Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.

Copper is one of the essential metal ions for aerobic organisms. Two well known functions of copper in the biological systems are electron transfer and molecular oxygen interaction. Thus, this metal can be found in haemocyanin, an oxygen carrier protein, and superoxide dismutase, an enzyme that involves in electron transfer. In addition, having a positive redox potential allows copper to be involved in redox chemistry. It is the redox properties of copper that are responsible for many important biochemical processes. Although the copper-containing oxidases have been well studied over the years, certain mechanistic details such as reaction intermediates remain to be elucidated. Several research groups have been trying to study this by trying to mimic the native systems, synthesizing bulky organic molecules with copper-binding and oxidative capabilities. However, these model systems are only applicable in organic solvents at low temperatures. In this study, three naturally occurring peptides, amyloid-ß, bacitracin, and histatin 5, have been shown to display the oxidative chemistry when complexed with CuII. A combination of spectroscopic (UV-Vis and NMR) and reactivity was used in studying their metal-binding properties as well as in elucidating their catalytic mechanism.

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos. / Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.

In mehrfaktoriellen 2 x 2 x 4 Untersuchungen im Zeitraum vom 7. - 28. Lebenstag und in Bilanzversuchen vom 15. - 20. Lebenstag mit männlichen Broilerküken (Cobb 500) wurden die Effekte der Versuchsfaktoren Zerkleinerung (Hammermühle vs. Walzenstuhl), thermische Behandlung (Konditionierung bei 70°C vs. Konditionierung/Expandierung 100°C) und Zusätze von Zink-Bacitracin bzw. Roxazym G2 (ohne Zusatz, mit Zink-Bacitracin 50 mg, mit Roxayzm G2 150 ppm und deren Zusatzkombination A+E) sowie die Interaktionen untersucht. Als Kriterien dienten die Parameter Futterverzehr, Lebendmassezunahme, Futteraufwand, Nährstoffansatz und -verwertung, ileale Verdaulichkeit von ausgewählten Aminosäuren, Proteinverwertung/Proteinqualität und Umsetzbarkeit der Energie. Die Versuchstiere erhielten ab dem 7. Lebenstag die entsprechenden Versuchsmischungen. Der Gehalt an XP und MEn aller Versuchsmischungen war einheitlich (XP 21,7% und MEn 12,3 MJ/kg Futter). Die Lysinversorgung wurde auf 90 % unter der optimalen Bedarfsdeckung in allen Futtermischungen limitiert. Die Auswirkungen der Versuchsfaktoren lassen sich wie folgt zusammenfassen: - Zerkleinerung : Die Zerkleinerungstechnologie mit dem Walzenstuhl übte einen signifikanten Einfluss auf den Futterverzehr (-3,5 %) und Futteraufwand (-2,8 %) gegenüber der Zerkleinerung mit der Hammermühle aus. Die Nährstoffverwertung (XP und Energie) zeigten durch Walzenstuhl-Zerkleinerung tendenzielle Verbesserungen. Die ileale Lysinverdaulichkeit blieb unverändert, die ileale Verdaulichkeit von Threonin und Met+Cys wurde signifikant erhöht. Die Walzenstuhl-Zerkleinerung führte zu einer besseren Futterstruktur und zu einer höheren Nährstoffdichte in den Pellets. Das wird deutlich durch die höhere N-Aufnahme bzw. N-Bilanz sowie durch gesteigerte N-Verwertungsparameter und einen erhöhten Gehalt an N-korrigierter umsetzbarer Energie (MEn). - Thermische Behandlung : Durch erhöhte Hitzeapplikation mit dem Expander konnten in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der Leistungsparameter, Nährstoffansatz und -verwertung keine Unterschiede gegenüber der Konditionierung festgestellt werden. Die Expandierung führte zu einer signifikant erhöhten ilealen Lysinverdaulichkeit, die durch die gemessene Lysinwirksamkeit im Bilanzversuch jedoch nicht widergespiegelt wurde. Auch signifikant niedrigere N-Bilanz und physiologische Proteinnutzwerte (PNu) sowie die tendenzielle Verringerung der N-Verdaulichkeit und des Gehaltes an umsetzbarer Energie deuten auf eine negative Wirkung der intensiveren thermischen Behandlung durch Expandieren hin. Hierzu sind weitere klärende Untersuchungen notwendig. - Futterzusätze: Durch die alleinige Supplementierung mit dem Antibiotikum Zink-Bacitracin oder NSP-spaltenden Enzym Roxazym G2 bzw. deren Kombination reagierten Mastleistung und Futterverwertung signifikant positiv. Während der Effekt der Enzymzulagen bei Nährstoffverwertung und ilealer Verdaulichkeit ausgewählter Aminosäure signifikant höher gegenüber der unsupplementierten Gruppe war, blieb ein Effekt von Zink-Bacitracin hinsichtlich dieser Parameter aus. Der Effekt der Zusatzkombination war bei Mastleistung, Nährstoffansatz und -verwertung und bei der ilealen Verdaulichkeit der ausgewählten Aminosäuren gegenüber der Kontrolle oder dem alleinigen Zusatz signifikant höher. Das deutet auf einen synergistischen Effekt der gleichzeitigen Applikation der beiden Additive hin. Die N-Verwertung einschließlich des Gehalts an N-korrigierter scheinbar umsetzbarer Energie lag nach alleiniger Applikation von Zink-Bacitracin unerwartet signifikant niedriger gegenüber den anderen Zusätzen bzw. tendenziell gegenüber der Kontrolle. Die Gehalte an scheinbar umsetzbarer Energie (AMEn) waren deutlich durch den Enzymzusatz allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin erhöht. -Interaktionen: Die Abhängigkeit der Versuchsfaktoren voneinander im Mastversuch war nicht stark ausgeprägt. Die Zerkleinerung in Verbindung mit anschließender thermischer Behandlung führte zur Beeinflussung der Futterverzehrsdaten. Danach verbesserten die Verfahrenskombinationen Hammermühle x Konditionierung oder Walzenstuhl x Expandierung bedingt durch einen erhöhten Futterverzehr die Lebendmassezunahme und den Nährstoffansatz signifikant. Hinsichtlich der ilealen Aminosäurenverdaulichkeit zeigten die Futterzusätze eine Abhängigkeit von der Behandlung bzw. Zerkleinerung und Behandlung. Die Enzymzulage allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin zeigte stärkere Effektivität in Verbindung mit der thermischen Behandlung durch Expandieren.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

A presença de antibióticos no ecossistema representa um sério risco à saúde humana e animal em virtude do desenvolvimento crescente de resistência bacteriana. Uma vez que a maioria dos antibióticos é persistente à degradação biológica, os processos oxidativos avançados são apontados como uma das tecnologias mais efetivas para decompor esses compostos em águas residuárias. A bacitracina zíncica (Bc-Zn) é um potente antibiótico constituído por uma mistura complexa de peptídeos não-biodegradáveis, conjugados ao zinco. Apesar de ser um antibiótico amplamente consumido na medicina humana e animal, é preocupante a escassez de estudos que investigam sua degradação e destino ambiental. O presente trabalho analisou a degradação da Bc-Zn através dos processos de fotólise direta e UV/H2O2 em diferentes condições de radiação UVC e concentração inicial de H2O2. Os parâmetros cinéticos rendimento quântico da fotólise, constantes cinéticas de pseudo-primeira ordem e constante cinéticas de segunda ordem foram satisfatoriamente estimados pela modelagem do sistema fotoquímico experimental. Os resultados revelaram que a fotólise direta permitiu degradar todos os congêneres da mistura de Bc-Zn nas maiores doses de radiação UVC empregadas. No entanto, não houve remoção de TOC após 120 minutos de irradiação. A adição de H2O2 acelerou substancialmente a fotodegradação do antibiótico, apresentando constantes cinéticas de pseudo-primeira ordem uma ordem de grandeza superiores às obtidas por fotólise direta. Além disso, remoção considerável de até 71% do TOC foi alcançada. A análise estatística demonstrou que a radiação UV foi um fator bem mais significativo para a fotodegradação da Bc-Zn em relação à concentração inicial de H2O2, sendo as melhores condições do processo alcançadas para a maior taxa específica de emissão de fótons (1,11×10-5 Einstein L-1 s-1). Ensaios biológicos com soluções tratadas por fotólise direta e UV/H2O2 indicaram remoção completa da atividade antimicrobiana residual, ainda que os produtos da fotodegradação tenham se mostrado não-biodegradáveis. Análises de toxicidade indicaram que o metal zinco presente no antibiótico é responsável pela a toxicidade no micro-organismo-teste Vibrio fischeri. Estudos adicionais devem ser realizados para identificar os sub-produtos formados, bem como para investigar a degradação da Bc-Zn em efluentes industriais reais. / The presence of antibiotics in ecosystems represents a serious risk to human and animal health, caused by the increase in bacterial resistance. Since most antibiotics resist to biological degradation, advanced oxidation processes are pointed out as the most effective technologies for degrading these compounds in wastewater. Zinc bacitracin (Bc-Zn) is a potent antibiotic with a complex mixture of non-biodegradable peptides conjugated to zinc. Despite being a widely used antibiotic in human and animal medicine, the scarcity of studies dealing with its degradation and environmental fate is a matter of concern. In this work, Bc-Zn degradation by direct photolysis and the UV/H2O2 process was investigated for different UVC radiation conditions and initial H2O2 concentrations. Kinetic parameters, namely the photolysis quantum yield, pseudo-first order kinetic constants and second-order kinetic constants, were satisfactorily estimated from experimental data by modeling the photochemical system. The results showed that all the congeners of the Bc-Zn mixture were photolyzed at the highest UVC doses applied, while no TOC removal was observed after 120 minutes of irradiation. The addition of H2O2 substantially accelerated Bc-Zn photodegradation, with pseudo-first order kinetic constants of one order of magnitude higher than those observed under direct photolysis. In addition, a remarkable removal of up to 71% of TOC was achieved. Statistical analyses showed that UV radiation had a much more important effect on Bc-Zn photodegradation in comparison with initial H2O2 concentration, with the best process conditions achieved for the highest specific photon emission rate (1.11×10-5 Einstein L-1 s-1). Biological assays carried out with the solutions treated by direct photolysis and UV/H2O2 revealed no residual antimicrobial activity, though photodegradation products remained non-biodegradable. In addition, toxicity analyses indicated that the zinc metal present in the antibiotic is responsible for the toxic effect on the test microorganism Vibrio fischeri. Finally, further studies should be performed to identify the by-products formed and to investigate Bc-Zn degradation in real industrial wastewater.

A presença de antibióticos no ecossistema representa um sério risco à saúde humana e animal em virtude do desenvolvimento crescente de resistência bacteriana. Uma vez que a maioria dos antibióticos é persistente à degradação biológica, os processos oxidativos avançados são apontados como uma das tecnologias mais efetivas para decompor esses compostos em águas residuárias. A bacitracina zíncica (Bc-Zn) é um potente antibiótico constituído por uma mistura complexa de peptídeos não-biodegradáveis, conjugados ao zinco. Apesar de ser um antibiótico amplamente consumido na medicina humana e animal, é preocupante a escassez de estudos que investigam sua degradação e destino ambiental. O presente trabalho analisou a degradação da Bc-Zn através dos processos de fotólise direta e UV/H2O2 em diferentes condições de radiação UVC e concentração inicial de H2O2. Os parâmetros cinéticos rendimento quântico da fotólise, constantes cinéticas de pseudo-primeira ordem e constante cinéticas de segunda ordem foram satisfatoriamente estimados pela modelagem do sistema fotoquímico experimental. Os resultados revelaram que a fotólise direta permitiu degradar todos os congêneres da mistura de Bc-Zn nas maiores doses de radiação UVC empregadas. No entanto, não houve remoção de TOC após 120 minutos de irradiação. A adição de H2O2 acelerou substancialmente a fotodegradação do antibiótico, apresentando constantes cinéticas de pseudo-primeira ordem uma ordem de grandeza superiores às obtidas por fotólise direta. Além disso, remoção considerável de até 71% do TOC foi alcançada. A análise estatística demonstrou que a radiação UV foi um fator bem mais significativo para a fotodegradação da Bc-Zn em relação à concentração inicial de H2O2, sendo as melhores condições do processo alcançadas para a maior taxa específica de emissão de fótons (1,11×10-5 Einstein L-1 s-1). Ensaios biológicos com soluções tratadas por fotólise direta e UV/H2O2 indicaram remoção completa da atividade antimicrobiana residual, ainda que os produtos da fotodegradação tenham se mostrado não-biodegradáveis. Análises de toxicidade indicaram que o metal zinco presente no antibiótico é responsável pela a toxicidade no micro-organismo-teste Vibrio fischeri. Estudos adicionais devem ser realizados para identificar os sub-produtos formados, bem como para investigar a degradação da Bc-Zn em efluentes industriais reais. / The presence of antibiotics in ecosystems represents a serious risk to human and animal health, caused by the increase in bacterial resistance. Since most antibiotics resist to biological degradation, advanced oxidation processes are pointed out as the most effective technologies for degrading these compounds in wastewater. Zinc bacitracin (Bc-Zn) is a potent antibiotic with a complex mixture of non-biodegradable peptides conjugated to zinc. Despite being a widely used antibiotic in human and animal medicine, the scarcity of studies dealing with its degradation and environmental fate is a matter of concern. In this work, Bc-Zn degradation by direct photolysis and the UV/H2O2 process was investigated for different UVC radiation conditions and initial H2O2 concentrations. Kinetic parameters, namely the photolysis quantum yield, pseudo-first order kinetic constants and second-order kinetic constants, were satisfactorily estimated from experimental data by modeling the photochemical system. The results showed that all the congeners of the Bc-Zn mixture were photolyzed at the highest UVC doses applied, while no TOC removal was observed after 120 minutes of irradiation. The addition of H2O2 substantially accelerated Bc-Zn photodegradation, with pseudo-first order kinetic constants of one order of magnitude higher than those observed under direct photolysis. In addition, a remarkable removal of up to 71% of TOC was achieved. Statistical analyses showed that UV radiation had a much more important effect on Bc-Zn photodegradation in comparison with initial H2O2 concentration, with the best process conditions achieved for the highest specific photon emission rate (1.11×10-5 Einstein L-1 s-1). Biological assays carried out with the solutions treated by direct photolysis and UV/H2O2 revealed no residual antimicrobial activity, though photodegradation products remained non-biodegradable. In addition, toxicity analyses indicated that the zinc metal present in the antibiotic is responsible for the toxic effect on the test microorganism Vibrio fischeri. Finally, further studies should be performed to identify the by-products formed and to investigate Bc-Zn degradation in real industrial wastewater.