La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs. / Systemic Sclerosis (SSc) is a devastating autoimmune disease of unknown etiology. Immune dysfunction, fibrosis and vasculopathy are the three major features of the disease; however, the interactions between these components are poorly understood. A novel link between autoimmunity and fibrosis has been proposed by the presence of stimulatory autoantibodies to the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) on fibroblasts. These autoantibodies were capable of stimulating reactive oxygen species and subsequent activation of ERK1/2. If the anti-PDGFR autoantibodies are present in the systemic circulation of SSc patients, they will most certainly encounter vascular smooth muscle cells (VSMCs). The latter are known to express the PDGFR and response to PDGF, which is a known phenotypic modulator of VSMCs. The work presented here seeks to readdress the presence of stimulatory anti-PDGFR autoantibodies in serum derived from SSc-patients and to characterize the effects of SSc-IgG on VSMCs by measuring the activation of specific signaling cascades and the induction of genes involved in fibrotic responses. Our results demonstrate the presence of an IgG fraction stimulating a phenotypic response in cultured VSMCs. Notably, a significant up-regulation of the pro-fibrotic gene tgfb1 and a significant down-regulation of the anti-fibrotic gene tgfb2 were observed in VSMC exposed to SSc-IgG fractions. Positive IgG fractions for ERK activation were present in most, but not all, SSc samples (68%, 19/28), and they were less present in controls (27%) (3/11). Although, the SSc-IgG fractions were able to significantly immunoprecipitate the PDGFR, the use of a selective PDGFR inhibitor, AG1296, did not inhibit the activation of ERK mediated by SSc-IgG fractions. Altogether, our findings suggest the presence of stimulatory autoantibodies with profibrotic activity in serum derived form SSc patients. Work is in progress to identify the molecular entity responsible for the IgG response observed in cultured VSMCs.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent. La PR est une maladie génétique où il existe plusieurs allèles de susceptibilité HLA-DRB1. Les auto-anticorps anti-protéines citrullinées sont les plus spécifiques de la PR. Ils sont détectés par les tests anti-peptides cycliques citrullinés (anti-CCP). 1/L’objectif de notre premier travail était de montrer l’influence des allèles susceptibilité HLA-DR sur la présence d’anti-CCP dans notre population marseillaise de PR. Nous avons montré que les allèles de susceptibilité HLA-DR ne sont pas nécessaires à la présence des anticorps anti-CCP. Nous avons mis en évidence une association entre l’allèle HLA-DRB1*04:04 et la présence des anti-CCP.2/Environ un tiers des patients présentant une PR n’ont pas d’anticorps anti-CCP. Nous avons donc recherché des nouveaux auto-anticorps pour le diagnostic de la maladie.Les auto-anticorps dirigés contre le domaine catalytique de la protéine B-Raf (v raf murine sarcoma viral oncogen homologue B1) ont été identifiés par la technique des puces à protéines chez les patients PR. B-Raf est une sérine-thréonine kinase qui est impliquée dans la voie des MAP-kinases. Nous avons montré que les auto-anticorps anti-B-Raf activent B-Raf. Nous avons montré que le peptide p25 de B-Raf est spécifiquement reconnu par les auto-anticorps des PR. Les auto-anticorps anti-p25 identifient 21% des patients PR sans anticorps anti-CCP.3/En utilisant des puces à protéines, nous avons identifié 24 nouveaux auto-antigènes associés aux PR débutantes. Quatre de ces auto-antigènes ont été validés par ELISA : GABA(A) receptor associated protein like, zinc finger protein 706, tropomyosin 2 et WIBG (within BGCN homolog (Drosophila)). Les auto-anticorps anti-WIBG identifient exclusivement les PR.Ces nouveaux auto-antigènes pourront être utilisés dans le diagnostic des PR débutantes et des PR sans anticorps anti-CCP. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease with a prevalence of 0.5% wordwilde. HLA-DR genes are the strongest genetic prevalence in RA. The sera of RA patients contain many auto-antibodies. The most characteristic are directed at citrullinated proteins (ACPA). ACPA can be detected by commercially available enzyme-linked immune-absorbent assays using synthetic cyclic citrullinated peptides (CCP).1/In the first work we tested whether the presence of RA associated HLA-DRB1 alleles individually influences anti-CCP production in a population of RA from Marseille. We showed RA associated HLA-DR alleles are not mandatory for the production of anti-CCP. HLA-DRB1*04:04 was the most strongly associated with the presence of anti-CCP in RA sera. 2/ Anti-CCP antibodies are detected in 65% of RA patients. We wanted to detect new auto-antibodies for the diagnosis of RA.By screening protein arrays we found that B-Raf (v raf murine sarcoma viral oncogen homologue B1) is a major non-citrullinated auto-antigen recognized by 35% of RA patients’sera. B-Raf encodes a serine threonine-kinase involved in the MAPK signaling pathway. We showed that anti-B-Raf auto-antibodies activate the in vitro phosphorylation of MEK1 mediated by B-Raf.We found that one peptide of B-Raf, p25, is specifically recognized by auto-antibodies from RA patients. Of interest, anti-p25 auto-antibodies are detected in 21% of anti-CCP negative RA patients.3/We identified 24 new auto-antigens associated with RA patients with disease duration less than one year using 8000 human protein arrays. We identified four auto-antigens recognized almost uniquely by sera of early RA patients: GABA(A) receptor associated protein like, zinc finger protein 706, tropomyosin 2 and WIBG (within BGCN homolog (Drosophila)). These reactivities were confirmed by ELISA on purified proteins. Auto-antibodies to anti-WIBG identify exclusively RA patients’sera. These new auto-antigens could be used for the diagnosis of anti-CCP negative RA patients and in early RA.

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Résumé confidentiel / Confidential abstract

Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune caractérisée par la destruction des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas. Au cours de ce processus auto-immun, des auto-anticorps sont produits contre plusieurs antigènes des cellules bêta, par exemple l'insuline, l'acide glutamique décarboxylase (GAD65), la protéine tyrosine phosphatase (IA-2) et le transporteur de zinc (ZnT8). Au moins un auto-anticorps contre l'un de ces antigènes est présent dans> 95% des personnes atteintes de diabète de type 1 lors de la détection de l'hyperglycémie. Ces auto-anticorps peuvent servir de marqueurs précoces de diabète de type 1, car ils peuvent être présents des années avant l'apparition de la maladie, ce qui permet un diagnostic précoce avant les manifestations cliniques. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé, en partenariat avec une équipe de recherche clinique, une série de tests diagnostiques originaux, basée sur la détection précoce des différents auto-anticorps d’îlots de Langerhans à partir d'échantillons de sérum humain. Ces tests de diagnostic comprennent des tests bridging ELISA pour la détection d'auto-anticorps contre l'insuline, IA-2 et GAD65, qui sont rapides, facile à utiliser et n’utilisent pas de radioactivité. De plus, un test immunochromatographique sur bandelette pour la détection des auto-anticorps contre IA-2 a été développé. Le principal avantage des tests bandelettes est sa convivialité : les résultats peuvent être obtenus en 45 min en utilisant de très petits volumes de sérums et sans l'utilisation d’appareils spécialisés. Tous ces tests développés en interne ont été validés avec des échantillons de sérum de patients atteints de diabète de type 1 et de témoins sains et leurs performances ont été comparées avec celles de tests disponibles sur le marché. En outre, nous avons développé un test multiplex pour la détection simultanée de plusieurs auto-anticorps associés au diabète de type 1, ce qui permet de gagner du temps et d’augmenter la valeur diagnostic et prédictive du test par rapport à la détection d’un seul autoanticorps. Ce test multiplex a été validé pour la détection de deux autoanticorps (IA-2A et GADA) et comparé à nos tests ELISA de IA-2A et GADA. / Type 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic beta cells within the islets of Langerhans. In the course of this autoimmune process, autoantibodies are generated against several beta-cell antigens, e.g. insulin, glutamic acid decarboxylase (GAD65), tyrosine phosphatase-like protein (IA-2) and zinc transporter 8 (ZnT8). At least one autoantibody against one of these antigens is present in >95% of individuals with type 1 diabetes upon hyperglycemia detection. These autoantibodies can serve as early markers of type 1 diabetes, since they can be present years before disease onset, allowing for an early diagnosis before clinical manifestations. In the course of this thesis we have developed, in partnership with a clinical research team, a series of original diagnostic tests, based on the early detection of the different anti-Langerhans islet autoantibodies from human serum samples. These diagnostic tests include bridging ELISAs for the detection of autoantibodies to insulin, IA-2 and GAD65, which are rapid, non-radioactive and easy-to-use. Moreover, a lateral flow immunoassay (dipstick) for detection of autoantibodies to IA-2 was developed. The key advantage of lateral flow immunoassay is its user-friendly format: results can be obtained within 45 min using very small volumes of sera and without the use of any specialized apparatus. All these in-house assays were validated with diabetic and healthy human serum samples and the assay performances were compared to commercially available tests on the market. In addition, we have developed a multiplex assay for simultaneous detection of multiple diabetes-associated autoantibodies, which is time-effective and increases the diagnostic and predictive values of the assay, comparing to single autoantibody detection. This multiplex assay was validated for detection of two autoantibodies i.e. IA-2A and GADA and compared to in-house IA-2A and GADA bridging ELISAs.

Le cholangiocarcinome (CC) est un cancer des voies biliaires qui représente environ 15% des cancers primitifs du foie,mais de pronostic redoutable en raison d'un diagnostic tardif faute de marqueurs spécifiques.La présence d'auto anticorps (Ac) est rapportée comme marqueurs diagnostiques précoce de certains cancers.La présence d'auto-Ac dans le CC n'a pas été signalée, et aucun biomarqueur immunologique de cette maladie n'a été identifié. L'objectif de notre étude était d'identifier des auto-Ac potentiellement utilisables comme biomarqueur de CC, par analyse sérologique du protéome. Des immunoblots ont été réalisés à partir de la séparation par électrophorèse 2D de protéines de lignées tumorales de CC, CCSW1 et CCLP1, de 5 pièces d'hépatectomie ac leur partie tumorale et non tumorale,ainsi que de foie normal de neuropathie amyloïde. Les sérums de 13 patients atteints de CC et un pool de 10 sujets sains ont été testés sur ces immunoblot.La comparaison informatique des profils des protéines immunomarquées par les sérums des patients comparés aux profils des contrôles a permis de définir des spots immunoréactifs d'intérêt.Ces spots d'intérêt marqués par plus d'1/3 de sérums ont été ensuite identifiés par spectrométrie de masse de type Orbitrap®.Ainsi, nous avons identifié 10 protéines d'intérêt de CCSW1,11 protéines de CCLP1, 9 de la partie tumorale des foies, 14 des parties non-tumoral et 16 protéines appartenant au foie normal.Une extrême variabilité était observée selon les sérums pour un même Ag.Différents profils de réactivité étaient observés sur le même extrait antigénique en fonction des sérums testés, et pour un même sérum selon l'extrait antigénique utilisé.Il en résulte qu'un AC d'intérêt donné ne peut être considéré comme biomarqueur de CC que pour une faible proportion de patients.Pr cette raison, il faut envisager la combinaison de plusieurs anticorps pour avoir un test avec une sensibilité et une spécificité utilisable en clinique. Les protéines identifiées ont été classées par bio-informatique (logiciel Panther®) selon la description des gènes et de leurs produits selon une ontologie commune à toutes les espèces : fonctions moléculaires effectuées, processus biologiques assurés et localisation subcellulaire.Dans cette classification, 2 profils d'immunoréactivité se distinguent. La grande majorité des protéines cibles d'intérêt avec une fonction catalytique étaient présentes dans le foie normal ou dans les parties non tumorales des exérèses. L'autre profil était celui des protéines-cibles avec une fonction de protéines structurale et étaient présentes dans les lignées cellulaires tumorales ainsi que des parties tumorales des hépatectomies. Les protéines identifiées avec une activité catalytique étaient:l'alpha-énolase, le fructose biphosphate aldolase B et la glyceraldedyde 3-phosphate déshydrogénase, toutes troisréactives avec+de 50% des sérums de CC. Les protéines de structure identifiées par+de 60% des sérums de CC provenaient des lignées cellulaires et des tissus tumoraux.Il s'agissait de la vimentine, des prélamines A / C, de l'annexine A2 et de l'actine.Enfin, la sérotranferrine, protéines de transport, est reconnues par 100% des sérums CC en utilisant comme antigène des tissus tumoraux.Une sensibilité importante et une spécificité élevée sont des caractéristiques princeps d'un Ac pour pouvoir l'utiliser comme biomarqueur.La plupart des auto-Ac détectés dans cette étude avaient déjà été rapportées dans d'autres cancers et maladies auto-immunes. Pour trouver des protéines antigéniques spécifiques du CC, une combinaison de plusieurs semble nécessaire afin de permettre le développement de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic des CC.En conclusion, les biomarqueurs potentiels proposés dans cette étude doivent être testés en différentes combinaisons avec un panel en nb significatif de patients et en utilisant le substrat antigénique le plus approprié comme défini au cours de cette étude. / Cholangiocarcinoma (CC) is a rare but fatal primary liver cancer and accounts for an estimated 15% of primary liver cancer worldwide. It is associated with high mortality due to the lack of established diagnostic approaches. Autoantibodies can be used clinically as diagnostic markers for early cancer detection of cholangiocarcinoma. Studies, indicating the presence of auto-antibodies (AAbs) in CC have not been reported yet. No immunological biomarker, correlated to the disease, has been identified. The objective of our study was to identify cellular proteins from liver tissues (tumoral and non tumoral) and cholangiocarcinoma cell lines which could be recognized by antibody of CC patients. We used serological proteome analysis (SERPA) technique which leads us to suggest some molecules as potential biomarkers for the early diagnosis of CC. Proteins from different origins were 2DE separated: CCSW1 and CCLP1 tumor cell lines, five different samples of hepatectomies for CC with respect to their tumoral and non-tumoral counterparts and a normal liver from amyloid neuropathy. Sera from 13 CC patients and a pool of 10 healthy subjects were probed on immunoblot performed with these different separations. Comparison of immunoblotting patterns given by patient’s sera compared to patterns given by controls allowed to define immunoreactive spots of interest and those reacting with more than one-third of sera were identified by orbitrap type mass spectrometry. In this way we identified 10, 11, 9, 14 and 16 proteins from CCSW1, CCLP1, tumor part, non-tumor counterpart and normal liver antigenic extracts respectively. Different patterns of reactivity were observed according to sera on the same antigenic extract, and for a same serum, according to the antigenic extract, even though few common patterns were also observed. This widespread of reactivity is not unusual and reported earlier in several studies of this sort. It is indicated that a single AAb have an ability to identify only a small proportion of patient. For this reason, several antibodies in combination must be used to ensure sensitivity and specificity of assays used in the daily clinic.Identified proteins were then categorized by gene ontology analysis by which they fall into three main groups; biological process and molecular functions, protein class and molecular pathway and cellular component, according to the Panther classification. By Gene Ontology classification, two different patterns of targeted antigens were observed. The vast majority of targeted-proteins with catalytic activity were found in normal liver or non-tumor specimens. The second pattern was mainly represented by targeted proteins categorized as structural proteins extracted from CC cell lines and tumor tissues. Proteins identified with catalytic activity were: alpha-enolase, fructose biphosphate aldolase B and glyceraldedyde 3-phosphate dehydrogenase; which were reactive with more than 50% of CC sera. Proteins identified with structural activity, and detected with high rates by using cell lines and tumor tissues, were: vimentin, prelamine A/C, annexin A2 and actin; reactivity of each protein was higher than 62% with CC sera. Serotranferrin, identified under the category of transfer/carrier proteins, recognized by 100% of CC sera by using tumor tissues.High sensitivity and specificity is a prime requisite of AAbs that might be used as CC biomarkers for CC diagnosis. Most of the AAbs detected in this study had previously been reported in other cancers and auto-immune disorders. Hence it is essential to prove the specificity of antigenic proteins, a combination of various antigens therefore needs to be tested to enable the development of new biomarkers for the diagnosis and prognosis of CC.In conclusion, the proposed potential biomarkers need to be tested in a variety of different combinations with a panel of significant number of patients and using the most appropriate substrate defined during this study.

Les activités de recherche présentées dans ce document s'articulent en deux parties distinctes. La première partie concerne des travaux réalisés au sein de l'équipe du Pr Guy Serre, à la faculté de Médecine Purpan et portant sur la caractérisation des antigènes cibles d'auto-anticorps associés à une maladie auto-immune, la polyarthrite rhumatoïde. La seconde partie, réalisée au sein de l'Unité Mixte CNRS-Pierre Fabre dirigée par le Pr Jean-Edouard Gairin, est centrée sur l'étude d'un système biologique impliqué dans la dégradation des protéines intracellulaires, le système ubiquitine-protéasome et pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.<br /> <br />1. La polyarthrite rhumatoïde et les auto-anticorps anti-protéines citrullinées :<br /><br />La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation chronique et destructive des articulations synoviales. Le processus auto-immun rhumatoïde fait l'objet d'intenses recherches et bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension de certains mécanismes immuno-pathologiques mis en jeu, il n'a pas été possible d'identifier un élément unique comme responsable du processus inflammatoire auto-immun. Il est donc communément admis aujourd'hui que c'est la combinaison de divers facteurs qui détermine l'apparition et l'entretien de la maladie. <br />La présence dans le sérum des patients, d'anticorps décrits pour leur marquage du Stratum Corneum (ou couche cornée) de l'épithélium d'œsophage de rat et de l'épiderme humain, s'est avérée comme une caractéristique suffisamment fréquente et spécifique de la maladie rhumatoïde pour qu'on puisse les suspecter de jouer un rôle significatif dans les processus responsables de l'inflammation articulaire chronique. Afin de mieux comprendre le rôle joué par ces auto-anticorps qualifiés alors d'anticorps « anti-kératines » dans la pathogénie rhumatoïde, il était essentiel d'identifier leur cible antigénique. L'analyse par immunotransfert, à l'aide de sérums rhumatoïdes, d'extraits d'épithélium d'œsophage de rat a permis de détecter, comme cibles murines des auto-anticorps, trois antigènes solubles dans des tampons de faible force ionique. Ces trois protéines ne correspondent pas à des cytokératines mais à de nouvelles protéines spécifiques des étapes tardives du programme de différenciation de l'épithélium d'œsophage de rat. D'autre part, l'antigène ciblé dans l'épiderme humain a été identifié à un variant acide de la filaggrine, protéine jouant un rôle physiologique dans l'agrégation des filaments de kératines de l'épiderme. Ces formes acides sont générées in situ par modification post-traductionnelle des résidus arginine basiques en résidus citrulline par une enzyme, la peptidyl arginine déiminase, exprimée dans l'épiderme. Cette modification a pu être reproduite in vitro après action de la peptidyl-arginine déiminase (PAD) sur divers polypeptides dérivés de la séquence de la filaggrine et il a été ainsi montré que les épitopes reconnus par les auto-anticorps pouvaient être générés par la déimination post-traductionnelle des filaggrines.<br /> Toutefois, la filaggrine n'étant pas exprimée dans les tissus osseux et synoviaux, nous avons recherché une cible articulaire de ces anticorps portant des épitopes déiminés et immunologiquement apparentée à la filaggrine. Ayant à disposition des tissus synoviaux provenant d'une série de patients, deux protéines, p55-61 et p64-78, portant toutes deux des résidus citrullines ont été extraites des membranes synoviales et reconnues spécifiquement par les sérums rhumatoïdes; ces protéines ont été identifiées aux chaînes a et b de la fibrine. Le fait que ces deux protéines ne soient ciblées par les sérums rhumatoïdes qu'après déimination par une PAD, soulignait soulignait le rôle émergent d'une « immunité anti-citrulline » reconnue aujourd'hui comme pouvant être à la base de certains dérèglements impliqués dans diverses maladies auto-immunes.<br /><br />2- Le système ubiquitine-protéasome et ses implications dans le cancer :<br /><br />Le protéasome est un complexe multicatalytique présent dans le cytoplasme et le noyau de toutes les cellules eucaryotes. Il constitue la machinerie protéolytique de la voie ubiquitine-protéasome, voie majeure responsable de la dégradation des protéines intracellulaires. Cette voie détermine la durée de vie et la concentration de nombreuses enzymes et protéines régulatrices dont beaucoup jouent un rôle dans les processus de cancérisation.<br /> Afin de mieux connaître le fonctionnement de cette machinerie protéolytique, nous avons étudié les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation du protéasome 20S qui constitue le cœur catalytique du système. L'analyse protéomique du protéasome 20S préparé à partir de cellules humaines non pathologiques a permis l'identification de l'ensemble des sous-unités constitutives du protéasome 20S et a révélé l'existence de modifications post-traductionnelles de type phosphorylation. Deux nouvelles sous-unités phosphorylées , les sous-unités b2 et b7, ont pu être identifiées posant ainsi la question du rôle joué par ces phosphorylations dans la régulation fonctionnelle du protéasome 20S. <br /> L'analyse similaire des protéasomes exprimés dans diverses lignées tumorales a révélé une complexité structurale importante avec en particulier la co-expression de deux formes de protéasomes : le protéasome dit standard et l'immunoprotéasome. L'étude fonctionnelle de ces protéasomes a montré une sensibilité différente de ces deux formes à certaines molécules de la chimiothèque de substances naturelles purifiées dans l'UMS de Chimie CNRS-Pierre Fabre. En accord avec ceci, l'analyse comparative des protéasomes présents dans les cellules normales comparées à ceux présents dans les cellules tumorales d'un même patient a confirmé la surexpression de l'immunoprotéasome dans les cellules cancéreuses. Le système ubiquitine-protéasome est un système cellulaire particulièrement sensible aux facteurs micro-environnementaux et l'induction de l'immunoprotéasome témoigne de ce processus. Dans ce contexte, nos résultats font émerger la question de l'impact de l'immunoprotéasome sur la dérégulation du système ubiquitine-protéasome dans la cellule tumorale. Afin de répondre à cette question, des lignées de lymphomes surexprimant l'immunoprotéasome ont été développées ainsi que des substrats peptidiques fluorescents spécifiques de l'immunoprotéasome ou du protéasome.<br />Outre une meilleure connaissance de cette machinerie protéolytique, la continuité de ce travail devrait aboutir à l'identification de nouveaux agents pharmacologiques anti-tumoraux. Enfin, il s'intègre pleinement dans la logique de l'UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre en témoignant d'un effort de recherche focalisé sur des systèmes biologiques pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs. / Systemic Sclerosis (SSc) is a devastating autoimmune disease of unknown etiology. Immune dysfunction, fibrosis and vasculopathy are the three major features of the disease; however, the interactions between these components are poorly understood. A novel link between autoimmunity and fibrosis has been proposed by the presence of stimulatory autoantibodies to the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) on fibroblasts. These autoantibodies were capable of stimulating reactive oxygen species and subsequent activation of ERK1/2. If the anti-PDGFR autoantibodies are present in the systemic circulation of SSc patients, they will most certainly encounter vascular smooth muscle cells (VSMCs). The latter are known to express the PDGFR and response to PDGF, which is a known phenotypic modulator of VSMCs. The work presented here seeks to readdress the presence of stimulatory anti-PDGFR autoantibodies in serum derived from SSc-patients and to characterize the effects of SSc-IgG on VSMCs by measuring the activation of specific signaling cascades and the induction of genes involved in fibrotic responses. Our results demonstrate the presence of an IgG fraction stimulating a phenotypic response in cultured VSMCs. Notably, a significant up-regulation of the pro-fibrotic gene tgfb1 and a significant down-regulation of the anti-fibrotic gene tgfb2 were observed in VSMC exposed to SSc-IgG fractions. Positive IgG fractions for ERK activation were present in most, but not all, SSc samples (68%, 19/28), and they were less present in controls (27%) (3/11). Although, the SSc-IgG fractions were able to significantly immunoprecipitate the PDGFR, the use of a selective PDGFR inhibitor, AG1296, did not inhibit the activation of ERK mediated by SSc-IgG fractions. Altogether, our findings suggest the presence of stimulatory autoantibodies with profibrotic activity in serum derived form SSc patients. Work is in progress to identify the molecular entity responsible for the IgG response observed in cultured VSMCs.

L’encéphalite limbique à auto-anticorps anti-CASPR2 est une atteinte du système nerveux central, caractérisée par la présence des auto-anticorps (autoAcs) dirigé contre CASPR2 dans le sérum et fluide céphalorachidien. La pathologie affecte majoritairement des hommes âgés présentant l’épilepsie comme symptôme prédominant. CASPR2 est une molécule d’adhésion neuronale, connue pour son rôle d’assemblage des canaux Kv1, régulateurs de l’excitabilité neuronale, à la région juxtaparanodale du nœud de Ranvier, une organisation essentielle pour la conduction saltatoire des flux nerveux. Un nombre croissant de données dans la littérature suggère un rôle pour CASPR2 dans des fonctions synaptiques et l’activité neuronale. Ceci pourrait expliquer l’épilepsie, un symptôme neurologique qui trouve son origine dans la perturbation de l’activité neuronale, observée chez les patients avec de l’encéphalite limbique anti-CASPR2. Dans ce travail de thèse, j’ai utilisé des autoAcs de patients comme outil pour investiguer le rôle de CASPR2 dans des neurones normalement développés en culture, permettant aussi d’évaluer l’effet des autoAcs des patients sur les fonctions synaptiques et de révéler des mécanismes physiopathologiques possibles sous-jacents à la maladie. Je me suis d’abord intéressée aux effets des autoAcs des patients sur l’expression et la distribution en surface de CASPR2 et sur l’expression des canaux Kv1.2 dans des neurones hippocampiques matures in vitro. J’ai montré que les neurones inhibiteurs sont positifs pour les canaux Kv1.2 et CASPR2 en surface, et que les autoAcs de patients augmentent l’expression de Kv1.2 et n’induisent pas l’internalisation de CASPR2. Dans un second temps, j’ai analysé les effets des autoAcs de patients sur les synapses excitatrices et inhibitrices dans des neurones hippocampiques immatures et matures in vitro. Dans les neurones immatures, la densité des épines dendritiques et le contenu des récepteurs AMPA sont augmentés, tandis que dans les neurones matures l’altération de la géphyrin suggère une perturbation de la transmission neuronale après traitement avec des autoAcs de patients. Mes résultats permettent de mieux comprendre les fonctions de CASPR2 dans les processus synaptiques et révèlent des mécanismes pathologiques possibles des autoAcs anti-CASPR2 menant à la présentation clinique des patients atteints d’encéphalite limbique anti-CASPR2 / Anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis is a central nervous system disorder, characterized by the presence of autoantibodies (autoAbs) directed against CASPR2 in the serum and cerebrospinal fluid. Elderly men are mostly affected, with epilepsy being the predominant symptom. CASPR2 is a neuronal cell adhesion molecule, known for its role in gathering Kv1 channels, regulators of neuronal excitability, at the juxtaparanodal region of the node of Ranvier, an essential organization for saltatory conduction of nervous influxes. Increasing sets of data in literature point out a role for CASPR2 in synaptic functions and neuronal activity. This could explain the observed epilepsy, a neurological symptom that finds its origin in disturbed neuronal activity, in patients with anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis. In this work, I used patients’ autoAbs as a tool to investigate the role of CASPR2 in normally developed cultured neurons which also allowed me to assess the effects of patients’ autoAbs on synaptic functions and reveal possible physiopathological mechanisms underlying the disease. I first assessed the effects of patients’ autoAbs on CASPR2 surface expression and distribution and on Kv1.2 channel expression in mature in vitro hippocampal neurons. I provided evidence that inhibitory neurons are positive for both Kv1.2 channels and surface CASPR2, and that patients’ autoAbs increase Kv1.2 expression and do not induce CASPR2 internalization. Secondly, I analyzed effects of patients’ autoAbs on excitatory and inhibitory synapses in vitro, in immature and mature hippocampal neurons. In immature neurons, dendritic spine densities and AMPA receptor content are increased, while in mature neurons alteration of gephyrin suggests disturbed neuronal transmission after treatment with patients’ autoAbs. My results allow for a better understanding of CASPR2 functions in synaptic processes and unravel possible pathological mechanisms regarding how anti-CASPR2 autoAbs lead to the clinical presentation of patients with anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis