia. Novamente, ambos apresentaram um efeito benéfico, prevenindo tanto o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) quanto a diminuição do conteúdo de GSH induzidos pela amônia. Nas células neuronais, a proteína HO1 também participou dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico. Em conjunto, esses resultados nos mostram que o resveratrol e o ácido lipoico são capazes de modular positivamente o funcionamento tanto de células astrogliais quanto de células neuronais em situações de hiperamonemia, compartilhando também alguns mecanismos de ação, como a indução da HO1. Este estudo in vitro sugere que o resveratrol e o ácido lipoico são potenciais agentes terapêuticos para doenças do SNC, as quais envolvam produção de espécies reativas e resposta inflamatória, como a EH. / Astrocytes are dynamic and versatile cells which participate in the maintenance of brain homeostasis in physiological conditions and also in response to pathological conditions, such as hepatic encephalopathy. This neurological disease is mainly associated with hyperamonnemia, resulting from acute or chronic liver failure. Ammonia toxicity in the central nervous system (CNS) is mediated by several cellular and metabolic alterations, primarily in astroglial cells. In this sense, the search for molecules with therapeutical potential for CNS becomes highly relevant. Our group has shown that resveratrol and lipoic acid, two molecules known for their antioxidant activities, are able to modulate important glial functions mainly related to glutamate metabolism, antioxidant defense and inflammatory response. In this sense, this study aimed to evaluate the effects of resveratrol and lipoic acid in astroglial and neuronal cells exposed to ammonia, as well as their possible protective mechanisms. Firstly, we observed that resveratrol and lipoic acid were able to prevent ammonia-induced alterations in C6 astroglial cells functioning, such as glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and intracellular GSH content. Moreover, lipoic acid also exerted an anti-inflammatory effect in C6 astroglial cells, preventing the ammonia-stimulated release of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-1β, IL-6, IL-18) and S100B protein, by decreasing the activation of the transcription factor NFκB. We also verified that the most protective effects of resveratrol and lipoic acid involved the heme oxygenase 1 (HO1), an enzyme associated with protection against stressful conditions. Finally, we evaluated the effects of resveratrol and lipoic acid on neuronal cells exposed to ammonia. Again, both showed beneficial roles, preventing the increase of reactive oxygen species (ROS) and decrease of GSH content induced by ammonia. In neuronal cells, HO1 also mediated the protective effects of resveratrol and lipoic acid. Taken together, these results show that resveratrol and lipoic acid are able to positively modulate the functioning of both astroglial and neuronal cells in hyperamonemmia conditions, sharing some mechanisms of action, such as HO1. This study in vitro suggests that resveratrol and lipoic acid may represent potential therapeutic agents for CNS, during oxidative and inflammatory damages, as the induced by ammonia.

As respostas inflamatórias no cérebro são mediadas principalmente pela microglia, mas evidências crescentes sugerem uma importância crucial dos astrócitos. A S100B, uma proteína ligante de cálcio e secretada por astrócitos, tem propriedades neurotróficas e de citocina inflamatória. No entanto, não se sabe se sinais primários que ocorrem durante a indução de uma resposta inflamatória como, por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS) modulam diretamente a S100B. A neuroinflamação está implicada na patogênese ou na progressão de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos e muitos estudos procuram uma conexão entre S100B e doenças degenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e esquizofrenia. O uso terapêutico de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) para estas doenças tem aumentado. No entanto, existem poucos estudos sobre o efeito desses fármacos em relação à proteína S100B. Neste trabalho, nós avaliamos se os níveis de S100B no líquido cefalorraquidiano (LCR) e soro de ratos Wistar são afetados por injeção de LPS administrado por via intraperitoneal (IP) ou intracerebroventricular (ICV), bem como se as culturas primárias de astrócitos respondem diretamente ao LPS. Além disso, nós avaliamos o conteúdo e a secreção de S100B medido por ELISA (bem como o conteúdo de GFAP e secreção de TNF-α) em culturas primárias de astrócitos expostos a dexametasona e quatro classes químicas diferentes de AINEs (ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenaco e nimesulida) durante 24 h. Os nossos dados sugerem que a secreção de S100B no tecido cerebral é estimulada rapidamente e persistentemente (durante pelo menos 24 h) por administração ICV de LPS. Este aumento da S100B no LCR foi transitório quando o LPS foi administrado IP. Em contraste com estes resultados de S100B, observou-se um aumento nos níveis de TNF-α no soro, mas não no LCR, após a administração IP de LPS. Em astrócitos isolados e em fatias de hipocampo frescas, observou-se uma estimulação direta da secreção de S100B por LPS numa concentração de 10 ug/ml. Um envolvimento de TLR4 foi confirmado pelo uso de antagonistas específicos deste receptor. No entanto, baixas concentrações de LPS em culturas de astrócitos foram capazes de induzir uma diminuição na secreção de S100B após 24 h, sem alteração significativa no conteúdo intracelular de S100B. Além disso, após 24 horas de exposição ao LPS, observou-se um decréscimo na glutationa e um aumento na proteína ácida fibrilar glial. Também foi observado que os AINEs apresentam diferentes efeitos sobre parâmetros gliais. O ácido acetilsalicílico e o diclofenaco foram capazes de aumentar a GFAP, enquanto que a nimesulida, um inibidor seletivo de COX-2, e a dexametasona diminuiram a secreção de S100B. No entanto, todos os AINEs reduziram os níveis de PGE2. Juntos, esses dados contribuem para a compreensão dos efeitos de LPS em astrócitos, especialmente sobre a secreção de S100B, e nos ajuda a interpretar mudanças nesta proteína no LCR e soro em doenças neuroinflamatórias. Além disso, tecidos periféricos que expressam S100B talvez devam ser regulados diferentemente, uma vez que a administração IP de LPS não foi capaz de aumentar os níveis séricos de S100B. Em relação aos AINEs, a PGE2 parece estar envolvida no mecanismo de secreção de S100B, mas vias adicionais, não claras neste momento, necessitam de uma maior caracterização. O papel inflamatório de S100B em doenças degenerativas, onde também são observados níveis elevados da COX-2 e PGE2, poderia ser atenuado por inibidores de COX-2. / Inflammatory responses in brain are primarily mediated by microglia, but growing evidence suggests a crucial importance of astrocytes. S100B, a calciumbinding protein secreted by astrocytes, may act as a neurotrophic or an inflammatory cytokine. However, it is not known whether primary signals occurring during induction of an inflammatory response (e.g. lipopolysaccharide, LPS) directly modulate S100B. Neuroinflammation has been implicated in the pathogenesis or progression of a variety of neurodegenerative disorders and several studies have looked for a connection of S100B, and degenerative diseases including Alzheimer’s disease and schizophrenia. The therapeutic use of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAID) to these diseases has growth up. However, there are few reports about the effect of these drugs on S100B. In this work, we evaluated whether S100B levels in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of Wistar rats are affected by LPS administered by intraperitoneal (IP) or intracerebroventricular (ICV) injection, as well as whether primary astrocyte cultures respond directly to lipopolysaccharide. Moreover we evaluated S100B content and secretion measured by ELISA (as well as GFAP content and TNF-α secretion) in primary astrocyte cultures exposed to dexamethasone and 4 different chemical classes of NSAID (acetyl salicylic acid, ibuprofen, diclofenac and nimesulide) for 24 h. Our data suggest that S100B secretion in brain tissue is stimulated rapidly and persistently (for at least 24 h) by ICV LPS administration. This increase in CSF S100B was transient when LPS was IP administered. In contrast to these S100B results, we observed an increase in in TNFα levels in serum, but not in CSF, after IP administration of LPS. In isolated astrocytes and in acute hippocampal slices, we observed a direct stimulation of S100B secretion by LPS at a concentration of 10 μg/mL. An involvement of TLR4 was confirmed by use of specific inhibitors. However, lower levels of LPS in astrocyte cultures were able to induce a decrease in S100B secretion after 24 h, without significant change in intracellular content of S100B. In addition, after 24 h exposure to LPS, we observed a decrease in astrocytic glutathione and an increase in astrocytic glial fibrillary acidic protein. We also observe that NSAIDs have distinct effects on glial parameters. ASA and diclofenac are able to increase GFAP, while nimesulide, a selective COX-2 inhibitor, and dexamethasone were able to decrease S100B secretion. However, all anti-inflammatories were able to reduce levels of PGE2. Together, these data contribute to the understanding of the effects of LPS on astrocytes, particularly on S100B secretion, and help us to interpret cerebrospinal fluid and serum changes for this protein in neuroinflammatory diseases. Moreover, non-brain S100B-expressing tissues may be differentially regulated, since LPS administration did not lead to increased serum levels of S100. With respect to NSAIDs, PGE2 is possibly involved in the mechanism of S100B secretion but additional pathways, unclear at this moment, demand further characterization. The inflammatory role of S100B in degenerative diseases, where also is observed elevated levels of COX-2 and PGE2, could be attenuated by COX-2 inhibitors in which elevated levels of COX-2.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão. / Infant human brains submitted to hypoxia-ischemia show oligodendrocyte loss, hypomelination, astrogliosis, cortical development and motor behavior impairments, including cerebral palsy. Cerebellum plays a critical role in motor control and many damages have been demonstrated in humans and animals who suffered HI. Glutamatergic excitotoxicity is usually associated to HI and cellular junctions may be responsible for molecular traffic, being able to modulate HI harm effects. Previous data from our group using a modified model of prenatal HI in rats have shown long-lasting damages in cerebellar structure, indicating that deleterious effects of prenatal HI may be sustained until adult life. The objective of this study was to characterize connexin (Cx) and glutamate receptors and transporters levels during the development of HI cerebellum and to evaluate cellular junctions in astrocyte cultures derived from the cerebella of rats submitted to this same model. Rats on the 18th gestation day were anesthetized, had their uterine horns exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (HI group). Control animals had the uterine horns exposed but no arteries were clamped (SH group). Gestation proceeded after surgery and only pups born at term were used. The animals were decapitated at 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16), 23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) postnatal days. Cerebella were submitted to Western blotting using anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP and anti-Cx43 antibodies. P2 cerebella were used in astrocyte primary cultures. After they had achieved confluence, the cells were fixed and immunostained with anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestin and anti-A2B5 antibodies. Our results demonstrate differences in GluR3 levels along cerebellum development of SH and HI animals, with a significant decrease of this subunit expression in HI group at P9. On the other hand, we did not observe any variation in NR2B and GFAP levels between groups at different ages. We also observed a significant decreased Cx43 expression in HI group at P2 as well as in cultured astrocytes, which had morphological modifications and different A2B5 marker expression. The modification related to GluR3 receptor in HI group may be caused by impaired dendritic arborization or by a reduced number of oligodendrocyte progenitors in the cerebellum of HI animals at P9, already described in our laboratory. Cx43 reduction indicates that substances traffic through astrocytic channels may be impaired and contribute to lesion expansion of permanent damages observed in HI. Morphological and markers expression changes related to astrocyte differentiation may reflect potential effects of HI on cell maturation at long-term. Our results confirm that prenatal systemic HI may be responsible for changes that characterize glutamatergic excitotoxicity. We also reassure the importance of astrocyte communication as a neuroprotective strategy in this kind of lesion.