USAID / Se identifica la expresión diferencial de genes efectores tipo RXLR en dos cepas aisladas del centro de los andes peruanos de P. infestans EC-1 mediante secuenciamiento del transcriptoma de la interacción papa-P.infestans de los primeros días después de la infección, siendo confirmada por qRT-PCR. Los genes efectores fueron silenciados en una cepa para Avr-vnt1 en POX109 y para el homólogo Avh9.1 en POX067, pero expresados en la otra. Además, los resultados de transcriptoma fueron comparados con tres cepas adicionales del linaje EC-1. En el análisis de SNPs de Avr-blb1, Avr-blb2 y Avr-vnt1, la variabilidad alélica no tuvo predominancia frente a la variabilidad de expresión de genes. Asimismo, debido al silenciamiento génico de Avr-vnt1 se evaluó la expresión de estos en plantas transgénicas [Rpi-vnt1.1] a fin de encontrar si la resistencia transgénica era funcional. Encontrando que en ambas cepas en todos los eventos y en el control susceptible Yungay se expresan, a diferencia del resultado anterior. El descubrimiento de efectores silenciados en las poblaciones del patógeno pueden guiar al uso de genes R específicos en los programas de mejoramiento genético. Pudiendo el gen Rpi-vnt1 no ser recomendado. / Tesis

Ministerio de Ciencia y Tecnología y Fondos Europeos de Desarrollo Regional (FEDER), proyectos AGF99-0396, BIO-2002-03100 y BIO-2005-00332

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Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo que se incluye dentro del Dominio Archaea. Es capaz de crecer utilizando carbohidratos, ácidos carboxílicos, alcoholes y aminoácidos como fuentes de carbono y energía. Además, puede crecer en medio definido en presencia de glucosa como única fuente de carbono, y con nitrato o nitrito como única fuente de nitrógeno a través de la vía de asimilación utilizando las nitrato y nitrito reductasas asimilativas. El nitrato lo utiliza reduciéndolo a amonio, el cual es incorporado a esqueletos carbonados vía glutamato deshidrogenasa (GDH) en condiciones de exceso de nitrógeno o mediante la ruta glutamina sintetasaglutamato sintasa (GS-GOGAT) bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno. La glutamina sintetasa (GS; EC 6.3.1.2) se encuentra en todos los Dominios, que participa en la asimilación del amonio y en la biosíntesis de glutamina, actuando como donador de nitrógeno para la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos. Esta enzima cataliza la biosíntesis de glutamina mediante la reacción biosintética dependiente de magnesio o manganeso, a partir de glutamato, ATP y amonio. En el genoma de Hfx. mediterranei se localizaron tres genes que presentaron homología con glutamina sintetasa, en base a la presencia de tres dominios conservados (COG0174: transporte y metabolismo de aminoácidos; pfam00120: dominio catalítico y pfam03951: dominio beta-Grasp) que se utilizan para identificar a las GSs. También se observó que uno de los genes mantiene conservadas las tres secuencias consenso características de GSs (glnA), mientras que los otros dos genes (glnA-2 y glnA-3) contienen parcialmente conservada una de ellas. Con el objetivo de conocer qué funciones desempeñan estas tres proteínas en la asimilación del nitrógeno, y si concretamente glnA-2 y glnA-3 ejercen un papel importante en este proceso, cada una de las tres proteínas halofílicas se clonó y expresó heterólogamente en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, utilizando el vector de expresión pET3a, obteniéndose las proteínas en forma de cuerpos de inclusión. Cada una de estas fracciones sólidas se solubilizaron utilizando urea 8 M, y posteriormente se diluyeron en un tampón conteniendo NaCl 2 M y DTT 5 mM para conseguir su renaturalización. Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de cada una por separado mediante una única etapa a través de una cromatografía en DEAE-celulosa; obteniéndose puras cada una de las proteínas y concentradas de forma rápida y con un buen rendimiento. La caracterización de la GS (GlnA) recombinante indicó que se trataba de una enzima dependiente de metales catiónicos divalentes, regulada por los efectores 2-oxoglutarato y glutamina. La proteína fue activada por 2-oxoglutarato e inhibida por glutamina. Mediante la técnica de velocidad de sedimentación se determinó que su estructura oligomérica consistía en 12 subunidades y se clasificó como GS tipo I, incluida en la subdivisión α. Se generaron mutantes de deleción de glnA y glnA-3 en Hfx. mediterranei mediante la técnica pop-in pop-out, que permitió la sustitución de una secuencia concreta del genoma por otra modificada in vitro. Para la obtención de los mutantes se utilizó la cepa HM26 (ΔpyrE2) de Hfx. mediterranei. Primeramente, se construyó un cassette de deleción para la obtención de un producto de fusión de 1000 pb (versión incompleta del gen) que se clonó en el vector pMH101N, conteniendo una copia del gen pyrE2, el cual se utilizó como marcador genético. Los mutantes pop-in se seleccionaron en un medio carente de uracilo, ya que sólo las células que codificaron el gen pyrE2, presente en el plásmidos suicida, pudieron sintetizar de novo dicho compuesto y crecer. Posteriormente, el plásmido suicida se perdió y junto con él una de las copias del gen, delecionada u original (mutante pop-out). Finalmente se obtuvieron los mutantes de deleción para los genes glnA y glnA-3, de los cuales glnA resultó ser un gen esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina, puesto que aquellos mutantes que presentaron la deleción de glnA fueron incapaces de crecer en un medio definido carente de glutamina; se trató por tanto de mutantes auxótrofos para este aminoácido, que únicamente crecieron al adicionar glutamina en el medio de cultivo. Finalmente, para conocer el efecto que produce la fuente de nitrógeno sobre la expresión global de los genes en Hfx. mediterranei, se realizó un array de expresión de la cepa R4 (silvestre) y se determinó la expresión global de genes en tres medios de cultivo con diferentes fuentes de nitrógeno: cultivo con amonio como fuente de nitrógeno en fase estacionaria y exponencial de crecimiento, cultivo con nitrato en mitad de fase exponencial de crecimiento y cultivos con carencia de nitrógeno. Las principales diferencias en expresión de genes se detectaron en los medios de nitrato y carencia de nitrógeno con respecto a amonio, los resultados sugirieron que la ausencia de amonio fue el factor responsable para la expresión de genes implicados en la ruta de asimilación de nitrato. Concretamente, en carencia de nitrógeno la GS mostró una mayor expresión que en medio con amonio. Para analizar los cambios de expresión en los genes glnA-2 y glnA-3 se realizó un nuevo array de expresión de la cepa HM26-A (ΔpyrE2 ΔglnA) utilizando como control la cepa parental HM26 (ΔpyrE2). Se determinó la expresión en dos medios de cultivo, en medio complejo suplementado con glutamina 40 mM en mitad de fase exponencial de crecimiento y en medio con carencia en nitrógeno. Tanto en la cepa HM26-A con carencia en nitrógeno como en la cepa parental HM26 se detectaron cambios de expresión en los genes relacionados con la vía asimilativa del metabolismo del nitrógeno de esta arquea halófila. En la cepa HM26 en carencia de nitrógeno con respecto a medio complejo con gln 40 mM se mostró una menor expresión de los genes glnA-2 y glnA-3 y una sobreexpresión de glnA. Mientras que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión.que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión. En conclusión, la glutamina sintetasa de Hfx. mediterranei es una enzima de tipo GSI-α, dodecamérica, resultando ser una proteína esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina; siendo activa en condiciones de deficiencia de nitrógeno, a diferencia de las isoformas GlnA-2 y GlnA-3 que podrían ejercer un papel regulador de GlnA y posiblemente actúen en la célula en condiciones de abundancia de nitrógeno.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Analiza tres fórmulas diferentes de polvo compacto, F001, F002 y F003, con concentraciones variadas del sistema de conservación: metilparabeno/ propilparabeno al 0,4%; 0,2% y 0,0%, respectivamente, a las cuales se les inoculó por separado cuatro microorganismos, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Aspergillus niger ATCC 16404. Menciona la mitad de las muestras fueron estimadas, luego de que se emplea una compresión de 600 psi, con un equipo compresor mecánico y a la otra mitad de muestras se evaluaron sin compresión. Según la hipótesis planteada, la fuerza de compresión aplicada a los polvos disminuye la carga microbiana, para determina la concentración de los microorganismos viables de cada muestra compactada y no compactada, se empleó el procedimiento de recuento en placa y para evalúa el comportamiento de los microorganismos en estudio, se adoptó el método de eficacia antimicrobiana de la USP 35. Se determinó la actividad de agua (aw) de las muestras mediante los métodos de análisis: AOAC 978.18 y AOAC 945.69. Además se realizó el estudio de estabilidad acelerada por 90 días y se evaluó las características microbiológicas de las muestras compactadas y no compactadas al término del estudio. Los resultados obtenidos demuestra que en el proceso de compactación a 600 psi del polvo compacto tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre el desarrollo de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Aspergillus niger ATCC 16404 y Bacillus subtilis ATCC 6633, existiendo reducción de la carga microbiana (p<0,05). Muestra los resultados que el microorganismo Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, fue el más susceptible a la compactación. El microorganismo más resistente al proceso de compactación en polvo compacto fue Bacillus subtilis ATCC 6633, debido a que se trabajó con sus esporas. Las fórmulas compactadas F001, F002 y F003, cumplen con los criterios de eficacia antimicrobiana de la USP 35 para los microorganismos empleados en el estudio. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Se determina la actividad antioxidante y se cuantifica la cantidad de polifenoles totales que presentan las variedades de cacao recolectadas en tres departamentos: Tumbes, Cusco y San Martín. Se elige estos 3 lugares, debido a la alta producción de cacao del tipo CCN-51, y por ser lugares con geografía y climas diversos. Se realiza la selección de los granos del cacao, secado, molienda, maceración hidroalcohólica, filtrado y secado de los extractos, para obtener el extracto a utilizar en los ensayos. Se obtienen los extractos hidroalcohólicos para determinar el contenido de polifenoles, en equivalentes de ácido gálico (GA) y se determina la actividad antioxidante mediante el método de DPPH y ABTS, utilizando técnicas espectrofotométricas. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Estudia el fraccionamiento proteico y caracterización electroforética de las proteínas de las semillas de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua, a través de la evaluación de cinco técnicas de fraccionamiento proteico según la solubilidad de Osborne considerando solventes, metodologías y tiempo de extracción, para obtener fracciones proteicas albuminas, globulinas 7S, globulinas 11S, prolaminas y glutelinas con mayores contenidos proteínicos y rendimientos porcentuales. Posteriormente, se utilizó la concentración 4% (p/v) de las fracciones proteicas de kañihua de ambas variedades, para hidrolizarlas con las enzimas Alcalasa, sistema secuencial Pepsina-pancreatina y Proteasa Ps, en las razones enzima/sustrato (E/S) 1:10, 1:30 y 1:50, se midió el grado de hidrólisis (GH) y la cinética de hidrólisis. A continuación, se determinó la inhibición del crecimiento microbiano de los hidrolizados sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans desde las 0 hasta 24 h mediante espectrofotometría. Luego, se seleccionaron los hidrolizados proteicos con mayor actividad antimicrobiana. Finalmente, se realizó la purificación parcial de los péptidos de estas fracciones por cromatografía de filtración en gel en dos matrices (Sephadex G-25 y G-10), y se volvió a evaluar la inhibición del crecimiento microbiano por espectrofotometría y por difusión en agar. Los resultados del fraccionamiento proteico de las semillas de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua, mostraron el mayor contenido proteico en la harina deslipidizada en comparación a la integral (P ≤ 0,05), el mayor rendimiento porcentual (P ≤ 0,05) durante 1 h de extracción secuencial de las fracciones proteicas, se obtuvo con la técnica de Rodríguez et al. (2011) para albuminas y glutelinas, y con la técnica de Barba de la Rosa et al. (2009) para globulinas y prolaminas. Se encontró en kañihua Ramis y Cupi-Sayhua las concentraciones en albuminas de 15,4 ± 0,3 y 15,8 ± 0,3%, globulinas 7S 24,1 ± 0,5 y 26,3 ± 1,0%, globulinas 11S 25,7 ± 1,0 y 26,7 ± 1,0%, prolaminas 9,6 ± 0,1 y 9,9 ± 0,5% y glutelinas 22,9 ± 0,1 y 21,5 ± 1,4%, respectivamente. El perfil electroforético mostró patrones similares en número de bandas y diferentes en concentración en ambas variedades de kañihua, siendo más intensas en kañihua Cupi-Sayhua. Los resultados de la cinética de hidrólisis con las tres enzimas mostró mayor GH en la razón (E/S) 1:10, las albuminas presentaron diferentes tiempos de hidrólisis inicial progresiva e hidrólisis constante, para Alcalasa (2 y 24 h), Pepsina-pancreatina (1 y 3 h) y Proteasa Ps (2 y 9 h). Sin embargo, en las globulinas 7S, globulinas 11S y glutelinas tuvieron similares tiempos de hidrólisis inicial progresiva e hidrólisis constante (0,5 y 9 h) para Alcalasa y Proteasa Ps, y diferentes (2 y 4 h) con Pepsina-pancreatina; los tiempos de hidrólisis con las tres proteasas presentaron diferencias (P ≤ 0,05). Además, se observó en la hidrólisis total (htotal) de las fracciones proteicas de kañihua en ambas variedades, valores de htotal entre 7,8 y 9,9%, similares a los reportados para trigo y soya. También, se obtuvo GH obtenidos con Alcalasa en albuminas que fueron variables entre 14 a 54, globulinas 7S entre 15 a 32, globulinas 11S entre 14 a 25, y glutelinas entre 12 y 30. Así mismo, los GH fueron variables con Pepsina-Pancreatina observándose en albuminas entre 22 a 67, globulinas 7S entre 7 a 29, globulinas 11S entre 17 a 31, y glutelinas entre 15 a 40. A diferencia, los GH fueron bajos con Proteasa Ps mostrándose en albuminas entre 4 a 8, globulinas 7S entre 5 a 12, globulina 11S entre 4 a 8, y glutelinas entre 4 a 15. En los resultados de inhibición del crecimiento microbiano, los hidrolizados de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua que presentaron mayor inhibición significativa fueron los obtenidos con el sistema secuencial Pepsina-Pancreatina, seguido de los hidrolizados de Alcalasa y Proteasa Ps. Observándose mayor inhibición del crecimiento significativo sobre E. coli y S. aureus. Además, los hidrolizados proteicos de kañihua de ambas variedades que presentaron inhibición del crecimiento microbiano mayor a 45% en comparación al control (P ≤ 0,05), fueron los obtenidos por Alcalasa Glut KS 9 h (1:10) con 88,0% (GH 30%) y Glut KR 9 h (1:10) con 87,3% (GH 16%) sobre E. coli; Glob 7S KR 9 h (1:10) con 50,7% (GH 20%) contra S. aureus; Glob 11S KR 9 h (1:50) con 65% (GH 15%) sobre C. albicans. Los obtenidos por Pepsina-pancreatina Glut KS 4 h (1:10) con 88,7% (GH 40%) y Glut KR 4 h (1:10) con 87,7% (GH 37%) contra E. coli; Glob 11S KS 2 h (1:50) con 69,3% (GH 19%) sobre S. aureus y Glob 11S KR 2 h (1:10) con 68,3% (GH 23%) contra C. albicans. Los obtenidos por Proteasa Ps Alb KR 9 h (1:50) con 49,0% (GH 4%) sobre C. albicans. Finalmente, en la purificación parcial de los péptidos de kañihua se mostró incrementó significativo de la inhibición del crecimiento microbiano en comparación a los hidrolizados proteicos, tanto en la prueba espectrofotométrica como en difusión en agar, siendo el péptido Glut KS 4 h (1:10) el que presentó inhibición frente a E. coli y C. albicans por debajo de los controles gentamicina y nistatina. Además, este péptido obtenido con el sistema secuencial Pepsina-pancreatina mostró alta inhibición del crecimiento microbiano significativo (% Inh ≤ 95). Estos resultados, fueron corroborados con la prueba de difusión en agar, donde se observaron los halos de inhibición (P ≤ 0,05) en comparación a los controles. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú). Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt) / Tesis

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La salmonelosis es considerada la enfermedad más grave que afecta a los cobayos, causando altas tasas de mortalidad y morbilidad, principalmente por los serovares Typhimurium y Enteritidis. Para que se lleve a cabo la infección, debe existir la expresión de diversos grupos de genes que permitan a la bacteria adherirse, multiplicarse y sobrevivir a las defensas del hospedero. El objetivo del estudio fue caracterizar molecularmente aislados de Salmonella enterica provenientes del cepario del Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se utilizaron 80 aislados, 70 obtenidos de cobayos infectados naturalmente y cinco de clínicamente sanos, procedentes de granjas de producción intensiva ubicadas en Lima y Junín, Perú. Se utilizó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) múltiple para la detección de genes invA, prot6E y fliC, correspondientes al género Salmonella, serovar Enteritidis y Typhimurium, respectivamente. También se detectaron los genes de virulencia tolC, sitC, spiA, sopB, lpfC, sifA, spvB, pefA y sipB, necesarios para producir la enfermedad. Finalmente, se evaluó la variabilidad genética mediante la técnica de ERIC-PCR utilizando los primers ERIC1R y ERIC2. Para evaluar la diversidad de los aislados, se realizó el análisis de agrupamiento para generar un dendrograma usando el programa bioinformático NTSYSpc 2.10, empleando el método UPGMA basado en el coeficiente de similaridad de DICE. Se identificó la serovariedad Typhimurium y los nueve genes de virulencia en el 100% de los aislados. La evaluación de los perfiles electroforéticos obtenidos por la técnica de ERIC-PCR demostró patrones de bandas de ADN similares con una homogeneidad mayor al 90%, lo que sugiere una dispersión clonal de los aislados. La presencia de cepas de Salmonella Typhimurium con una amplia variedad de genes de virulencia constituye un riesgo potencial para la producción de cobayos y una fuente de contaminación alimentaria o por contacto al humano. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Para realizar la sustitución de medicamentos innovadores por medicamentos multifuentes (genéricos) o similares con nombres comerciales se debe contar con la evidencia científica basada en estudios tales como de equivalencia terapéutica in vivo (estudios de bioequivalencia) o in vitro (perfiles de disolución). El perfil de disolución es definido como el método in vitro aceptado para la determinación de la intercambiabilidad entre un medicamento patente y un medicamento genérico. Este trabajo se enfocó en el análisis de dos marcas genéricas únicas existentes en el mercado peruano de tabletas de Valsartán de 160 mg comparándolas con las del laboratorio innovador, para lo cual se realizó la comparación de los perfiles de disolución en tres medios de disolución a pH: 1,2; 4,5 y 6,8; en base al Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (SCB); siguiendo la metodología de trabajo de las guías publicadas por la FDA (Administración de Alimentos y Drogas) y de USP 36 – NF 31 (Farmacopea de los Estados Unidos). Se trabajó en seis diferentes tiempos de muestreo: 3, 7, 10, 15, 30 y 45 minutos, bajo condiciones idénticas, donde a partir de sus absorbancia, se calculó el porcentaje de concentración disuelta. El análisis de los perfiles de disolución de los productos en estudio, mediante el empleo del factor de diferencia (f 1) y el factor de similitud (f2) determinó que todos los productos en estudio cumplen con la evaluación estadística recomendada por la FDA, y por ello cumplen con la equivalencia in vitro con el producto de referencia. Adicionalmente, se utilizó el criterio Q de aceptación de la USP 36 – NF 31, la cual indica que no menos del 80% del medicamento debe disolverse en treinta minutos. Es así como se determinó que tanto el producto de referencia, como los productos en estudio se disolvieron rápidamente (85% o más en 30 minutos o menos) en solución amortiguadora de pH 6,8; además que los productos en estudio exhiben perfiles de disolución similares a los del producto comparador en soluciones amortiguadores de pH 1,2; 4,5 y 6,8, cumpliendo con el enfoque de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para que el producto pueda entrar en la categoría de bioexención; con lo cual se confirma la intercambiabilidad de los productos en estudio con el producto de referencia. / Tesis