Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-20T16:07:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-03T17:53:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-03T17:53:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Atualmente no Brasil ocorrem cerca de 20.000 acidentes ofídicos anuais, sendo 90% deles causados por serpentes do gênero Bothrops. A soroterapia ainda é o tratamento mais comum para acidentes com animais peçonhentos, apesar da toxicidade gerada pela utilização de anticorpos eqüinos. Esse tratamento pode induzir inflamação, falência renal e até choque anafilático. Entretanto atualmente vários estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de minimizar esses efeitos colaterais, incluindo o desenvolvimento de anticorpos mais específicos e menos imunogênicos, que poderiam substituir ou até mesmo atuar em conjunto com a soroterapia convencional. A fosfolipase A2 (PLA2) é o principal antígeno encontrado no veneno da serpente Bothrops atrox e é o responsável pela miotoxicidade, inflamação e necrose. Anticorpos monoclonais (mAbs) contra esse antígeno foram produzidos em camundongos e se mostraram capazes de neutralizar eficientemente a atividade miotóxica dessa PLA2 (Kanashiro et al., 2002). O objetivo desse trabalho foi então humanizar o anticorpo anti-PLA2 A85/9-4 produzido por Kanashiro e colaboradores (2002), visando o seu uso clínico no tratamento de envenenamentos com essa serpente. Inicialmente os genes codificadores das cadeias variáveis leve e pesada do mAb foram seqüenciadas a partir da clonagem do cDNA de imunoglobulina vindo do hibridoma. Para humanizar esse anticorpo as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) murinas foram transferidas para arcabouços humanos germinais escolhidos em bancos de dados devido a sua alta similaridade com as seqüências murinas. A porção variável (Fv) humanizada proposta tem apenas 16 resíduos de aminoácidos não-humanos na cadeia leve e 9 na cadeia pesada. As seqüências codificadoras das porções variáveis foram sintetizadas e clonadas na forma de scFv (fragmento variável de cadeia única) em vetor de expressão em Pichia pastoris. Entretanto, durante a expressão do scFv verificou-se a formação de agregados no sobrenadante de cultura, dificultando sua purificação e comprometendo o rendimento. Para diminuir essa agregação as porções variáveis do anti-PLA2 foram então clonadas e expressas na forma de FvFc o que tornou possível a purificação e a realização dos testes de afinidade do anticorpo humanizado. O fragmento FvFc recombinante se mostrou capaz de reconhecer tanto o extrato bruto da peçonha quanto a fosfolipase purificada, além de ter sua ligação inibida pela presença do mAb original. Os testes in vitro sugerem que os FvFcs humanizados possam apresentar desempenho similar ao mAb em futuros testes de neutralização in vivo. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nowadays in Brazil there are about 20000 snake accidents annualy and 90% of them are with the Bothrops species. The serotherapy is the commonest treatment to animal poison accidents, despite of the toxicity triggered by equine antibody utilization. This conduct can induce inflammation, kidney failure and anaphylactic shock. Nowadays several studies have been developed to minimize these collateral effects included the developing of more especific and less immunogenic antibodies that could be used to substitute the conventional serotheraphy or in association with this treatment. The Phospholipase A2 (PLA2) is the principal antigen found in the Bothrops atrox venom and causes miotoxicity, inflammation and necrosis. Monoclonal antibodies (mAbs) against this antigen were produced in mice and were able to neutralize the miotoxic activity of PLA2 efficiently (Kanashiro et al., 2002). The objective of this work was to develop a humanized form of the antibody anti-PLA2 A85/9-4 produced by Kanashiro et al (2002), aiming its clinical use for snake poisoning treatment. Initially the light and heavy chains of the mAb were determined by cloning Ig cDNA from mAb´s hybridoma. To humanize this antibody, the light and heavy chain’s CDRs of the murine mAb were transferred to a human framework, chose on the database of human germline V genes because their high similarity with the murine sequences. The proposed Fv has 16 non-human residues in the light chain and 9 in the heavy chain. The sequences of the variables regions were synthesized and initialy cloned as a scFv (single chain variable fragment) in expression vector for Pichia pastoris heterologous expressions. But during the expression this form induced agregation and couldn’t be purified. To minimize this agregation the variable regions of the anti-PLA2 were cloned as a FvFc fragment and in this form was possible the purification and tests of afinity of the humanized form. The recombinant FvFc antibody fragment was able to recognize the total venom and the purified PLA2. And was inhibit by the original mAb. The results of the in vitro tests suggest that the humanized FvFcs can be similar results of the original mAb in in vivo neutralization tests.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2014-10-22T18:58:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Carine Souza Aguiar.pdf: 1618744 bytes, checksum: a297cae4dbf16da3ebefd6282adb27c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-22T18:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Carine Souza Aguiar.pdf: 1618744 bytes, checksum: a297cae4dbf16da3ebefd6282adb27c1 (MD5) / Os venenos de serpentes são constituídos por uma mistura complexa de substâncias e como consequência podem apresentar distintas funções biológicas, bioquímicas e farmacológicas. Devido ao seu elevado grau de especificidade do alvo, toxinas têm sido cada vez mais utilizadas como instrumentos farmacológicos e como protótipos para o desenvolvimento de drogas. As infecções estão entre as dez principais causas de morte no mundo, por isso é necessária a descoberta de novas alternativas para o tratamento das infecções que envolvem os diversos microrganismos patogênicos. Apesar dos efeitos tóxicos, os venenos possuem grande potencial para produção de novos medicamentos. Através de metodologias como disco difusão e microdiluição é possível identificar se um composto possui ou não atividade antimicrobiana e avaliar a intensidade dessa atividade. Existem vários relatos de atividade antimicrobiana em venenos de diferentes serpentes. A descoberta de novas moléculas que possuam alguma atividade biológica decorre de testes com substâncias que ainda não foram utilizadas para este fim e/ou que não tenham sido estudadas em sua totalidade, por isso, dentre as várias espécies de serpentes peçonhentas, foram escolhidos como alvo deste trabalho as serpentes Bothrops leucurus e Crotalus durissus cascavella, pois o uso dos venenos produzidos por elas constituem-se como fontes potenciais para o estudo de atividades bactericida e antifúngico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana dos venenos totais dessas serpentes contra 20 cepas bacterianas e 8 espécies fúngicas através do teste de disco difusão, determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e comparar a atividade antimicrobiana desses venenos. Os testes mostraram que o veneno VBL apresentou atividade através da formação de halos de inibição frente a 19 cepas de bactérias e o VCC em 18 cepas. A ação dos dois venenos foi dose-dependente no teste de disco difusão para a maioria dos microrganismos. O veneno VBL em solução aquosa manteve sua atividade após o congelamento nos teste de microdiluição em caldo frente a 10 cepas de bactérias e o VCC em apenas 6 cepas. Em relação aos fungos filamentosos o VBL apresentou atividade em 4 e o VCC em 2 das espécies testadas. Os valores das CIM's determinadas para os dois venenos demonstram que o VBL possui maior atividade na inibição de todos os microrganismos do que o VCC. Diante dos resultados encontrados, acredita-se que é possível termos mais de uma substância agindo na inibição do crescimento dos microrganismos. É importante ressaltar que como se trata de venenos totais, muitas substâncias podem estar atuando sobre esses microrganismos. Bactérias e fungos variam amplamente na composição das suas membranas e paredes, portanto, era esperado que exibissem diferentes sensibilidades aos venenos, não sendo ainda possível avaliar se uma ou mais substâncias são responsáveis pelos resultados encontrados.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-06Bitstream added on 2014-06-13T19:12:06Z : No. of bitstreams: 1 cunha_rm_me_botib.pdf: 829808 bytes, checksum: 0d58883f9479527d834af5abe27ce09a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os acidentes botrópicos representam cerca de 87% dos envenenamentos ofídicos registrados no Brasil e se destacam pelas graves seqüelas que limitam a vida do acidentado. O principal efeito tóxico local destes é a mionecrose, que pode levar à perda tecidual permanente e à amputação. A mionecrose pode ser decorrente da isquemia do tecido muscular, causada por fatores hemorrágicos presentes nestes venenos (metaloproteases), ou da presença de miotoxinas (PLA2s) que afetam diretamente o tecido muscular. O método mais eficaz para o tratamento dos envenenamentos ofídicos é a soroterapia passiva. No entanto, esta é limitada devido à relativa ineficácia do soro em neutralizar a mionecrose dos venenos botrópicos, além de muitas comunidades não terem acesso à soroterapia. Estes fatores conduzem a busca de métodos alternativos, como o uso de extratos vegetais. Evidências mostram que o extrato aquoso da Casearia sylvestris, conhecida popularmente como “guaçatonga, é capaz de neutralizar efeitos tóxicos de venenos brutos e de suas miotoxinas isoladas. A Casearia sylvestris apresenta diversos outros efeitos terapêuticos como: anti-séptico, antiinflamatório, anestésico local, anti-tumoral, anti-úlcera e cicatrizante. Devido à escassez de estudos experimentais para avaliar a eficácia de extratos vegetais na redução dos danos locais ocasionados pelo envenenamento botrópico, torna-se importante avaliar a potencial atividade antiofídica da Casearia sylvestris. O presente estudo teve por objetivo investigar o uso do extrato aquoso da Casearia sylvestris, como terapêutica tópica dos efeitos locais do envenenamento botrópico experimental em camundongos. Foi avaliada a capacidade do extrato bruto da planta em neutralizar a mionecrose induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu e/ou acelerar o processo de regeneração... / Bothrops accidents represent about 87% of snakebites recorded in Brazil and account for serious the consequences that affect the life of the victim with social and economic repercussions. Its main toxic effect is myonecrosis, which can lead to permanent tissue loss and amputation. Myonecrosis may result from muscle tissue ischemia, hemorrhage caused by factors present in these venoms (metalloproteases), or the presence of myotoxins (PLA2s) that directly affect muscle tissue. The most effective treatment is passive serotherapy. However, this is limited due the relative ineffectiveness of the serum to neutralize the myonecrosis of Bothrops venoms and the lack of access to serotherapy by many communities. These factors lead to alternative methods such as the use of plant extracts. Evidence shows that the aqueous extract of Casearia sylvestris, known popularly as guaçatonga, is able to neutralize the toxic effects of venom and their crude myotoxins isolated. Casearia sylvestris presents several other therapeutic effects such as, antiseptic, antiinflammatory, local anesthetic, anti-tumor, anti-ulcer and wound healing. Due to the scarcity of experimental studies to evaluate the efficacy of plant extracts in reducing the harm caused by Bothrops envenomation, it is important to evaluate the potential activity of antiophidic Casearia sylvestris as a complement to conventional serum therapy. The present study aimed to investigate the use of aqueous extract of Casearia sylvestris, topical therapy as complementary to local effects of Bothrops envenomation in experimental mice. We evaluated the ability of the crude extract of the plant to neutralize myonecrosis induced by the venom of Bothrops jararacussu and / or accelerate the process of muscle regeneration. The onset of myonecrosis and the regenerative process... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Márcia Gallacci / Banca: Marcos Roberto de Mattos / Banca: Vidal Haddad Junior / Resumo: Os acidentes envolvendo as serpentes do gênero Bothrops se destacam no Brasil e em outros países da América Latina, representando 90% das notificações. O envenenamento botrópico é caracterizado por intensa mionecrose local que não é eficientemente neutralizada pelo único tratamento disponível, isto é, a soroterapia. Como conseqüência, em casos graves, este acidente pode levar a amputação de membros, desabilitando a vítima. Os principais responsáveis pelo desenvolvimento da mionecrose são proteínas com estruturas homólogas às enzimas fosfolipases A2 (PLA2s). Entre essas se destacam as variantes cataliticamente inativas que apresentam como característica um resíduo de lisina na posição 49 (Lys49-PLA2s). Tradicionalmente, as Lys49-PLA2s são consideradas miotoxinas não-neurotóxicas, uma vez que não induzem paralisia in vivo. No entanto, em preparações isoladas, tal efeito é observado. Recentemente, sugeriu-se que a paralisia muscular in vitro, da mesma forma que a lesão muscular, resultaria da atividade desestabilizadora de membrana da fibra muscular induzida por estas toxinas. O presente estudo teve como objetivo investigar a relação entre os efeitos miotóxico e paralisante das Lys49-PLA2s e contribuir para o esclarecimento do mecanismo de ação e da relação estrutura/atividade dessas toxinas. Sendo assim, realizaram-se estudos miográficos e morfológicos em preparações neuromusculares de camundongos utilizando a PrTX-I (Lys49-PLA2 isolada do veneno de Bothrops pirajai) e potenciais inibidores vegetais (ácido rosmarínico, ácido caféico e ácido aristolóquico). Os resultados obtidos mostraram as diferentes capacidades dos compostos vegetais em neutralizar os efeitos miotóxico e paralisante da PrTX-I. Assim, o ácido rosmarínico neutralizou ambos os efeitos eficientemente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Accidents caused by Bothrops snake genus stand out in Brazil and other Latin American countries, representing 90% of notifications. Bothropic envenoming is characterized by intense local myonecrosis, not effectively neutralized by serum therapy, the only available treatment. As a result, in severe cases, these accidents can lead to amputation of limbs, disabling the victim. The main responsibles for myonecrosis development are proteins with homologous structures from enzymes phospholipase A2 (PLA2s). Among these stand out catalytically inactive variants that have a characteristic lysine residue at position 49 (Lys49-PLA2s). Traditionally, Lys49-PLA2s myotoxins are considered non-neurotoxic, since they do not induce paralysis in vivo. However, this effect is observed in isolated preparations. It was recently suggested that muscle paralysis in vitro, as well as muscle injury, would result from the destabilizing activity of the muscle fiber membrane induced by these toxins. This study aimed to investigate the relationship between paralyzing and myotoxic effects of Lys49-PLA2s and contribute to the elucidation of the mechanism of action and structure/activity relationship of these toxins. Therefore, myographical and morphological studies were performed in neuromuscular preparations of mice using PrTX-I (Lys49-PLA2 isolated from Bothrops pirajai venom) and potential inhibitors from plants (rosmarinic acid, caffeic acid and aristolochic acid) as experimental tools. The results showed the different skills of plant compounds to neutralize myotoxic and paralyzing effects of PrTX-I. Thus, the rosmarinic acid efficiently neutralized both effects, whereas caffeic acid only partially inhibited the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2779_1.pdf: 2511678 bytes, checksum: fe173ac68123ac729ff2ada7fc331988 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune cuja ligação reversível e específica a carboidratos resulta em aglutinação celular. Bothrops leucurus, serpente da Família Viperidae, representa um sério problema médico para a região Nordeste do Brasil. Uma lectina ligante de galactosídeo (BlL) foi purificada do veneno da serpente Bothrops leucurus através da combinação de cromatografia de afinidade e gel filtração. BlL aglutinou eritrócitos de coelho e humano, com preferência para eritrócitos de coelho, sendo especificamente inibida por galactose, rafinose e lactose, bem como por glicoproteinas. BlL é uma proteína ácida, com massa molecular de 30 kDa e composta de duas subunidades de 15 kDa, exibiu dependência de cátions divalentes, foi principalmente ativa em pH 4.0 a 7.0 e termoestável até 70°C. O espectro de emissão de fluorescência mostrou resíduos de triptófano completamente encobertos na sua estrutura. Dicroísmo Circular de BlL foi típico de uma proteína toda estrutural. BlL mostrou ser efetivo contra bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Bacillus subtilis). A atividade antitumoral de BlL foi avaliada em relação ao seu potencial citotóxico em linhagem tumoral (K562, Hep-2 e NCI-H292) e quanto à sua capacidade hemolítica. BlL apresentou uma significante atividade citotóxica em todas as linhagens tumorais testadas e não exibiu atividade hemolítica na máxima concentração testada (2000 μg/mL). Além disso, foi realizada em células K562, a análise da externalização da fosfatidilserina e potencial de membrana mitocondrial, utilizando microscópio de fluorescência. Tratamento com BlL induziu externalização da fosfatidilserina e despolarização mitocondrial, indicando morte celular por apoptose. Após irradiação gamma, BlL apresentou mudanças estruturais e teve sua atividade hemaglutinante significante alterada. SDS-PAGE indicou que a irradiação causou fragmentação e com posterior agregação da lectina. A análise em cromatografia de fase reversa revelou fragmentação estrutural. A atividade citotóxica de BlL em linhagens tumorais (K562, Hep-2 e NCI-H292) foi abolida após irradiação, indicando que a irradiação de BlL se mostrou uma eficiente estratégia para inativar sua atividade citotóxica. Esses achados demonstram que o veneno de B.leucurus contem uma lectina ligante de galactosídeo com potencial promissor para aplicação terapêutica e biotecnológica

Orientador: Igor Polikarpov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T11:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lee_WenHwa_D.pdf: 8676479 bytes, checksum: fe860bf2f06ea88d21a3e1f9f4aa09de (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Lea Rodrigues-Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T14:03:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galbiatti_Charlene_M.pdf: 3708573 bytes, checksum: eb349f7f5062bd08e487dc8ae3c13167 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: No presente trabalho foram estudados os efeitos neuromusculares da toxina Bmaj-9 isolada do veneno de Bothrops marajoensis no laboratório de química de proteínas da Unicamp. Esta toxina foi ensaiada: nas preparações biventer cervicis de pintainho, nervo frênico diafragma de camundongo e no músculo gastrocnêmio de camundongo. Em preparações de ave, a Bmaj-9 causou bloqueio neuromuscular completo irreversível nas concentrações de 5, 10 e 20 µg/mL, sem afetar as contraturas evocadas pela adição exógena de ACh (110 µM). Além disso mostrou-se pouco ativa na preparação nervo frênico diafragma de camundongo. A Bmaj -9 não interferiu na resposta muscular a estímulos elétricos direto em preparações de biventer cervicis de pintainho previamente curarizadas. Ensaios bioquímicos mostraram que a Bmaj-9 exibiu uma pronunciada atividade fosfolipásica quando comparada a do veneno bruto. Assim, submetendo-se preparações incubadas com a toxina a baixa temperatura (22 °C), observou-se a ausência do seu característico efeito bloqueador neuromuscular. A análise histológica in vitro mostrou que esta fração em baixas concentrações não causou alteração morfológica significativa embora tenha determinado um leve aumento na liberação da enzima creatinoquinase. Em altas concentrações, no entanto, foi observado algum dano muscular na região periférica do músculo. In vivo, a Bmaj-9 causou uma discreta alteração morfológica e também um leve aumento nos níveis de CK após injeção intramuscular, mostrando uma correlação positiva entre os efeitos dos parâmetros estudados - lesão muscular e liberação de CK, esses dados, em nada se comparam aos efeitos de venenos ou toxinas tipicamente botrópicas. O registro do PM mostrou que a Bmaj-9 (10 µg/mL) não produziu despolarização da membrana muscular, e a medida do conteúdo e do tamanho quânticos, em preparação nervo frênico-diafragma de camundongo, mostrou que houve um leve aumento nos valores do conteúdo quânticos após 15 minutos de incubação. Após 60 minutos de incubação, o efeito da Bmaj-9 sobre os valores do conteúdo e tamanho quânticos foram, respectivamente: 70,5 ± 11 e 0,21 ± 0,06 mV. Estes não foram significativamente diferentes quando comparados com os valores controle (68,0 ± 8,9 e 0,17 ± 0,04 mV). Estes resultados sugerem que o bloqueio da transmissão neuromuscular, causado por esta toxina em baixas concentrações, seja muito provavelmente devido a uma ação pré-sináptica, resultado de sua interação com a membrana do terminal nervoso motor. / Abstract: In the present work, the neuromuscular effects of the toxin Bmaj-9 isolated from the venom of Bothrops marajoensis in the laboratory of chemistry of proteins at Unicamp were studied. This toxin was assayed in biventer cervicis preparations of little chicken, phrenic diaphragm nerve of mice and in gastrocnemius muscles of mice. In birds preparation, Bmaj-9 caused irreversible complete neuromuscular blockade in the concentrations of 5, 10 and 20 µg/mL not affecting the contractures caused by the exogenous addition of Ach (110 µM). Moreover, Bmaj-9 was not very active in the phrenic diaphragm preparation of mice. It has not interfered in the muscular response to direct electrical stimuli in biventer cervicis preparations of little chicken previously curarized. Biochemical assays showed that Bmaj-9 exhibited pronounced phospholipase activity when compared to crude venom. Thus, when preparations incubated with the toxin were submitted to low temperatures (22°C), the absence of the characteristic neuromuscular blocking effect of the fraction was observed. The histological analysis in vitro showed that even having determined a low increase on the release of the creatino-kinase enzyme, low concentrations of this fraction did not cause significant morphological alteration. Nevertheless, in high concentrations some muscular damages in the peripheral region of the muscle were observed. In vivo, Bmaj-9 caused a slight morphological alteration and also a discrete increase on the CK levels after intramuscular injection, showing a positive correlation among the effects of the parameters studies - muscular lesion and CK release. These data obtained with Bmaj-9 are extremely inferior to the ones obtained with bothropic venoms or toxins. The registration of the resting membrane potential showed that Bmaj-9 (10 µg/mL) did not produce depolarization of the muscular membrane and the measurement of the content and quantum size, in phrenic diaphragm preparation of mice, showed that a slight increase on the quantum amount was detected after 15 minutes of incubation. After 60 minutes of incubation, the effect of Bmaj-9 over the content and quantum size values was 70.5 ± 11 and 0.21 ± 0.06 mV, respectively; these values were not significantly different when compared to control values (68.0 ± 8.9 and 0.17 ± 0.04 mV). These values suggest that the blockade of the neuromuscular transmission caused by this toxin in low concentrations is probably due to a pre-synaptic action resulting from the interaction of the toxin with the membrane of the motor nerve terminal. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_D.pdf: 7120787 bytes, checksum: 3839207f36a378b463b63406202ef7e4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O envenenamento ofídico é um evento comum nos países pobres da área tropical e subtropical e as conseqüências deste, muito graves. Nestes países, pequena têm sido a valorização destas conseqüências, sendo pouco registradas estatisticamente como casos de saúde pública e muitas vezes tratados com procedimentos pouco efetivos ou ultrapassados. Neste trabalho foram utilizados metodologias refinadas e protocolos otimizados de purificação em HPLC com o intuito de se estudar mais detalhadamente a composição do veneno de duas serpentes de importância médica e epidemiológica, Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma, e analisar a relação estrutura função de PLA2 D49 (6-1, 6-2 e Cr-IV1) e PLA2 homólogas K49 (Bj-VII e Cr 5). A Bothrops jararacussu, é uma serpente encontrada nas Américas, desde o México até a Argentina sendo que no Brasil cerca de 90% dos acidentes ofídicos são causados pelo gênero Bothrops. A Calloselasma rhodostoma, é uma serpente amplamente distribuída no sudeste da Ásia e é a causa mais comum de acidentes ofídicos na Malásia e Tailândia. As novas toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e homogeneidade molecular, como mostram os perfis cromatográficos, eletroforéticos e de espectrometria de massa por MALDi-TOF. A nova PLA2 D49 foi purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma após dois passos cromatográficos: exclusão molecular em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78 cm x 3,30 cm), eluída com 0,25M de bicarbonato de amônio, pH 7,9, a um fluxo de 0,3 ml/min e, fase reversa em HPLC usando uma coluna µ-Bondapack C-18. Esta apresentou atividade fosfolipásica de 14,25±0,36 nmol/mg/min na presença de substrato sintético cromogênico (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), massa molecular de 14,029 Da determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF, valor calculado de pI igual a 8.55, caráter básico e grande homologia seqüencial evidenciada pela estrutura primária quando esta é comparada com outras PLA2 D49 provenientes de veneno de serpente. A outra proteína, denominada Cr 5, uma PLA2 homóloga K49 foi isolada do veneno de Calloselasma rhodostoma em um único passo cromatográfico de fase reversa em HPLC (µ-Bondapack C-18). A massa molecular de 13,965 Da foi determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF. A composição de aminoácido mostrou que a Cr 5 tem alto conteúdo de Lys, Tyr, Gly, Pro e 14 cisteínas, resíduos típicos de uma PLA2 básica. A completa seqüência de aminoácidos da Cr 5 contém 120 resíduos e mostra alta identidade quando comparada a outras PLA2 K49 isoladas de venenos de serpentes da família viperidae. Com relação à caracterização biológica, esta foi realizada também com as isoformas 6-1 e 6-2 (provenientes da fração BthTX-II de Botrhops jararacussu) e com a PLA2 K49 Bj-VII, estas purificadas e parcialmente caracterizadas em trabalho anterior. As PLA2 6-1, 6-2 e Cr-IV 1, exibiram miotoxicidade local e na dosagem de 40 µg/150 µl a 6-1 causou 83,06% de citotoxicidade em miotubos e 93,78% em mioblastos, já a 6-2 75,12 % em miotubos e 86,26% em mioblastos e a Cr-IV 1, 91,50% e 88,40% de citotoxicidade em miotubos e mioblastos, respectivamente. O efeito citotóxico também foi visto em fibroblastos mostrando na dosagem de 5 µM (linhagem 3T3) 85,63%, 86% e 91,34% de citotoxicidade na presença de 6-1, 6-2 e Cr-IV 1 respectivamente, e na linhagem COS7, 95,42%, 95,07% e 96,42% respectivamente, além de atividade inflamatória, sendo esta mais pronunciada na presença da Cr-IV 1. As PLA2s K49 homólogas, Bj-VII e Cr 5, evidenciaram miotoxicidade local e na dosagem de 40 ug/150 µl, a Bj-VII causou 87±50% de lise em mioblastos e 84±85% em miotubos e 91±25% de lise em mioblastos e 91±0.8 % em miotubos quando em contato com a Cr 5, além de atividade inflamatória evidenciada pela indução de edema. No caso destas proteínas, todos os efeitos biológicos induzidos por elas ocorreram na ausência de atividade fosfolipásica mensurável in vitro, suportando a idéia proposta pela literatura de mecanismos catalíticos e farmacológicos independentes. Apesar de todas apresentarem algumas diferenças biológicas, elas possuem um comportamento semelhante na estrutura-função, sugerindo uma ancestralidade comum embora sejam proteínas provenientes de venenos de serpentes separadas geograficamente / Abstract: Snake poisoning is a common event in poor countries of tropical and subtropical areas and the consequences of this is very serious. In these countries, there is the valorization of these consequences, due to few registers of published health cases and a lot of times treated with procedures a little effective or outdated. In this work we refined methodologies and optimized purification protocols used in HPLC with the intention to study the composition of the venom of two serpents of epidemic importance, Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma, and to analyze the relationship of structures function of PLA2 D49 (6-1, 6-2 and Cr-IV1) and homologous PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5). Bothrops jararacussu is a serpent found in America, from Mexico to Argentina being in Brazil, about 90% of the snake accidents caused by Bothrops genus. Calloselasma rhodostoma is a serpent thoroughly distributed at the Southwest of Asia and it is the most common cause of snake accidents in Malaysia and Thailand. The new toxins were obtained with high degree of purity and molecular homogeneity, like showed the chromatographics profiles, electrophoresis and MALDi-tof mass spectrometric (MS) analysis. A new D49 PLA2 was purified from the venom of Calloselasma rhodostoma after two chromatographic steps; molecular exclusion was loaded onto a Protein-Pack 300 SW column (0.78 cm 3 30 cm) and eluted with 0.25 M ammonium bicarbonate, pH 7.9, at a flow rate of 0.3 ml/min and reverse phase HPLC on µ-Bondapack C-18 and showed phospholipasic activity of 14.25±0.36 nmol/mg/min in the presence of a synthetic chromogenic substrate (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), a molecular mass of 14.029 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry, calculated pI value 8.55, basic character and great sequential homology evidenced by the primary structure when this was compared with other PLA2 from D49 snake venom. The other protein, denominated Cr 5 PLA2 homologous (K49) was isolated from Calloselasma rhodostoma venom in one chromatographic step in reverse phase HPLC (RP-HPLC) (on l-Bondapack C-18). A molecular mass of 13.965 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The amino acid composition showed that Cr 5 had a high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical residues of a basic PLA2. The complete amino acid sequence of Cr 5 PLA2 contains 120 residues and this sequence shows high identity values when compared to other K49 PLA2s isolated from the venoms of viperid snakes. In relation with biological characterization, this was also done with the isoforms 6-1 and 6-2 (from fraction BthTX-II of Botrhops jararacussu) and with PLA2 K49 Bj-VII, these purified and partially characterized in The Masters. PLA2 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 exhibited in mice local myonecrosis and edema upon intramuscular and intravenous injections, respectively. In dosage of 40 ug/150 ml, 6-1 showed 83.06% of citotoxicity in myotubes and 93.78% in myoblasts, 6-2 showed 75,12 % in myotubes and 86,26% in myoblasts, to Cr-IV 1 91.50% and 88.40% of citotoxicity in myoblasts and myotubes respectively. The citotoxic effect also in fibroblasts (cell line 3T3 and COS7) and in dosage de 5 µM (cell line 3T3) 85.63%, 85% and 91.34% of citotoxicity in the presence of 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 respectively, and lineage COS7, 95.42%, 95.07 and 96.42% respectively, besides inflammatory activity, being this one more pronounced in the presence of the Cr-IV 1. PLA2 homologue K49, Bj-VII and Cr 5, evidenced local myotoxicity and in dosage of 40 ug/150 ml, showed 87±50 of lise in myoblasts and 84±85 in myotubes and 91±25% and 91±0.8 % when in contact with Bj-VII and Cr 5, respectivally besides of inflammatory activity evidenced by the edema induction. In the case of PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5), all of the biological effects induced by them happened in the absence of activity phospholipase measurable in vitro, supporting the idea proposed by the literature of catalytic and pharmacological mechanisms independent. Even though all show some kind of biologic differences all of them have a similar behave in function and structure which suggests a common ascendance of course we know they are proteins coming from different snakes geographic separated. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-16T14:07:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_ Marissa B. Anjos.pdf: 1468936 bytes, checksum: 00b93348700901474a18adf50c5298fa (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-16T14:07:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação_ Marissa B. Anjos.pdf: 1468936 bytes, checksum: 00b93348700901474a18adf50c5298fa (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-16T14:07:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_ Marissa B. 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In the present study, Swiss mice were challenged with bothropic venom and treated with Bellucia dichotoma, using the same extract concentration and native population preparation conditions, in order to investigate the action of venom and the possible antiofidic effect of EaBd in the period of 24 h. Thus, five experimental treatments (n = 4) were established: saline, VBa (Bothrops atrox venom), EaBd, EaBd/SAB and SAB. After the experimental period, the animals were sacrificed and the spleens removed and fixed in buffered formalin for further processing in histological resin. Each organ was serially sectioned (9-12 sections/organ) that allowed the determination of the total volume of the spleen and its microstructure according to modern stereological techniques. B. atrox venom reduced the volume of the erythropoietic region of the red pulp and the volume of the periarteriolar lymphoid sheath (PALS), a region rich in T lymphocytes of the white pulp. In addition, the population of follicular macrophages was significantly increased in the VBa group in relation to the other groups. The treatment EaBd and EaBd/SAB did not present significant changes, except for the capsule component that was increased in EaBd/SAB. The treatments involving the extract were also similar to saline and SAB treatments. In conclusion, the aqueous extract of B. dichotoma administered orally shortly after B. atrox poisoning is effective in inhibiting the quantitative morphological changes in the spleen of mice poisoned when evaluated after 24 hours. / O extrato aquoso da casca de Bellucia dichotoma (EaBd) é utilizado tradicionalmente em casos de acidentes ofídicos e tem se mostrado como promissor contra o envenenamento por Bothrops atrox (VBa). O soro antibotrópico (SAB) é a terapia convencional após o acidente com B. atrox. Há evidencias da ação bloqueadora local de EaBd em camundongos envenenados, contudo faltam estudos da ação sistêmica dessa planta contra VBa. A associação entre EaBd e SAB também poderia ser uma alternativa para o acidentado. O baço é o sítio responsável pela filtração, resposta imune do sangue, como também local da hematopoiese extramedular. No presente estudo, camundongos Swiss foram desafiados com o veneno botrópico e tratados com Bellucia dichotoma, utilizando a mesma concentração do extrato e condições de preparo da população nativa, a fim de investigar a ação do veneno e o possível efeito antiofídico do EaBd no período de 24 h. Assim, cinco tratamentos experimentais (n=4) foram estabelecidos: salina, (veneno de Bothrops atrox) VBa, VBa/EaBd, VBa/EaBd/SAB (soro antibotrópico) e VBa/SAB. Após o período experimental, os animais foram sacrificados e os baços removidos e fixados em formalina tamponada para posterior processamento em resina histológica. Cada órgão foi serialmente seccionado (9-12 seções/órgão) que permitiram a determinação do volume total do baço e de sua microestrutura segundo as modernas técnicas estereológicas. O veneno de B. atrox reduziu o volume da região eritropoiética da polpa vermelha e o volume da bainha linfoide periarteriolar (PALS), região rica em linfócitos T da polpa branca. Além disso, a população de macrófagos foliculares esteve significativamente aumentada no grupo VBa em relação aos demais grupos. O tratamento EaBd e EaBd/SAB não apresentaram alterações significativas, com exceção do componente cápsula que esteve aumentado em EaBd/SAB. Os tratamentos envolvendo o extrato também mostraram-se similares aos tratamentos salina e SAB. Em conclusão, o extrato aquoso de B. dichotoma administrado por via oral logo após o envenenamento por B. atrox é efetivo na inibição das alterações morfológicas quantitativas no baço de camundongos envenenado quando avaliados após 24 horas.

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No. of bitstreams: 2 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The emergence of pathogenic agents resistant to conventional drugs has stimulated the search for new classes of antimicrobial and antiparasitic agents from natural sources. Among these, it highlights antimicrobial peptides (AMPs), which have mechanisms not dependent on the interaction with a specific receptor, providing new possibilities for the development of drugs against resistant organisms. The present study aimed to purify and characterize biochemically the peptides of B. atrox and B. jararacussu snakes venoms, as well as to evaluate the antimicrobial and antiparasitic activities of the peptides against the strains: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Leishmania amazonensis (IFLA/BR/97/PH8), and Plasmodium falciparum (clone W2, resistant to chloroquine). In this work, we carried out a comprehensive analysis of peptides presents in the venom of B. atrox and B. jararacussu using the combination of Amicon ultrafiltration of 3kDa, high performance liquid chromatography in reverse phase and mass spectrometry with electrospray ionization (Electrospray-Ion Trap-Time of Flight). Sixteen peptides were identified in both venoms, with mass range 444.17 to 1356.73 Da and primary structure between 3 to 13 residues. Among them 13 are unique sequences, including 7 peptides and 6 bradykinin-potentiating peptides (BBPs). The other peptides refer to 2 metallopeptidases inhibitor found in both peptidome venoms, but not described for these species, besides 1 BPP identified in the venom of B. atrox, the BPP-Bax12 with peptide sequence described. Some of the new peptides identified showed antibacterial activity against K. pneumoniae, P. aeruginosa and S. aureus, and low hemolytic activity, but did not demonstrate antiparasitic activity. Therefore, in this study 13 new peptides were identified from the B. atrox and B. jararacussu snake venoms, and some with relevant bacterial activities, which can assist in the development of new drugs against multiresistant microorganisms. / O surgimento de agentes patogênicos resistentes aos fármacos convencionais, têm estimulado a procura de novas classes de agentes antimicrobianos e antiparasitários a partir de fontes naturais. Dentre estes, destacam-se os antimicrobianos (AMPs), que possuem mecanismos não dependentes da interação com um receptor específico, oferecendo novas possibilidades para o desenvolvimento de medicamentos contra microrganismos resistentes. O presente estudo teve como objetivo purificar e caracterizar bioquimicamente o conteúdo peptídico dos venenos das serpentes B. atrox e B. jararacussu, além de avaliar as atividades antimicrobiana e antiparasitárias dos peptídeos frente as cepas: Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Leishmania amazonensis (IFLA/BR/97/PH8), e Plasmodium falciparum (clone W2, resistente à cloroquina). Neste trabalho realizou-se uma análise abrangente dos peptídeos presentes nos venenos de B. atrox e B. jararacussu utilizando a combinação de ultrafiltração em Amicon de 3kDa, cromatografia líquida de alta perfomance em fase reversa e espectrometria de massas com ionização por electrospray (Electrospray-Ion Trap-Time of Flight). Foram identificados 16 peptídeos em ambos os venenos, com massas moleculares de 444,17 a 1.356,73 Da e estrutura primária variando de 3 a 13 aminoácidos. Dentre os quais, 13 são sequências únicas, incluindo 7 peptídeos e 6 peptídeos potenciadores de bradicinina (BBPs). Os demais peptídeos referem-se a 2 inibidores de metalopeptidases encontrados em ambos os venenos, porém não descritos para estas espécies, além de 1 BPP identificado no veneno de B. atrox, o BPP-Bax12 com sequência peptídica descrita. Alguns dos novos peptídeos identificados apresentaram atividade antibacteriana contra K. pneumoniae, P. aeruginosa e S. aureus, e baixa atividade hemolítica, porém não demonstraram atividade antiparasitária. Portanto, neste estudo foram identificados 13 novos peptídeos a partir dos venenos de B. atrox e B. jararacussu, e alguns com atividades bacterianas relevantes, que podem auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos contra microrganismos multirresistentes.