Submitted by Luciana de Cenço Correa Lacerda (lulacerda2@yahoo.com.br) on 2018-06-21T19:31:05Z No. of bitstreams: 1 TESE Luciana 21.06.18 PRONTA.pdf: 1525467 bytes, checksum: a6d6df3286d60500baf769d3035234e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-25T18:40:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lacerda_lcc_dr_jabo.pdf: 1525467 bytes, checksum: a6d6df3286d60500baf769d3035234e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-25T18:40:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lacerda_lcc_dr_jabo.pdf: 1525467 bytes, checksum: a6d6df3286d60500baf769d3035234e1 (MD5) Previous issue date: 2018-05-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Lesões na pele podem resultar em feridas que, dependendo do tempo de reparação tissular podem ser classificadas como agudas ou crônicas, sendo crônicas aquelas que não apresentaram cicatrização dentro do período de quatro semanas. A ferida é contaminada por diferentes espécies bacterianas, sendo o sistema imunológico da pele o responsável por impedir que tais contaminações evoluam para infecções. No entanto, muitas vezes o quadro infeccioso é instalado, havendo necessidade de tratamento com antimicrobianos. Tendo em vista que o mau uso de antimicrobianos provoca resistência a multidrogas em estirpes bacterianas potencialmente patogênicas, este trabalho teve como objetivo identificar as bactérias prevalentes em feridas agudas e crônicas de cães por meio de sequenciamento da região 16S rRNA e testar a sensibilidade dos isolados a diferentes antimicrobianos. Para tanto, foram amostradas 20 feridas, sendo cada uma de um cão atendido no Hospital Veterinário da UNESP, Câmpus de Jaboticabal. De cada ferida foram obtidos dez isolados, os quais foram selecionados para o sequenciamento de DNA por meio de comparação entre os perfis genéticos obtidos pelo emprego de marcador molecular randômico. Foram sequenciados 74 isolados identificados como pertencentes a oito gêneros de bactérias gram-negativas, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella spp., Kluyvera georgiana e Providencia stuartii, e três de gram-positivas, Enterococcus sp., Staphylococcus spp. e Bacillus spp. Casos de cães com feridas agudas ou crônicas, associadas a mais de um gênero bacteriano, foram de 85,7% e 30,7%, respectivamente. Isolados da espécie S. aureus apresentaram amplificação para quatro genes codificadores das enterotoxinas sea, seh, see e hlg, enquanto um isolado de B. cereus foi positivo para a presença dos genes hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC e entFM. Dois dos isolados de E. coli (6%) apresentaram o gene blaCTX-M-2 e provaram ser resistentes à cefotaxima, um antibiótico do grupo dos β-lactâmicos. Todos os isolados avaliados apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos testados, sendo metronidazol, cefalexina e cefazolina, aqueles pelos quais os isolados mostraram maior resistência. Cinco pacientes que estavam sob antibioticoterapia no momento da coleta possuíam estirpes resistentes aos antimicrobianos pelos quais estavam sendo tratados. Tendo em vista que há uma grande diversidade bacteriana resistente à multidrogas colonizando feridas cutâneas agudas e crônicas de cães, a implantação de antibiogramas previamente à recomendação de antimicrobianos é prática imprescindível e deve ser implantada para preservação da saúde animal e, consequentemente, pública. / Skin lesions can result in cutaneous wounds that may be classified as acute or chronic depending on the period of time spent in tissue repairment. Wounds that have not healed within four weeks are generally classified as chronic. The wound is contaminated by different bacterial species and the immune system of the skin is responsible for preventing infections. Nonetheless, the infectious process is often developed and antimicrobial treatment become necessary. Considering that the misuse of antimicrobials provokes multidrug resistance in potentially pathogenic bacterial strains, this work aimed to identify prevalent bacteria in acute and chronic wounds of dogs by 16S rRNA sequencing and to test the sensitivity of the isolates to different antimicrobials. For that, 20 wounds were sampled, each one from a dog admitted at the Veterinary Hospital of UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brazil. From each wound ten isolates were obtained, which were selected for DNA sequencing through genetic profiles comparison by applying a random molecular marker. Seventy-five isolates were identified as belonging to eight Gram-negative bacteria genera, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella spp., Kluyvera georgiana and Providencia stuartii, and to three gram-positive bacteria genera, Enterococcus sp., Staphylococcus spp. and Bacillus spp. Cases of dogs with acute or chronic wounds associated to more than one bacterial genus were 85.7% and 30.7%, respectively. Staphylococcus aureus isolates presented amplification to four enterotoxin encoding the genes sea, seh, see and hlg, whereas a B. cereus isolate was positive for hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC and entFM genes. Two of the E. coli isolates (6%) presented the blaCTX-M-2 gene and proved to be resistant to cefotaxime, a β-lactam antibiotic. All isolates evaluated were resistant to at least one of the antimicrobials tested, being metronidazole, cephalexin and cefazolin the ones for those the isolates showed to be more resistant. Five patients undergoing antibiotic therapy at the same period of sampling presented resistants bacterial strains to the antibiotics by which the patients were being treated. Considering that there is great multidrug resistant bacterial diversity colonizing acute and chronic cutaneous wounds of dogs, the implantation of antibiograms prior to the antimicrobials recommendation is a practice to be implemented in order to preserve animal and, consequently, public health.

Orientador: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: Atualmente, estamos diante de uma notável presença de isolados de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos em um hospital público do município de Bauru-SP desde outubro de 2012. No entanto, não estão disponíveis estudos relacionando a epidemiologia e os fatores associados à aquisição de tais isolados. Este estudo teve como objetivo identificar fatores de risco para aquisição de Enterobactérias Resistentes aos Carbapenêmicos (CRE) em pacientes internados no Hospital Estadual Bauru, os fatores associados ao desenvolvimento de quadro infeccioso em uma coorte de pacientes colonizados por CRE e os fatores preditores de óbito. Foram incluídos pacientes do local de estudo que apresentaram colonização do trato digestório por CRE, de outubro de 2012 a dezembro de 2016, dos quais foram levantados dados clínicos e demográficos. Os isolados foram identificados por métodos fenotípicos e foram testadas as suscetibilidades por concentração inibitória mínima (MIC). Realizamos um estudo de caso-controle que incluiu 427 casos e igual número de controles. Os fatores de risco observados foram queimadura (HR 3,91; IC95% 2,36-6,46; p=<0,001), índice de Charlson (HR 1,12; IC95% 1,05-1,20; p=<0,001), uso prévio de esteróides (HR 2,79; IC95% 1,94-4,02; p=<0,001) e antimicrobianos como as penicilinas/inibidores de beta-lactamases (HR 2,01; IC95% 1,43-2,82; p=<0,001), cefalosporinas de 3ª. e 4ª. gerações (HR 2,45; IC95% 1,75-3,44; p=<0,001), quinolonas (HR 1,70; IC95% 1,75-2,45; p=0,003) e anaero... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Currently, we are facing a remarkable presence of isolates of carbapenem-resistant enterobacteriacea in Bauru city public hospital, São Paulo state, Brazil, since october 2012. However no studies are available relating the epidemiology and the factors associated with acquisition of such isolates. The purpose this study was to identify risk factors for acquisition of Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae in patients hospitalized at the Bauru State Hospital, factors associated with the development of infectious disease in a cohort of patients colonized by CLP and factors predicting death. We included patients from the study site who presented colonization of the digestive tract by CRE, from October 2012 to December 2016, from which clinical and demographic data were collected. Isolates were identified by phenotypic methods and susceptibilities were tested by minimum inhibitory concentration (MIC). We performed a case-control study that included 427 cases and an equal number of controls. The risk factors observed were burn (HR 3.91, 95% CI 2.36-6.46, p = 0.001), Charlson index (HR 1.12, 95% CI 1.05-1.20, p = <0.001), previous use of steroids (HR 2.79, 95% CI 1.94-4.02, p = <0.001) and antimicrobials such as penicillins / beta-lactamase inhibitors (HR 2.01, 95% CI, 43-2.82, p = <0.001), cephalosporins of 3rd. and 4ª. (HR 2.45, IC 95% 1.75-3.44, p = 0.001), quinolones (HR 1.70, IC 95% 1.75-2.45, p = 0.003) and anaerobicides (HR 1, 63, 95% CI 1.04-2.56, p = 0.03). The cohort stud... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo não disponível.

Resumo não disponível.

As bactérias contendo este elemento de mobilidade genética podem contribuir para a disseminação de determinantes de resistência, bem como servir de reservatório em potencial para estes genes. / Pseudomonas genus, widely distributed in the environment, is often found associated to determinants of beta-lactams resistance and presence of integrons. The present study was conducted to investigate the resistance profile of Pseudomonas spp strains isolated from untreated hospital effluents, likewise beta-lactamase genes and integrons. Untreated hospital effluents were collected from four hospitals in Porto Alegre, RS. Non-fermenter bacteria were isolated; the identification was confirmed by 16S rRNA PCR. Susceptibility testing was determined by the disk-diffusion method using 11 different betalactams antimicrobials. The beta-lactamase genes blaIMP, blaVIM, blaSPM-1, blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like and blaGES-like genes and the integrons genes intI1, intI2 and intI3 were determined by PCR using specific primers. One hundred and twenty-eight isolates were recovered; the most common species was P. pseudoalcaligenes. The resistance level found was considered high, 62 (50%) isolates were multi-resistants. No isolate carrying the beta-lactamase genes tested was found among the strains. Of 68 isolates considered positives for integrons, 52 were identified as carrying the class 1 integron gene, intI1. No isolate carrying class 1 or class 2 integrons was found among the strains. Untreated hospital effluents could be a source of environmental contamination due to discharge of antimicrobial resistant bacteria, in the case of the present study, also integron positives. Bacteria carrying this genetic mobile element can contribute for the dissemination of resistance determinants and also act like a potential reservoir for many types of resistance genes.

O objetivo do presente estudo foi verificar a influência de diferentes pontos de risco de contaminação bacteriana durante a coleta do ejaculado suíno e seus efeitos sobre a qualidade da dose inseminante (DI). O experimento foi realizado em quatro centros de difusão genética (CDG), nos quais as coletas dos ejaculados foram observadas buscando possíveis pontos de risco de contaminação. Posteriormente, o sêmen in natura e 2 DIs, provenientes da coleta observada, foram avaliados no que se refere à quantificação bacteriana, morfologia e motilidade espermática e pH. Além do ejaculado, amostras de água e diluente foram avaliadas quanto ao número de unidades formadoras de colônia (UFC). Pêlos prepuciais compridos (>1,0 cm), a higiene da luva de coleta, líquido pingando pela mão do coletador para o interior do recipiente de coleta e a duração da coleta foram os 4, dentre os 12 fatores avaliados, que levaram a um aumento no percentual de ejaculados com valor superior a 220 UFC mL-1 de mesófilos aeróbios (P<0,05). Foi avaliado o efeito isolado ou associado de sete fatores (reprodutor sujo, óstio prepucial sujo, divertículo prepucial grande, pêlos prepuciais compridos, luva de coleta suja, pingos pela mão do coletador para dentro do recipiente de coleta e pênis escapou durante a coleta) que pudessem resultar diretamente na contaminação do ejaculado. Houve aumento significativo do número de ejaculados com contaminação superior a 220 UFC mL-1, a partir da associação de 2 fatores, quando comparados aos ejaculados obtidos em coletas sem nenhum fator predisponente para contaminação. Ao classificar as DIs conforme o grau de contaminação do diluente foram observadas redução na motilidade e no pH e aumento nas alterações de acrossoma das DIs, ao longo das 168 horas de armazenamento, no grupo cujo grau de contaminação do diluente foi superior a 14000 UFC mL-1 versus o grupo com contaminação inferior a 330 UFC mL-1. Doses inseminantes provenientes de ejaculados mais contaminados apresentaram maior grau de contaminação bacteriana. Aparentemente, quando o ejaculado é coletado com um protocolo de contaminação mínima, dificilmente seu grau de contaminação será capaz de produzir efeitos deletérios na qualidade da DI, exceto quando a origem da contaminação for proveniente de falhas higiênicas na linha de processamento das mesmas. A produção de DIs com alta qualidade do ponto de vista bacteriano, somente será possível com um rigoroso controle higiênico na linha de processamento, principalmente no que diz respeito à água e ao diluente, associados a um protocolo de contaminação mínima durante a coleta. / The aim of this study was to check the influence of different risk of factors for bacterial contamination during the collection of ejaculate and the effects in boar extended semen quality. The experiment was conducted in four boar studs, where semen collection was observed, searching for possible risk of factors for bacterial contamination. The ejaculate and two extended semen doses, deriving from the observed collection, were evaluated in regard to numbers of colony-forming units (CFU), sperm morphology and motility, and pH. Water and extender samples were also evaluated for CFU. Long preputial hair (>1 cm), the hygiene of the collection glove, liquid trickling from the hand of the technician into the semen container and the duration of the collection were the four, from twelve factors evaluated, that lead to an increase in the percentage of ejaculates with more than 220 CFU mL-1 of aerobic mesophiles (P<0.05). The isolated or combined effect of seven factors (bad hygiene of boars, dirty preputial ostium, large preputial diverticulum, long preputial hair, dirty collecting glove, liquid trickling from the hand of the technician into the semen container and escape penis during the collection), that could directly result in the contamination of ejaculates was evaluated. There was a significant increase in the number of ejaculates contaminated with more than 220 CFU mL-1 when two or more factors were associated, compared to ejaculates obtained from collections without any predisponent factors. When the extended semen doses were classified according to the degree of contamination of the extender, a decrease in motility and pH and an increase on acrosome alterations in extended semen, during 168 hours of storage, were verified in the group where the degree of contamination was higher than 14,000 CFU mL-1 versus the group with lower than 330 CFU mL-1. Extended semen derived from more contaminated ejaculates showed a higher degree of bacterial contamination. Apparently, when the ejaculate was collected with minimum contamination protocol, its degree of contamination will hardly be able to produce effects in the extended semen quality, unless when the source of contamination was hygienic failure in the processing. The production of semen extended with high quality in the bacterial point of view will only be possible with a strict hygienic control in the processing, mostly in respect to water and extender, associated with minimum contamination protocol during the collection.

La vaginosis bacteriana (VB) es actualmente una de las causas más comunes de infección vaginal en mujeres en edad fértil, sin embargo, poco es lo que se sabe sobre su historia natural y las causas que la generan. En este sentido, se realizó un estudio analítico descriptivo, retrospectivo del tipo casocontrol para determinar los factores de riesgo asociados a la vaginosis bacteriana (VB) en pacientes atendidas en la clínica Good Hope. Utilizando la puntuación de Nugent se analizaron las muestras de secreción vaginal de las pacientes atendidas en la clínica durante el periodo julio–octubre de 2017. De las 673 muestras analizadas, el 61,1% de pacientes presentaban una microbiota normal y el 18,4% presentaban VB, a partir de estos dos grupos se seleccionaron aleatoriamente 60 pacientes con VB para conformar el grupo de los casos y 120 pacientes sin VB para el grupo de los controles. A partir de la historia clínica se colectaron en una ficha los datos clínicos y demográficos de cada paciente. Estos datos fueron procesados y por medio del análisis bivariado y multivariado, donde se evaluó el riesgo y grado de asociación con la VB. No se encontró diferencias significativas en cuanto a la edad en ambos grupos; en cuanto a la residencia, los distritos de Santiago de Surco y Cercado de Lima fueron los más prevalentes para el grupo de los casos y de los controles respectivamente. Tras el análisis estadístico los factores: estado de gestación (OR= 0,483, IC= 0,244–0,955, p=0,036) y el antecedente de Candidiasis (OR= 3,651 IC= 1,055–12,630, p=0,041) tuvieron significancia estadística como factor protector y de riesgo para la VB, respectivamente. / Tesis

Las estrategias biotecnológicas presentan un alto potencial para el control de plagas de insectos; una de ellas, es el silenciamiento de genes mediado por ARN de interferencia (ARNi), que se aplica contra genes importantes en la viabilidad del insecto. Entre las principales ventajas, se menciona, su uso como alternativa de los pesticidas, además de poder desarrollarse para un ataque específico contra la especie blanco. Para una futura implementación en campo, se debe contar con una serie de pasos técnicos estandarizados, entre los cuales involucra la producción de ARN de doble cadena (ARNdc), que es la molécula inductora del mecanismo de ARNi. En este trabajo se presenta una metodología de clonación de genes para la síntesis de ARNdc en bacterias a partir de secuencias de genes del insecto Prodiplosis longifila Gagné, plaga principal de los cultivos de espárrago en el Perú. Se utiliza la técnica TA cloning, en la que se aprovecha la actividad transferasa terminal de la enzima polimerasa de Thermus aquaticus para modificar los productos de PCR. El vector modificado para esta técnica se obtuvo a partir del vector LITMUS 38i, al que se linearizó y se le agregó un nucleótido de timina. Los resultados muestran que la metodología permitió clonar, en corto tiempo, secuencias provenientes de 18 genes del insecto, resultando así en una metodología conveniente para su uso en la producción de ARNdc en estrategias de ARNi. / Tesis

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi caracterizar a identificacao, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, a similaridade genetica e os mecanismos de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol (SXT) entre os isolados clinicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram avaliados 82 isolados clinicos do CBc recuperados de pacientes atendidos em dois hospitais universitarios localizados na regiao sudeste do Brasil. A identificacao bacteriana foi realizada pelo sequenciamento do gene recA e pela espectrometria de massas MALDI-TOF MS. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado para ceftazidima, cloranfenicol, levofloxacina, meropenem, minociclina, ticarcilina/acido clavulanico e SXT. Os resultados do perfil de sensibilidade tambem foram comparados entre quatro tecnicas distintas, microdiluicao em caldo, diluicao em agar, Etest e disco difusao, sendo a microdiluicao em caldo considerada a tecnica referencia. A concordancia geral e por categoria de sensibilidade, assim como as taxas de erros, foram calculadas de acordo com as recomendacoes do CLSI M23-A3. Os genes que conferem resistencia aos betalactamicos e ao SXT foram pesquisados por meio das tecnicas de PCR e sequenciamento dos respectivos amplicons. A similaridade genetica entre os isolados que carreavam genes de resistencia foi determinada por PFGE. O DNA plasmidial e cromossomal dos isolados foram extraidos utilizando as tecnicas de Kieser e kits comerciais, respectivamente. A localizacao dos genes de resistencia foi determinada por Southern blot e hibridizacao utilizando sondas especificas. O contexto genetico dos genes de resistencia encontrados entre os isolados do CBc foi determinado por PCR e sequenciamento das regioes conservadas 3ÆCS e 5ÆCS do integron de classe 1. A tecnica de conjugacao foi realizada utilizando como amostra receptora E.coli J53. Resultados: Foram identificadas, pelo sequenciamento do gene recA, B. cenocepacia (n=44), B. multivorans (n=12), B. vietnamiensis (n=10), B. contaminans (n=9) e B. cepacia (n=7). Comparando os resultados obtidos pelo recA com aqueles do MALDI-TOF MS, 100% e 75,6% dos isolados foram concordantes na identificacao ao nivel de genero e especie, respectivamente. Boas taxas de sensibilidade foram encontradas para ceftazidima (86,6%), meropenem (87,8%), minociclina (87,8%) e SXT (97,6%). A concordancia geral entre as tecnicas avaliadas foi maior que 93% entre microdiluicao em caldo e diluicao em agar, exceto para cloranfenicol (89%). Entre a tecnica referencia e os resultados obtidos pelo Etest, a concordancia geral foi maior que 92%, exceto para ceftazidima (78%), SXT (80,4%) e cloranfenicol (85,3%). A concordancia por categoria entre microdiluicao em caldo e disco difusao foi maior que 90% para a maioria dos antimicrobianos testados, exceto para cloranfenicol (52,4%), SXT (74,4%) e levofloxacina (83,3%). Dois isolados (B. cenocepacia e B. cepacia) apresentaram resistencia ao SXT e carreavam o gene dhfr22 inserido em um integron que classe 1. Entre os isolados resistentes a ceftazidima (7,3%), em apenas um (B. cenocepacia) foi detectado o gene blaOXA-10-like, tambem inserido em um integron de classe 1 o qual continha um gene cassete que confere resistencia aos aminoglicosideos, aadA1. De acordo com os resultados da hibridizacao, blaOXA-10-like estava inserido em um plasmideo de ~70 Kb. Entretanto, nao conseguimos realizar a transferencia deste plasmideo pela tecnica de conjugacao. Os dois isolados de B. cenocepacia que carreavam genes de resistencia apresentaram perfil clonal semelhante pelo PFGE. Conclusoes: O MALDI-TOF MS demonstrou ser uma excelente tecnica alternativa para a identificacao dos isolados do CBc. Boas taxas de sensibilidade foram observadas para os antimicrobianos usualmente empregados no tratamento das infeccoes causadas por estes micro-organismos. Em geral, foi observada boa concordancia entre as tecnicas de sensibilidade avaliadas neste estudo, exceto para as metodologias Etest e disco difusao na predicao da sensibilidade ao SXT. O gene dhfr22 demonstrou ser o principal mecanismo entre os isolados resistentes ao SXT. De acordo com os nossos conhecimentos, descrevemos, pela primeira vez, a presenca do gene blaOXA-10-like em um isolado clinico do CBc / FAPESP: 2012/04910-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:21Z : No. of bitstreams: 1 Publico-178.pdf: 625763 bytes, checksum: bd311a8cd3f7ff010bc833233dd4c82b (MD5) / Objetivo: Desenvolvimento e aplicação de protocolos de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real para a detecção bacteriana e classificação de Gram em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com suspeita clínica de endoftalmite. Métodos: Especificidade analítica foi estabelecida utilizando 31 microrganismos clinicamente importantes, 20 gram-positivos e 11 gram-negativos. Reação cruzada com DNA humano e DNA fúngico foi testada. Amostras controles de humor aquoso coletadas após facoemulsificação foram incluídas. Sensibilidade analítica para as metodologias de PCR foram determinadas utilizando diluição seriada 1:10 de DNA extraído de S. epidermidis e E. coli. As técnicas foram posteriormente aplicadas e testadas em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de endoftalmite. Preparações comerciais de Taq DNA polimerase foram pré-tratadas com DNaseI. Resultados: Amplificação genérica do gene 16S rDNA foi positiva para todos os isolados bacterianos. Classificação de Gram pela técnica de Nested Multiplex PCR não foi possível apenas para isolados de Acinetobacter spp. Utilizando PCR Multiplex em Tempo Real, todos os isolados foram classificados por Gram, sendo que P. acnes exibiu um padrão misto de amplificação. Limite de detecção da metodologia de Nested Multiplex PCR foi de 1 fg/μl para S. epidermidis e E.coli. A sensibilidade de detecção para S. epidermidis e E. coli utilizando reação para detecção universal bacteriana por PCR em Tempo Real com SYBR Green foi de 100 fg/μl (E = 0,82 e 0,86; r2 = 0,99) e 1 pg/μl utilizando metodologia de PCR Multiplex em Tempo Real com Sondas TaqMan (E = 0,66 e 0,77; r2 = 0,99). A positividade da cultura para detecção bacteriana a partir de amostras de humor aquoso e vítreo foi de 47,6% e pelas metodologias de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real foi de 100% e 95,2% respectivamente. Entre as amostras negativas por cultura (n=10), a metodologia de Nested Multiplex PCR foi positiva para todas (100%) e PCR em Tempo Real em 90% dos casos (9/10). Entretanto, a proporção de falso-positivos pela metodologia de Nested Multiplex PCR (65,4%) foi superior aos valores obtidos por PCR em Tempo Real (7,7%). A classificação de gram foi obtida em 88,8% dos casos por Nested PCR e 100% por PCR em Tempo Real. A correlação entre a identificação clássica e classificação de Gram molecular foi 63,6% para ambas as técnicas. A identificação pelo sequenciamento dos produtos obtidos por Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real apresentou correlação de 100% e 88,8%, respectivamente, quando comparada a identificação fenotípica. Conclusões: As metodologias de PCR apresentaram boa correlação quando comparadas com os resultados da cultura e a detecção passou de 47,6% por cultura para 100%, demonstrando serem testes viáveis e mais sensíveis para a caracterização laboratorial de endoftalmite. / Objective: Development and application of Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays for detection and Gram classification of bacteria using aqueous and vitreous humor collected from patients with suspected endophthalmitis. Methods: Analytical specificity was established using 31 clinically important pathogens, 20 gram-positive and 11 gram-negative. Specificity was also tested using human DNA and fungal DNA. Control samples of non-infected aqueous humor collected at the end of phacoemulsification surgery were included. Analytical sensitivity was determined using a 10-fold dilution of S. epidermidis and E. coli DNA. After, methodologies were tested in aqueous and vitreous humor collected from patients with clinical diagnosis of endophthalmitis. Comercial Taq polymersase preparations were DNA decontaminated using DNaseI pretreatment. Results: Universal amplification of 16S rDNA was achieved for all bacterial isolated. Nested Multiplex PCR failed only to determine the Gram status of Acinetobacter spp. Gram classification was achieved for every bacterial isolates using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR, and only a P. acnes isolate showed a mixed signal. Limit of detection using Nested Multiplex PCR was 1 fg/μl for both S. epidermidis and E. coli. Sensitivity for detection of S. epidermidis and E. coli DNA using a SYBR Green 16S rDNA-based universal PCR was 100 fg/μl (E = 0.82 and 0.86; r2 = 0.99) and 1 pg/μl using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR (E = 0.66 and 0.77; r2 = 0.99). Culture was positive in 47.6% of aqueous and vitreous humor analysis. Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays were positive in 100% and 95.2% of these cases, respectively. Among negative culture samples, Nested Multiplex PCR was positive for all (100%) and Real Time PCR assays in 90% of cases (9/10). Gram classification was completed for 88.8% and 100% samples using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR methodologies, respectively. Correlation of 63.6% between microbiological and molecular Gram classification was observed using both molecular assays. 16S rDNA sequence-based identification using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR products showed 100% and 88.8% correlation respectively when compared with phenotypic identification. Conclusions: Both PCR methodologies presented good correlation when compared with culture-proven results and bacterial detection was improved from 47.6%% to 100% showing to be feasible tests for laboratorial characterization of bacterial endophthalmitis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações