Espécies de serpentes com ampla distribuição geográfica e sujeitas a diferentes condições de temperatura e precipitação ao longo de suas áreas de ocorrência podem apresentar variação geográfica em caracteres morfológicos e ecológicos (e.g. dieta e reprodução). Neste estudo, foi investigado se populações de Bothrops jararaca habitantes de áreas litorâneas e de áreas adjacentes mais elevadas da Serra do Mar e do planalto do estado de São Paulo, apresentavam variação geográfica em caracteres morfológicos e associados à biologia alimentar e reprodutiva. Foram analisados 831 espécimes de imaturos e adultos de ambos os sexos depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Butantan (IBSP) e dados adicionais de 42 indivíduos alimentados das áreas supramencionadas obtidos de trabalhos não publicados. Indivíduos jovens da população de altitude consomem presas endotérmicas (mamíferos) em freqüência significativamente maior em relação aos da população litorânea. Isso deve estar relacionado à maior disponibilidade de anuros ao longo do ano nas áreas litorâneas ou ao fato dos jovens das áreas de altitude selecionarem e serem capazes de ingerir presas endotérmicas apesar de seus pequenos tamanhos corporais. Entre os indivíduos sub-adultos e adultos das duas populações, não houve diferenças significativas nos tipos (ectotérmicas e endotérmicas) e nas classes (grupos taxonômicos) de presas consumidas, possivelmente porque esses indivíduos se alimentam de presas endotérmicas assim que possível ao longo da ontogenia, abandonando itens alimentares relativamente pequenos. Apesar das jararacas das áreas de altitude provavelmente estarem menos ativas durante os meses mais frios e secos do ano e se alimentarem com menor freqüência durante esse período, esses indivíduos aparentemente não compensam as menores oportunidades de tomada de alimento consumindo presas em freqüência superior aos coespecíficos das áreas costeiras durante os meses mais quentes e úmidos do ano. Os indivíduos da população de altitude consomem itens alimentares relativamente maiores e possuem, para quase todas as classes de tamanho estabelecidas, maior comprimento rostro-cloacal, maior tamanho relativo de cabeça e maior robustez em relação àqueles das áreas litorâneas. É possível que a sazonalidade climática mais acentuada das áreas de altitude restrinja a extensão do período de atividade e a eficiência alimentar das serpentes habitantes dessas áreas, constituindo um agente seletivo para o consumo de presas maiores. A diferença no tamanho das presas ingeridas deve ser um dos fatores relacionados às diferenças nas dimensões corporais entre as jararacas da costa e aquelas das áreas de maior altitude. Apesar das diferenças climáticas entre as duas áreas, o ciclo reprodutivo de ambos os sexos é sazonal e não difere entre as populações, provavelmente porque esse deve ser um caráter conservativo no gênero Bothrops. Jararacas de áreas de maior altitude da Serra do Mar e do planalto atingem a maturidade sexual com menor tamanho corporal, possuem maior fecundidade relativa e presumivelmente maior massa relativa de ninhada em relação àquelas das áreas litorâneas, o que deve estar associado, ao menos em parte, à dieta mais calórica dessa população. Os neonatos das áreas de altitude aparentemente possuem maiores dimensões corporais em relação aos do litoral, o que deve estar associado a maior freqüência no consumo de presas endotérmicas pelos primeiros. É sugerido que algumas diferenças entre as populações para os caracteres morfológicos e associados à biologia reprodutiva são devido à plasticidade fenotípica da espécie e outras devidas a mudanças evolutivas. / Widely distributed snakes exposed to different conditions of temperature and precipitation throughout their distributions may present geographic variation in morphological and ecological characters (e.g. diet and reproduction). In this study, I investigate whether Bothrops jararaca populations from coastal and adjacent mid-elevation sites of the Serra do Mar and plateau in São Paulo state presented geographic variations in morphological characters and in characters associated to feeding and reproduction. I analyzed 831 specimens among immature and adults of both sexes deposited in the Coleção Herpetológica do Instituto Butantan (IBSP). Data concerning 42 fed individuals from the studied areas taken from unpublished works were also included. Juveniles from the mid-elevation sites feed on endothermic preys (mammals) in higher frequency in relation to that from the coastal sites, which might be due to the higher anuran availability throughout the year at the coastal sites, and/or because the juveniles from the mid-elevation sites select and they are capable of ingest endothermic preys despite their small body size. There were no significant differences among sub-adults and adults from the two populations in the kinds (ectothermic and endothermic) and classes (taxonomic groups) of the prey consumed, which is possibly related to the fact that the individuals from both sites consumes endothermic prey as soon as possible throughout the ontogeny and abandon relatively small items. Although the jararacas from the mid-elevation sites probably are less active during the coldest and driest months of the year and feed less frequently during this period in relation to that of the coastal sites, these individuals did not seem to compensate the fewer opportunities of taking prey by feeding in higher frequency in relation to the coespecifics from the coastal sites during the hottest and warmest months of the year. The specimens from mid-elevation populations consume relatively larger prey and they have larger bodies, relative larger heads, and are stouter for most of the size classes established. It is possible that the more seasonal climate of the mid-elevation sites restricts the extension of the activity period and the feeding efficiency of snakes, which could correspond to a selective agent related to the consumption of larger prey. The difference in diet might be one of the factors that are related to differences in body dimensions between populations from the coast and from mid-elevation sites. Although there are climate differences between the two studied sites, the reproductive cycle of both sexes is seasonal and did not differ between the populations, possibly because this should be a conservative character in the genus Bothrops. The individuals from the higher Serra do Mar and plateau sites become mature with smaller body size, have higher relative fecundity and presumably higher relative clutch mass in relation to those of the coastal sites. These results should be associated, at least partially, to the more caloric preys ingested by the population from the altitude sites. The neonates from the altitude sites seem to have larger body size in relation to those from the coastal sites, what should be associated with the higher frequency of endothermic prey in their diet. It is suggested that some differences between the populations in morphological characters and for the characters associated to the reproductive biology are due to the species phenotypic plasticity and others to evolutionary changes.

Escherichia coli enteropatogênica causa uma lesão denominada attaching and effacing, codificadas por genes presentes na região LEE, que está sujeita a regulação por diferentes fatores incluindo por quorum sensing. O veneno de Bothrops jararaca é uma mistura de vários componentes com diferentes efeitos biológicos. Para analisar o efeito de suas frações na interação de EPEC com HEp-2, o veneno foi ultrafiltrado. Testes mostraram que a concentração de 100 ng de fração causou um aumento de adesão bacteriana, sugerindo componente no veneno que potencializa a adesão até certa concentração. Fenótipo das amostras com concentração mais alta foi parecido ao do controle, exceto com 1000 ng da menor fração, onde a adesão foi menor, sugerindo que há componente que afeta negativamente a adesão bacteriana em concentração maior. Estes resultados mostram como diferentes componentes de veneno de serpentes afetam a interação bactéria-célula hospedeira, e apresentam potencial biológico de componentes de baixo peso molecular no veneno. / Enteropathogenic Escherichia coli causes a lesion named attaching and effacing, encoded by genes present in LEE region, which is subject to regulation by different factors including quorum sensing. Bothrops jararaca venom is a mixture of different components with different biological effects. To analyze the effect of its fractions in interactions between EPEC and HEp-2, venom was ultrafiltered. Tests showed that a fraction concentration of 100 ng caused an increase of adherence when compared to the control, suggesting that there is a component in the venom that potentiates the adherence up to a certain concentration. Phenotype of samples with higher concentration were similar to that of the control, except the one with 1000 ng of the lowest fraction, where adherence decreased, indicating that there is a component able to negatively affect adherence when in higher concentration. These results show how different snake venom components can affect a bacteria-host cell interaction, and present biological potential of components of low molecular weight present in venom.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.

INTRODUÇÃO: Desde 1930, quando o primeiro caso de sensibilização alérgica a um veneno ofídico foi descrito na literatura, os venenos de todas as principais famílias de serpentes têm sido implicados como causadores de reações alérgicas. O desenvolvimento deste tipo de hipersensibilidade tem sido descrito após recorrentes exposições aos venenos através de picadas e, presumivelmente, de repetidas inalações ou contato desses venenos com a pele ou membranas mucosas. Esta condição tem sido observada entre os profissionais que manuseiam as serpentes e/ou os seus venenos. Entretanto, pouco se conhece a respeito da prevalência dessa doença entre esses trabalhadores, seus determinantes, e natureza molecular dos alérgenos envolvidos. Os objetivos deste estudo foram avaliar a prevalência da alergia ao veneno de Bothrops jararaca, apontando os fatores preditores para o seu desenvolvimento, entre trabalhadores expostos à serpente e/ou ao seu veneno, e demonstrar o envolvimento de um mecanismo IgE-mediado neste tipo de doença ocupacional. MÉTODOS: Sessenta e sete herpetologistas de um instituto de pesquisa, expostos à serpente Bothrops jararaca e/ou ao seu veneno, foram submetidos a um questionário e a testes imunológicos, para avaliar a presença de alergia ao veneno. A sensibilização ao veneno foi determinada pela quantificação de anticorpos da classe IgG e IgE, específicos ao veneno de Bothrops jararaca, através dos testes sorológicos ImmunoCAP e ELISA. Os alérgenos foram caracterizados através de Western blotting e de ensaios de inibição do ImmunoCAP. RESULTADOS: Doze dos 67 trabalhadores reportaram sintomas alérgicos variando desde urticária, rinoconjuntivite e asma, até anafilaxia. Sete indivíduos apresentaram anticorpos IgE específicos ao veneno de Bothrops jararaca (prevalência = 10,4%). Destes, seis apresentavam sintomas clássicos de reações alérgicas IgE-mediadas, quando expostos ao veneno botrópico. A presença de anticorpos IgG específicos também foi observada nos indivíduos com sensibilização alérgica ao veneno. O nível sérico elevado de IgE total (p=0,034), o tempo de exposição ocupacional (p=0,042), o manuseio de veneno em pó (p=0,014) e, possívelmente, a história pessoal de atopia (p=0,051), se constituíram em fatores preditores associados à sensibilização. Um componente do veneno de aproximadamente 32 kDa, que apresentou intensa ligação à IgE sérica de dois trabalhadores sensibilizados, pode ser um dos alérgenos principais desse veneno. Os ensaios de inibição do ImmunoCAP sugeriram a possibilidade de reações cruzadas ente os venenos de Bothrops jararaca e Crotalus durissus durissus. CONCLUSÕES: O veneno de Bothrops jararaca pode ser considerado uma importante fonte de alérgenos responsável pelo desenvolvimento de alergia ocupacional em trabalhadores que manuseiam as serpentes e/ou os seus venenos, através de mecanismo IgE-mediado. A prevalência da sensibilização alérgica a este veneno, neste grupo de trabalhadores, é da ordem de 10,4%, e o nível sérico elevado de IgE total, o tempo de exposição à serpente ou ao seu veneno, o manuseio do veneno em pó e, possívelmente, a história pessoal de atopia, são importantes fatores preditores. / BACKGROUND: Allergic sensitization to snake venom was first reported in 1930 and since that time, venoms from the major snake families have been implicated as cause of allergic reactions. The development of hypersensitivity to snake venom has been described after recurrent exposure through bites and, presumably, through repeated inhalations or repeated contact of the venom with skin or mucous membranes. This condition has been observed in amateur and professional snake handlers. However, only limited information is available on the prevalence of the disease among those workers, their determinants and the molecular nature of these allergens. The aim of this study was to evaluate the prevalence and the predictors of snake venom allergy among workers exposed to Bothrops jararaca venom and to demonstrate the involvement of IgE-mediated mechanisms in this occupational disease. METHODS: Sixty seven workers exposed to Bothrops jararaca snakes and/or their venoms in a research institute were assessed for snake venom-related allergy using questionnaires and immunological tests. Presence of snake venom sensitization was determined by quantification of specific IgE and IgG to Bothrops jararaca venom using the UniCAP® system and ELISA. Allergens were characterized by Western blotting and ImmunoCAP inhibition assays. RESULTS: Twelve of the 67 workers experienced symptoms ranging from urticaria, rhinoconjuctivitis and asthma to anaphylaxis. Seven individuals had specific IgE antibodies to Bothrops jararaca snake venom (prevalence = 10,4%). Six of them had typical symptoms of an IgE-mediated allergic reaction when exposed to Bothrops venom. Specific IgG antibodies could also be observed in sensitized individuals. High levels of total IgE (p=0,034), exposure level (p=0,042), handling of dried venom (p=0,014) and personal history of atopy (p=0,051) could be demonstrated as predictors for sensitization. A component of approximately 32 kDa which strongly bound to specific-IgE may be the major allergen present in this venom. Cross-reactivity between Bothrops jararaca snake venom and Crotalus durissus durissus snake venom was demonstrated using ImmunoCAP inhibition. CONCLUSIONS: Bothrops jararaca snake venom can be considered a potential source of allergens which may result in occupational allergy in snake handlers though IgE-mediated mechanisms. The prevalence rate of this condition is 10,4% among these workers and the handling of dried venom, high levels of total IgE, exposure level and probably personal history of atopy are important predictors.

Este estudo teve por objetivos: i) caracterizar o influxo leucocitário induzido pelo veneno de Bothrops insularis (VBi); ii) avaliar a liberação de PGD2 e PGE2, TXA2 e LTB4 e das quimiocinas MCP-1 e KC induzida pelo VBi; iii) analisar a ação do VBi quanto a expressão protéica das enzimas ciclooxigenases (COX -1 e -2) e iv) avaliar a participação dos metabólitos das COX-1 e -2 e 5-LO no influxo leucocitário. O VBi causou aumento de leucócitos circulantes e do influxo de leucócitos PMN e MN para o local de sua injeção. Ainda, veneno induziu a liberação de PGD2, PGE2, TXA2 e LTB4, da MCP-1, mas não da KC, além da expressão protéica de COX-2. O tratamento dos animais com indometacina, etoricoxibe ou zileuton inibiu o influxo de leucócitos induzido pelo VBi na 12ª h. Em conclusão, o VBi tem capacidade de induzir influxo de leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios para o local de sua injeção. O influxo leucocitário relaciona-se aos metabólitos das COX -1 e -2, 5-LO, da MCP-1 e do aumento de leucócitos circulantes / In this study the effects of Bothrops insularis venom (BiV) on the leukocyte influx, on the circulating leukocyte numbers and release of mediators, such as PGD2, PGE2, TXA2, LTB4, MCP-1 and KC into the local of its injection. Moreover, the role of eicosanoids in the BiV- induced leukocyte influx was assessed by selected pharmacological treatments. PMN were accumulated from 6 up to 24 h and MN cells from 3 up to 72 h when injected into the peritoneal cavity of mice. Moreover, BiV increased blood leukocyte at 3 h after injection and incresed the levels of PGD2, PGE2, TXA2, LTB4, MCP-1 at distinct periods of time. In addition, BiV induced the protein expression of COX-2 from 1 up to 12 h and the BiV-induced leukocyte influx was reduced by indomethacin or etoricoxib or zileuton at 12 h after injection. In conclusion, BiV is able to induce leukocyte influx and increase of blood leukocyte numbers. Moreover, the ability of BiV to induce expression of COX-2 and release of inflammatory mediators is relevant for the leukocytes influx into the local of its injection

Bothrops insularis é uma espécie de serpente endêmica da Ilha da Queimada Grande. Atualmente é considerada criticamente ameaçada de extinção. A espécie mais próxima filogeneticamente é a jararaca encontrada no continente (B. jararaca). Considerando a importância da alimentação e do crescimento em vários aspectos de vida das serpentes, o estudo dos diferentes tipos de presas em relação ao crescimento e maturidade sexual, é de grande importância para promover melhorias nos programas de reprodução e manejo de espécies ameaçadas mantidas em cativeiros conservacionistas. Portanto, este estudo tem como objetivo acompanhar o desenvolvimento (massa e crescimento) de B. jararaca e B. insularis até a maturidade sexual avaliando a influência de dois tipos de presas (anfíbio e mamífero). Os indivíduos foram divididos em grupos pelo tipo de presa oferecida, sexo e frequência alimentar (grupos alimentados a cada 15 e 30 dias) e alimentados com uma proporção de 30% da massa corporal de cada indivíduo. Observamos que nos primeiros seis meses de vida as serpentes exibem preferência por anfíbios. A alimentação com camundongo e a maior frequência (a cada 15 dias) proporcionou um maior crescimento comparado aos animais alimentados com rã inicialmente. Além disso, para B. insularis os animais alimentados com camundongo a cada 15 dias ficaram sexualmente maduros mais jovens e com um maior tamanho, enquanto que em B. jararaca o tipo de presa não influenciou na maturidade dos machos, porém teve influência evidente nas fêmeas. Concluímos que a dieta oferecida em cativeiro exerce influência no crescimento e no tamanho da maturidade sexual de serpentes. / Bothrops insularis is a species of serpent endemic to the Island of Queimada Grande. It is currently critically endangered. The phylogenetically closest species is the jararaca found on the continent (B. jararaca). Considering the importance of feeding and growth in various aspects of snake life, the study of different types of prey in relation to growth and sexual maturity is of great importance to promote improvements in breeding programs and management of endangered species kept in captivity conservationists. Therefore, this study aims to follow the development (mass and growth) of B. jararaca and B. insularis until sexual maturity evaluating the influence of two types of prey (amphibian and mammal). Individuals were divided into groups by type of prey offered, sex and feeding frequency (groups fed every 15 and 30 days) and fed with a proportion of 30% of the body mass of each individual. We observe that in the first six months of life the snakes exhibit preference for amphibians. Feeding with mouse and higher frequency (every 15 days) provided a higher growth compared to the animals fed with frog initially. In addition, for B. insularis, the animals fed with mouse every 15 days were sexually mature younger and with a larger size, whereas in B. jararaca the prey type did not influence the maturity of the males, however it had an evident influence on the females. We conclude that the diet offered in captivity influences the growth and size of the sexual maturity of snakes.

Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T17:40:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renno_AndreLisboa_M.pdf: 4228712 bytes, checksum: 0936c01dc377e3a0ea8aef8156dde24c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops pode resultar em manifestações sitemicas que incluem coagulopatias, hemorragias internas, choque cardiovascular e insuficiência renal aguda, sendo esta última a mais importante causa de morte após a picada. Neste trabalho, analisamos os aspectos morfofuncionais renais, além da expressão e/ou atividades da heme-oxigenase (HO), ciclo-oxigenase (COX) e superóxido dismutase (Cu/Zn-SOD) em ratos. Foi administrada uma dose única da peçonha Bothrops alternatus em ratos Wistar, e após diversos intervalos (1, 3, 6, 24, 48, 72 h e 7 e 15 dias pós-peçonha), foram coletados amostras de urina e os animais eutanasiados, com a coleta do tecido renal para os ensaios enzimáticos, análises de expressão gênica por PCR-real time e imunohistoquímica. A peçonha de B. alternatus causou oligúria, proteinúria, acidificação urinária, aumento da densidade e diminuição da depuração de creatinina; estas alterações foram proeminentes nas primeiras 24 horas pós-peçonha. Análises histológicas reveleram alterações morfológicas, como descamação tubular epitelial e microaneurismas glomerulares. Houve um aumento significativo da expressão gênica da COX-2 em 3 horas pós-peçonha, o que causou no aumento dos níveis de proteínas COX-2 observados no western blot e na imunohistoquímica; não houve mudanças significativas na expressão gênica da COX-1. A HO teve aumento em sua atividade no córtex e medula renal, sendo atribuída este aumento ao aumento da expressão da forma induzível HO-1, com pequenas mudanças da isoforma constitutiva HO-2. A Cu/Zn-SOD demonstrou um aumento da atividade no córtex renal. Estes resultados revelam que a peçonha B. alternatus afeta a função renal com mudanças na expressão/atividade de enzimas renais específicas. O aumento da expressão da HO-1 e da Cu/Zn-SOD pode estar associado a mecanismos de citoproteção no tecido renal, enquanto que o aumento da expressão da COX-2 pode estar ligado a respostas inflamatórias. Entretanto, não se pode descartar a possibilidade de que os produtos da COX-2 poderiam ajudar também na manutenção do fluxo sanguíneo renal. / Abstract: Envenoming by Bothrops snakes can result in systemic manifestations that include coagulopathy, internal hemorrhage, cardiovascular shock and acute renal failure, with the latter being the most important cause of death after such bites. In this work, we examined the changes in renal function and histology and the expression and/or activity of heme-oxygenase (HO), cyclooxygenase (COX) and superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD) in rats. Male Wistar rats were injected with a single dose (0.8 mg/kg, i.v.) of Bothrops alternatus venom and at various intervals thereafter (1, 3, 6, 24, 48, and 72 h and 7 and 15 days post-venom) urine samples were collected and the rats then killed to provide renal tissue for enzymatic assays, analysis of gene expression by real time-PCR and immunohistochemistry. Bothrops alternatus venom caused oliguria, proteinuria, urine acidification, an increase in urine specific gravity and a decrease in creatinine clearance; these alterations were most pronounced in the first 24 h post-venom. Histological analysis revealed morphological alterations that included tubule desquamation and glomerular microaneurysms. There was a significant increase in the gene expression of COX-2 at 3 h post-venom that subsequently reflected in enhanced COX-2 protein levels seen in western blots and immunohistochemistry; there were no significant changes in COX-1 gene expression. HO showed high levels of activity in renal cortex and medulla that was attributable to enhanced expression of the inducible isoform HO-1, with little change in the constitutive isoform HO-2. There was a significant increase in Cu/Zn-SOD activity and expression in the renal cortex. These results show that B. alternatus venom adversely affects renal function in rats and alters the expression and/or activity of selected renal enzymes. The enhanced expression and activity of HO-1 and Cu/Zn-SOD may reflect their involvement in a cytoprotective action in renal tissue, whereas increased COX-2 expression may be related to venom-mediated inflammatory responses, although a role for cyclooxygenase products in the regulation of renal blood flow cannot be excluded. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vega_SalomonHuancahuire_M.pdf: 1822310 bytes, checksum: 4712d36f0c1a5963a20bb4649d8aa879 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As enzimas PLA2 provenientes de veneno de serpentes são intensamente estudadas devido a que os envenenamentos constituem um dos principais problemas de saúde em muitos paises. Por outro lado, estas toxinas ajudam a revelar aspectos desconhecidos da fisiologia celular e tisular. Neste trabalho, apresentamos a purificação e a caracterização bioquímica e farmacológica de duas miotoxinas fosfolipases A2: BbTX-II e BbTX-III, a partir de veneno de Bothrops brazili. As duas proteínas foram isoladas e purificadas usando um procedimento simples e rápido envolvendo duas etapas cromatográficas, exclusão molecular em Sephadex G-75 e HPLC de fase reversa (C18). A eletroforese de ambas miotoxinas mostrou massas relativas em torno de 13 e 27 kDa (para monômeros e dímeros respectivamente). Espectrometria de massa por MALDI-TOf confirmou a pureza das proteínas e mostrou que possuem massas moleculares em torno de 13,8 kDa. A análise de aminoácidos mostrou alto conteúdo de aminoácidos básicos e hidrofóbicos, assim como 14 resíduos de Cys. BbTX-III apresentou atividade PLA2 na presença de um substrato cromogênico, mostrando comportamento sigmoidal, principalmente à baixas concentrações. Atividade máxima foi alcançada em pH 8 e entre 35-45 oC. BbTX-III mostrou-se completamente dependente de Ca2+ e, na presença dos íons Mg2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+, a atividade enzimática foi reduzida a níveis similares aos observados na ausência de Ca2+. A análise de composição de aminoácidos mostrou alta presença de Lys, His e Arg (pI 8,46). A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de 7 pontes dissulfeto. O estudo de homologia da seqüência da PLA2 BbTX-III mostrou que existem posições extremamente conservadas nas PLA2. S(1), L(2), E(4) 7 a 10 (QMIL), Y(21). Os resíduos conservados Y(28), G(30), G(32), D(49), H(48) e Y(52) estão direta ou indiretamente ligados com a catálise. Além disso, BbTX-III apresentou algumas mutações: K(35) -> G(35), R(51) -> Y(51) e D(118) -> A(118) que estão estrategicamente posicionadas para a expressão da atividade catalítica. Apesar destas substituições, as atividades farmacológicas e a atividade catalítica são mantidas. O efeito neurotóxico de BbTX-III foi analisado in vitro na preparação neuromuscular biventer cervicis de pintainhos. O resultado mostrou que a toxina é menos potente quando comparada com venenos crotálicos. BbTX-III demonstrou efeito miotóxico local in vivo através da liberação de creatina quinase (CK) e, efeito inflamatório, através de edema de pata. Como a BbTX-III produziu forte efeito inflamatório, a hidrólise de fosfolipídios poderia ser relevante neste fenômeno. BbTX-II foi caracterizada como uma PLA2 K49 (cataliticamente inativa) em função das características físico-químicas evidenciadas: massa de 13,68 kDa, 121 resíduos de aminoácidos, caráter básico (pI 8.73) e alto grau de homologia seqüencial na sua estrutura primária, quando comparada com outras PLA2B K49 procedentes de veneno de serpentes botrópicas. O alinhamento com outras seqüências completas de PLA2 BK49 mostrou a presença de algumas mutações importantes. Assim, as substituições Y?N(27), N?P(58) e L?F(114) não modificaram os efeitos biológicos aqui estudados, revelando que poderiam estar relacionados com outras atividades. Os resíduos N(28), K(111), L(32) poderiam contribuir com a interrupção da catálise. Esta nova PLA2 K49 BbTX-II mostrou miotoxicidade local in vivo, atividade inflamatória e letalidade, corroborando que se enquadra dentro da família de proteínas PLAB2B K49. Os estudos de neurotoxicidade revelaram um efeito neurotóxico in vitro na preparação biventer cervicis de pintainho (20 µg/ml). BbTX-II e BbTX-III mostraram ser miotoxinas com atividade edematogênica e neurotóxica, independentemente de apresentarem atividade catalítica (BbTX-III) ou não (BbTX-II) Apoiando a existência de regiões moleculares distintas à catalítica responsáveis pelos efeitos farmacológicos. Os efeitos farmacológicos da toxina BbTX-III (PLA2B D49) provavelmente tenham uma estrita relação entre a atividade enzimática e a ligação da toxina com micro-domínios na membrana plasmática onde sua atividade seja maximizada e cause danos relevantes na organização da membrana. No caso da BbTX-II (PLAB2 K49) possivelmente a combinação de aminoácidos aromáticos/hidrofóbicos e positivamente carregados da região C-terminal seja a responsável de alterar a integridade da membrana plasmática. / Abstract: The enzymes PLA2 coming of venom snake are studied intensely due to that the poisonings constitute one of the main problems of health in many countries. On the other hand, these toxins help to reveal unknown aspects of the cellular and tissue physiology. In this work, we presented the purification and biochemical and pharmacological characterization of two myotoxic phospholipases A2: BbTX-II and BbTX-III from Bothrops brazili venom. The two proteins were isolated and purified using a simple and fast procedure involving two chromatographic steps, molecular exclusion in Sephadex G-75 and reverse-phase HPLC (C-18 column). Both myotoxins showed around 13 and 27 kDa (for monomers and dimers, respectively) relative mass. MALDI-TOf mass spectrometry confirmed the purity of the proteins showing molecular masses around 13,8 kDa. Amino acid analysis showed a high content of hydrophobic and basic amino acids as well as 14 cysteine residues. BbTX-III presented PLA2 activity in the presence of a chromogenic substrate, showing sigmoidal behavior, mainly at low concentrations. Maximum PLA2 activity was reached at pH 8 and 35-45 oC. Maximum activity required Ca2+ and, in the presence of Mg2+, Mn2+, Cd2+ and Zn2+, was reduced at similar levels as observed in the absence of Ca2+. Amino acids analysis of composition showed high presence of Lys, His and Arg (pI 8,46). The presence of 14 cystein residues suggested the formation of 7 disulfide bridges. Sequence homology of the PLA2 BbTX-III revealed positions extremely conserved in PLA2 S(1), L(2), E(4) 7 to 10 (QMIL), Y(21). The conserved residues Y(28), G(30), G(32), D(49), H(48) and Y(52) are direct or indirectly linked to the catalysis. Besides, BbTX-III presented some mutations: K(35) -> G(35), R(51) -> Y(51) and D(118) -> A(118) that are strategically positioned for the expression of catalytic activity. Despite these substitutions, the pharmacological and catalytic activities are maintained. The neurotoxic effect of BbTX-III was analyzed in vitro at chick biventer cervicis muscle preparation. Our results showed that the blockage of the muscle contraction was lower when compared with crotalic venoms. BbTX-III demonstrated in vivo myotoxic local effect through the liberation of creatine kinase (CK) and inflammatory effect through paw edema. As BbTX-III produced strong inflammatory effect, the phospholipids hydrolysis could be relevant in this phenomenon. BbTX-II was characterized as PLA2 homologous K49 (catalytically inactive), because its chemical and physical evidenced characteristics: mass of 13,68 kDa, 121 amino acids residues, basic character (pI 8.73) and high sequential homology in its primary structure, when compared with other PLA2 K49 from venom of Botrhops serpents. The alignment with other complete sequences of PLA2 homologous K49 showed the presence of some important mutations. Substitutions Y->N(27), N->P(58), and L->F(114) did not modify the biological activities here studied, revealing that it could be related to other activities. The residues N(28), K(111), L(32) could contribute with the interruption of the catalysis. This new PLA2 K49 BbTX-II showed in vivo myotoxic local effect, inflammatory and lethality activities, evidencing it was fitted to the family of proteins PLA2 K49 homologous. Beside BbTX-II revealed in vitro neurotoxyc effect at chick biventer cervicis muscle preparation (20 µg/mL). BbTX-II and BbTX-III showed to be myotoxins to activity edematogenic and neurotoxyc independently of present catalytic activity (BbTX-III) or no (BbTX-II) Supporting the existence of molecular areas different to the catalytic responsible for the pharmacological effects. The pharmacological effects of the toxin BbTX-III (PLA2 D49) they probably have a strict relationship between the enzymatic activity and binding of the toxin with micro-domains in the plasmatic membrane where the activity is maximized and cause relevant damages in the organization of the membrane. In the case of the BbTX-II (PLA2 K49) possibly the combination of amino acids aromatics/hidrophobics and positively loaded of the area C-terminal it is the responsible of altering the integrity of the plasmatic membrane. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T22:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Huaco_FrankDenisTorres_M.pdf: 1348821 bytes, checksum: 7bec72fff88f5661bc63d110608d495c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste trabalho, descrevemos o isolamento e as caracterizações funcional e estrutural de uma nova metaloprotease, denominada BmHF-1. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops marajoensis, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, pela combinação de dois passos, cromatográficos: exclusão molecular em coluna Superdex G-75 acoplada ao sistema HPLC-biocompatível; e seguida de uma cromatografia em HPLC de fase reversa numa coluna C-18 -Bondapack. A nova metaloprotease BmHF-1 apresenta massa molecular de 27162,36 Da obtida por espectrometria de massas (MALDI-Tof) ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: In this present work we described the isolation, structural and functional characterization of a new metalloproteinase, named BmHF-1. This protein was isolated with a high degree of purity from the Bothrops marajoensis snake venom by the combination of two chromatographic steps, size exclusion in a Superdex G-75 column coupled to HPLC biocompatible system, followed by a HPLC-RP chromatographic procedure in a C-18 -Bondapack column. This new metalloproteinase had a molecular mass of 27162.36 Da determinate by MALDI-Tof mass spectrometry.....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular