Os filamentos branquiais da lagosta Americana, Homarus americanus, foram dissociados em solução salina fisiológica e os diversos tipos celulares separados em gradiente de 30, 40, 50 e 80% de sacarose através de centrifugação de alta velocidade. As células provenientes de cada solução de sacarose foram incubadas em 65Zn2+ visando caracterizar a tomada de zinco para cada tipo celular. A caracterização do acúmulo de zinco em cada célula foi investigada na presença e ausência de 10mM de cálcio (CaCl2), variadas concentrações de NaCl e pH, presença de 100 µM de verapamil, nifedipina (inibidores de canais de Ca2+) e ionóforo de cálcio, A23187. O influxo de 65Zn2+ foi descrito pela cinética de Michaelis-Menten nas concentrações de zinco variando de 1-1000 µM.. O cálcio externo não afetou o transporte de Zn para as células presentes no gradiente de 30% a 50% de sacarose, mas atuou como estimulador para as células em gradiente de 80% de sacarose. O cálcio reduziu o Km e a velocidade máxima de transporte (Vmax) para as células de 30% de sacarose, enquanto duplicou aparentemente a velocidade máxima de transporte para as células provenientes do meio em 80% de sacarose. Os resultados sugerem que o cálcio, sódio e prótons entram nas células branquiais através de um canal para cátion com ampla especificidade. Diferenças observadas no transporte de zinco em relação aos diferentes tipos de células aparentemente estão relacionadas com as diferentes taxas de afinidade de cada transportador em cada tipo celular. O transporte de 65Zn2+ também foi estudado em filamentos branquiais isolados e intactos, demonstrando propriedades de transporte muito parecidas com as observadas pelas células em gradiente de 80% de sacarose. Os resultados sugerem que a tomada de Zn se dá por processo de transporte na membrana apical das brânquias. Um modelo experimental para o transporte de Zn em células de brânquias de lagostas é apresentado. / Gill filaments of the American lobster, Homarus americanus, were dissociated in a physiological saline and separated into several cell types on a 30, 40, 50, and 80% sucrose gradient. Cells from each sucrose solution were separately resuspended in physiological saline and incubated in 65Zn2+ in order to assess the nature of metal uptake by each cell type. Characteristics of zinc accumulation by each kind of cell was investigated in the presence and absence of 10 mM calcium (CaCl2), variable NaCl concentrations and pH values, and 100 µM verapamil, nifedipine (calcium channel inhibitors), and the calcium ionophore, A23187. 65Zn2+ influxes were hyperbolic functions of zinc concentration (1-1000 µM) and followed the Michaelis-Menten kinetics. External calcium was neutral to cells from 30% to 50% sucrose, but stimulatory for cells from 80% sucrose. However, calcium reduced both apparent zinc binding affinity (Km) and maximal transport velocity (Jmax) for 30% sucrose cells, while doubling the apparent maximal transport velocity for 80% sucrose cells. Results suggest that calcium, sodium, and protons enter gill epithelial cells by way of an endogenous broad-specificity cation channel and trans-stimulate metal uptake by a plasma membrane carrier system. Differences in zinc transport observed between gill epithelial cell types appear related to apparent affinity differences of the transporters in each kind of cell. Low affinity cells from 30% sucrose were partially inhibited by calcium, while high affinity cells from 80% sucrose were stimulated. 65Zn2+ transport was also studied by isolated, intact, gill filament tips. These intact gill fragments generally displayed the same transport properties as did cells from 80% sucrose and provided support for metal uptake processes being an apical phenomena. A working model for zinc transport by lobster gill cells is presented.

SANTANA, Lígia Maria Borges Marques. Biologia reprodutiva e considerações sobre parasitismo em Lucina pectinata (Mollusca: Bivalvia) em um estuário tropical. 2010. 82 f. Dissertação (Mestrado em ecologia e recursos naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-05-24T17:38:29Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_lmbmsantana.pdf: 3328951 bytes, checksum: d38cb184022eec4e26ec677515458ed8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-27T20:39:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_lmbmsantana.pdf: 3328951 bytes, checksum: d38cb184022eec4e26ec677515458ed8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T20:39:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_lmbmsantana.pdf: 3328951 bytes, checksum: d38cb184022eec4e26ec677515458ed8 (MD5) Previous issue date: 2010 / In tropical estuaries, environments naturally complex due to the tides´s dynamics, the rainfall periods act as an intermediate disturbance. The environmental characteristics are important in the biota’s life history of the region, resulting in the establishment of reproduction patterns or interfering at organisms metabolism making them more susceptible to being affected by parasites. The bivalve Lucina pectinata (Gmelin, 1791), although appreciated in the Brazilian coast, was little studied in the country so far. This study aimed to characterize the reproductive biology of Lucina pectinata (Mollusca: Bivalvia, Lucinidae) from the Ceará river estuary, Fortaleza, CE, Brazil, and make considerations on trematode parasitism in this population, according to local environmental variations. Specimens collected had the gonads and gills assessed histologically. To determine the individuals sexual maturity, was employed gametogenic scale with four stages of gonadal development. Lucina pectinata presented continuous reproductive cycle, with peak spawning at dry season. The level of parasitism in the population was low, and the same is not being affected by the presence of parasites. Were observed proximity of the abiotic variables during the same season, distinguishing clearly the dry periods of rainy. Disturbance rainfall is discussed as a factor regulating the population of Lucina pectinata, contributing to its renewal and to control the incidence of trematode parasites. / Nos estuários tropicais, naturalmente complexos devido à dinâmica de marés, períodos de precipitação pluviométrica atuam como distúrbio intermediário. As características ambientais são imprescindíveis na história de vida da biota da região, resultando no estabelecimento de padrões de reprodução ou interferindo no metabolismo dos organismos podendo torná-los mais suscetíveis ao acometimento por parasitas. O bivalve Lucina pectinata (Gmelin, 1791), apesar de apreciado no litoral brasileiro, foi pouco estudado no país até o momento. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a biologia reprodutiva de Lucina pectinata (Mollusca: Bivalvia, Lucinidae) do estuário do rio Ceará, Fortaleza, CE, Brasil, e efetuar considerações sobre parasitismo por trematóides nesta população, em função das variações ambientais do local. Os exemplares coletados tiveram as gônadas e brânquias analisadas histologicamente. Para determinar a maturação sexual dos indivíduos, empregou-se escala gametogênica com quatro estádios de desenvolvimento gonadal. Lucina pectinata apresentou ciclo reprodutivo contínuo, com picos de desova na estação seca. O nível de parasitismo na população foi baixo, e a mesma não está sendo prejudicada pela presença de parasitas. Observaram-se semelhança das variáveis abióticas do local durante a mesma estação, distinguindo-se nitidamente os períodos secos dos chuvosos. O distúrbio pluviométrico é discutido como fator regulador da população de Lucina pectinata, contribuindo tanto para sua renovação quanto para controlar a incidência dos parasitas trematóides.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2037.pdf: 7513733 bytes, checksum: ae85e56e3e497054d13c4189f0a93d84 (MD5) Previous issue date: 2006-12-21 / The freshwater fish louse Dolops carvalhoi is an ectoparasite of pacu, Piaractus mesopotamicus capable of causing substantial damage to its hosts. The aim of this study was to investigate some aspects of the host-parasite interaction between these two species. For this purpose the physiological and morphological responses and the participation of the non-adaptive immune system of pacu to the experimental infestation with D. carvalhoi were analyzed. Three different experimental protocols were designed in order to find out the effects of the parasites on their hosts, the host responses that may interfere with parasite establishment and the influence of chronic exposure of hosts with juvenile D. carvalhoi to a second acute stressor of confinement. The results showed that even low level of adult parasite infestation is capable to induce a stress response in the hosts. No changes were observed regarding the plasma osmoregulatory parameters, while an increased number of gill chloride cells and enhanced N+/K+-ATPase activity suggested that gill adaptive adjustments may be responsible for the maintenance of hydromineral homeostasis in P. mesopotamicus during the stressful situation imposed by parasites. The infestation also induced changes in the frequency of circulating blood defense cells and in the epidermis morphology of the hosts. These responses were considered to be adaptive and they points out to the activation and participation of the non-specific immune system during the time course of infestation. Hosts which have experienced a previous D. carvalhoi infestation displayed a lower infestation density and different patterns of physiological, morphological and immunological responses when they were submitted to a re-infestation. Macrophages were activated in both infested and previously infested fish. The increased density of mucous cells in the epidermis of previously infested fish suggests the participation of mucus in the defense mechanisms and possibly in the parasite detachment. Chronic infestation with juvenile parasites did not induce a stress response in the hosts. On the other hand, they were capable of modulating the stress response of fish to a second acute stressor. In conclusion, infestation with D. carvalhoi induced physiological and morphological responses in P. mesopotamicus, which were considered to be adaptive, and activated the non-adaptive immune mechanisms of the hosts in order to cope with the stress and damages imposed by parasites. / O piolho-de-peixe branquiúro Dolops carvalhoi é um ectoparasito normalmente encontrado infestando pacus, Piaractus mesopotamicus, sendo capaz de causar-lhes danos substanciais. O objetivo do presente estudo foi investigar alguns aspectos da relação parasito-hospedeiro entre estas duas espécies. Para tal propósito, as respostas fisiológicas e morfológicas e a participação do sistema imune não-adaptativo de pacus experimentalmente infestados com D. carvalhoi foram analisadas. Três protocolos experimentais diferentes foram desenhados com o intuito de se investigar os efeitos dos parasitos sobre seus hospedeiros, as respostas dos hospedeiros que possam interferir no estabelecimento dos parasitos e a influência da exposição crônica dos hospedeiros às formas jovens de D. carvalhoi sobre as respostas ao estresse agudo de confinamento. Os resultados mostraram que mesmo baixos níveis de infestação com parasitos adultos são capazes de induzir uma resposta ao estresse nos hospedeiros. Nenhuma alteração foi verificada com relação aos parâmetros plasmáticos osmorregulatórios, enquanto que um aumento no número de células cloreto nas brânquias e na atividade específica da enzima Na+/K+-ATPase sugeriram que ajustes branquiais adaptativos podem ter sido responsáveis pela manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico em P. mesopotamicus durante a situação de estresse imposta pelos parasitos. A infestação induziu também mudanças na freqüência de células sanguíneas de defesa circulantes e na morfologia da epiderme dos hospedeiros. Estas respostas foram consideradas adaptativas e elas apontam para a participação do sistema imune não-adaptativo durante o período de infestação. Hospedeiros que experimentaram uma infestação prévia com D. carvalhoi apresentaram uma menor densidade de infestação e diferentes padrões de respostas fisiológicas, morfológicas e imunológicas quando foram submetidos a uma reinfestação. Os macrófagos foram ativados tanto em animais infestados quanto em previamente infestados. O aumento na densidade de células mucosas na epiderme de peixes previamente infestados sugere a participação do muco nos mecanismos de defesa e, possivelmente, na rejeição dos parasitos por parte dos hospedeiros. Infestações crônicas com as formas jovens dos parasitos não induziram respostas ao estresse nos hospedeiros. Por outro lado, elas foram capazes de modular as respostas ao estresse em peixes submetidos a um estressor agudo. Em conclusão, a infestação com D. carvalhoi induziu respostas fisiológicas e morfológicas em P. mesopotamcius, que foram consideradas adaptativas, e ativou os mecanismos de imunidade inata dos hospedeiros, permitindo que estes sobrevivessem ao estresse e outros danos impostos pelos parasitos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3620.pdf: 6241997 bytes, checksum: a8410d2f6c9083e06f888dd61a69934f (MD5) Previous issue date: 2011-03-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / The herbicide atrazine is one of the most common pesticides found in the aquatic ecosystems all over the world. In this study the effects of atrazine, at sublethal concentrations, were evaluated on the gills of Prochilodus lineatus. Juveniles P. lineatus were divided in 4 groups: control and exposed to atrazine (2, 10 e 25 μg.L-1) for 48 hours or 14 days. After the experimental periods, blood samples were taken by caudal puncture for ion plasma analusis and the gills were removed and samples were fixed for morphological analysis (chloride cell immunohistochemistry, scanning electron microscopy, histochemistry of mucous cells and histopathology) or frozen for biochemical analysis (Na+/K+-ATPase and oxidative stress enzyme activity, GSH and determination of lipid hydroperoxidation). The activity of antioxidant enzymes (SOD, CAT e GST) e lipid peroxidation increased in fish of group exposed to 10 μg.L-1 for 14 days. Although there was an increase on plasma Na+ e Cl- and osmolality in fish exposed for 14 days it was not characterized as ionic imbalance as the Na+/Cl- ratio was similar in all groups. The total number of chloride cells decreased significantly only in the group exposed to 25 μg.l-1 of atrazine (48 h) and the CC density at epithelial surface and the fractional surface area of chloride cells increase in both treatments (48 h and 14 days) in fish exposed to 25 and 10 μg.l-1, respectively. The Na+/K+-ATPase activity was not altered in any experimental condition. The number of mucous cells containing sulfated mucins decreased. Hypertrophy and disruption of lamellar epithelium and vascular congestion were the most common injuries found in the gill tissue of P. lineatus and in fish exposed to 25 μg.l-1 atrazine (14 dias) the histopathological changes index was calculate as slightly to moderate. In conclusion, the tested concentrations, which are similar to those found in natural environments, may cause alterations in the gills of P. lienatus, so as not to endanger the vital functions of the gills and homeostasis of the animal. The changes observed in the gill of P. lineatus after atrazine exposure at tested concentrations, similar to that found in the natural environment, suggested that atrazine may affect the organ function. / O herbicida atrazina é um dos pesticidas mais encontrados em ecossistemas aquáticos em todo o mundo. Nesse estudo os efeitos da atrazina, em concentrações subletais, foram avaliados nas brânquias de Prochilodus lineatus quanto aos aspectos morfo-funcionais do órgão. Exemplares juvenis de P. lineatus foram divididos em 4 grupos: controle e expostos à atrazina (2, 10 e 25 μg.L-1) por 48 horas ou 14 dias. Após os períodos experimentais, amostras de sangue foram obtidas por punção caudal para análise dos íons plasmáticos, as brânquias foram removidas e amostras fixadas para análise morfológica (imunohistoquímica de células-cloreto, microscopia eletrônica de varredura, histoquímica de células mucosas e histopatologia) ou congeladas para análises bioquímicas (atividade da enzima Na+/K+-ATPase e enzimas antioxidantes, GSH e determinação de hidroperóxidos de lipídios). A atividade das enzimas de defesa antioxidante (SOD, CAT e GST) e formação de hidroperóxidos de lipídeos aumentou no grupo exposto a 10 μg.L-1 por 14 dias. Apesar de ocorrer um aumento na Na+ e Cl- e na osmolaridade plasmática do grupo exposto por 14 dias não foi caracterizado desequilíbrio eletrolítico visto que a razão Na+/Cl- foi similar em todos os grupos. O número total de células-cloreto (CC) diminuiu significativamente apenas no grupo exposto a 25 μg.L-1 de atrazina (48 h) e houve um aumento da densidade das CCs na superfície epitelial e da área fracional das CCs em ambos os tratamentos (48 h e 14 dias) nas concentrações de 25 e 10 μg.L-1, respectivamente. A atividade da enzima Na+/K+-ATPase não foi alterada em nenhuma condição experimental. Em ambos os períodos houve uma diminuição no número de células mucosas contendo mucinas sulfatadas. Hipertrofia e ruptura do epitélio lamelar e congestão vascular foram as lesões mais comuns encontradas no tecido branquial em animais expostos a atrazina a 25 ugL-1 (14 dias) e o Índice de Alterações Histopatologicas foi calculado como leve a moderado. As alterações observadas nas brânquias de P. lineatus após a exposição a atrazina sugere que nas concentrações testadas, similares às encontradas em ambientes naturais, pode causar alterações moderadas nas brânquias e comprometer as funções do órgão.

Os filamentos branquiais da lagosta Americana, Homarus americanus, foram dissociados em solução salina fisiológica e os diversos tipos celulares separados em gradiente de 30, 40, 50 e 80% de sacarose através de centrifugação de alta velocidade. As células provenientes de cada solução de sacarose foram incubadas em 65Zn2+ visando caracterizar a tomada de zinco para cada tipo celular. A caracterização do acúmulo de zinco em cada célula foi investigada na presença e ausência de 10mM de cálcio (CaCl2), variadas concentrações de NaCl e pH, presença de 100 µM de verapamil, nifedipina (inibidores de canais de Ca2+) e ionóforo de cálcio, A23187. O influxo de 65Zn2+ foi descrito pela cinética de Michaelis-Menten nas concentrações de zinco variando de 1-1000 µM.. O cálcio externo não afetou o transporte de Zn para as células presentes no gradiente de 30% a 50% de sacarose, mas atuou como estimulador para as células em gradiente de 80% de sacarose. O cálcio reduziu o Km e a velocidade máxima de transporte (Vmax) para as células de 30% de sacarose, enquanto duplicou aparentemente a velocidade máxima de transporte para as células provenientes do meio em 80% de sacarose. Os resultados sugerem que o cálcio, sódio e prótons entram nas células branquiais através de um canal para cátion com ampla especificidade. Diferenças observadas no transporte de zinco em relação aos diferentes tipos de células aparentemente estão relacionadas com as diferentes taxas de afinidade de cada transportador em cada tipo celular. O transporte de 65Zn2+ também foi estudado em filamentos branquiais isolados e intactos, demonstrando propriedades de transporte muito parecidas com as observadas pelas células em gradiente de 80% de sacarose. Os resultados sugerem que a tomada de Zn se dá por processo de transporte na membrana apical das brânquias. Um modelo experimental para o transporte de Zn em células de brânquias de lagostas é apresentado. / Gill filaments of the American lobster, Homarus americanus, were dissociated in a physiological saline and separated into several cell types on a 30, 40, 50, and 80% sucrose gradient. Cells from each sucrose solution were separately resuspended in physiological saline and incubated in 65Zn2+ in order to assess the nature of metal uptake by each cell type. Characteristics of zinc accumulation by each kind of cell was investigated in the presence and absence of 10 mM calcium (CaCl2), variable NaCl concentrations and pH values, and 100 µM verapamil, nifedipine (calcium channel inhibitors), and the calcium ionophore, A23187. 65Zn2+ influxes were hyperbolic functions of zinc concentration (1-1000 µM) and followed the Michaelis-Menten kinetics. External calcium was neutral to cells from 30% to 50% sucrose, but stimulatory for cells from 80% sucrose. However, calcium reduced both apparent zinc binding affinity (Km) and maximal transport velocity (Jmax) for 30% sucrose cells, while doubling the apparent maximal transport velocity for 80% sucrose cells. Results suggest that calcium, sodium, and protons enter gill epithelial cells by way of an endogenous broad-specificity cation channel and trans-stimulate metal uptake by a plasma membrane carrier system. Differences in zinc transport observed between gill epithelial cell types appear related to apparent affinity differences of the transporters in each kind of cell. Low affinity cells from 30% sucrose were partially inhibited by calcium, while high affinity cells from 80% sucrose were stimulated. 65Zn2+ transport was also studied by isolated, intact, gill filament tips. These intact gill fragments generally displayed the same transport properties as did cells from 80% sucrose and provided support for metal uptake processes being an apical phenomena. A working model for zinc transport by lobster gill cells is presented.

Animais presentes em regiões de maior contaminação apresentam diferenças fisiológicas, quando comparados com animais de regiões menos contaminadas, provavelmente permitindo a sua sobrevivência em ambientes poluídos. Assim, o objetivo da tese foi caracterizar o transporte de cádmio em brânquias e hepatopâncreas de Ucides cordatus, como também comparar o transporte nestes órgãos, em animais de regiões poluídas (Itanhaém) e não poluídas (Juréia), além de analisar a porcentagem de ácidos graxos na membrana, níveis de metalotioneína (MT), lipoperoxidação (LPO) e mecanismo de acúmulo do metal. Assim, as células de brânquias anteriores (BA), posteriores (BP) e hepatopâncreas (H) foram separadas. Em seguida, realizou-se o transporte de cádmio em BA, BP, e em cada tipo celular do H, com ou sem a utilização de inibidores; o mesmo procedimento foi utilizado para caracterizar o transporte de cádmio em cada região estudada. Também foram analisadas a porcentagem de ácidos graxos, níveis de MT, LPO e mecanismos de detoxificação de cádmio. Observou-se um maior transporte através de canais de cálcio e trocadores Na+/Ca2+ em BP e nas células E, R e F de H, pois são células específicas para as trocas iônicas. Em animais de regiões poluídas, observou-se um maior transporte que ocorreu nos mesmos parâmetros, devido aos tipos celulares específicos envolvidos. Em animais de regiões contaminadas verificou-se maior porcentagem de MUFA em hepatopâncreas, acarretando em menor fluidez na membrana, e maior índice de LPO, devido ao estresse causado pela presença do contaminante no meio. Já em animais de regiões não poluídas, observou-se maior porcentagem de PUFA, com maior fluidez na membrana, e maior quantidade de MT, principalmente no hepatopâncreas, resultando na detecção de pequenas alterações ambientais. Nas brânquias, o cádmio se acumula em organelas intracelulares, enquanto em hepatopâncreas se ligam a MTs do citoplasma celular. Portanto, acredita-se que estes animais apresentaram diferentes mecanismos fisiológicos que permitiram a sua sobrevivência na região poluída / Animals resident in regions polluted by metals must have physiological mechanisms for survival, compared with animals from unpolluted regions. Therefore, the objective of this study was to characterize cadmium transport in gills and hepatopancreas of Ucides cordatus, and to compare this transport in animals from polluted (Itanhaém) and unpolluted (Juréia) regions. In addition, the animals were analyzed for cell membrane fatty acids composition, metallothionein levels (MT), lipid peroxidation (LPO) and mechanisms of accumulation of intracellular Cd. The anterior gills (BA), posterior gills (BP) and hepatopancreas (H) cells were separated. After, the transport of cadmium was realized in BA, BP and in each cellular type of H, with or without various inhibitors present. The same approach was utilized to characterize cadmium transport from crabs of polluted and unpolluted regions: fatty acids composition, MT levels, LPO and cadmium detoxification mechanisms were also analyzed. An increase in the transport of cadmium was observed through calcium channels and Na+/Ca2+ exchangers, in BP and in E, R and F cells of H, probably because they are specific cells for ion transport. In animals from polluted regions, we observed an increase in cell cadmium transport when compared with animals from unpolluted regions. Animals from polluted environments also presented more MUFA in H, leading to lower membrane fluidity, and higher LPO, probably due to the stress caused by pollution. In animals from unpolluted regions, we observed more PUFA in the plasma membrane, resulting in higher membrane fluidity, and more MT levels, mainly in H. In gills, intracellular cadmium accumulation occurred in organelles, whereas in H, Cd binding to MT in cellular cytoplasm was more evident. Therefore, we believe that animals from metal polluted environments present the above-described physiological mechanisms to deal with Cd, allowing their survival in this environment

O impacto dos metais na fisiologia de peixes tem sido considerado preocupante, pois são contaminantes críticos nos ecossistemas aquáticos devido ao seu alto potencial de entrar no organismo, acumular-se e ser transferido na cadeia trófica e muitos estudos têm demonstrado os efeitos sobre várias funções em animais, quando expostos a estes metais. O rio Paraíba do Sul vem apresentando concentrações de alumínio (Al) e manganês (Mn) acima dos valores permitidos pela legislação Brasileira e, além disso, fatores abióticos tais como a acidez da água, podem contribuir para alteração do potencial de toxicidade, podendo acarretar em danos à biota aquática. As respostas desencadeadas pelos animais a estas mudanças ambientais podem levá-los a um estado de estresse, que é altamente energético devido à realocação de substratos inicialmente destinados às atividades de elevada demanda energética, como crescimento e reprodução, em direção às atividades que requerem intensificação para restaurar a homeostase. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos metais Al e Mn em pH ácido, isoladamente e em combinação, durante 96 horas (teste agudo) nas brânquias e nos substratos metabólicos de fêmeas vitelogênicas de Astyanax bimaculatus e, adicionalmente após um período de 96 horas em água limpa, verificar a habilidade dos animais em se recuperar na ausência destes metais. Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais: CTR em pH neutro; pH ácido; Al; Mn; e Mn+Al. Os dados mostram que quando expostos a estes metais isoladamente, a atividade enzimática da bomba Na+/K+ ATPase e a quantidade de células de cloreto foram diminuídas, no entanto quando combinados, estes efeitos não foram observados. O Al isolado e em associação com o Mn promoveu peroxidação de fosfolipídios de membrana. Além disso nos animais expostos aos dois metais juntos, houve um aumento de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e saturados (STA) acompanhado pela diminuição dos ácidos graxos polinsaturados (PUFA) o que pode ter evitado alterações na atividade de bomba e na quantidade de células de cloreto na combinação destes metais. Considerando-se os substratos metabólicos, a exposição ao Al diminuiu a concentração de proteínas nos ovários e no plasma, glicogênio muscular, além de alterar as porcentagens de MUFA e PUFA no fígado, e PUFA nos ovários. O Al também promoveu lipoperoxidação hepática, e no período de recuperação houve diminuição da concentração de lipídios em vários tecidos analisados. A exposição ao Mn promoveu diminuição das concentrações de proteínas totais em todos os tecidos analisados, seja no período de exposição agudo ou de recuperação, não havendo a recuperação deste substrato no fígado e nos ovários; o Mn promoveu lipoperoxidação nos fosfolipídios das membranas do fígado e, em associação com o Al, pareceu interferir na dinâmica dos PUFA das membranas dos ovários. Várias interações foram observadas entre o Al e Mn, demonstrando casos de antagonismo, potenciação e até mesmo de sinergismo entre estes metais, dependendo do parâmetro fisiológico analisado, evidenciando que a exposição de fêmeas vitelogênicas a estes metais pode ser prejudicial ao processo reprodutivo principalmente devido à ação observada, inclusive nos ovários / The impact of metals in fish physiology has been considered worrying due to their high potential of entering in the organism, to accumulate and be transferred through the food chain and many studies have shown the effects on several functions in animals, when exposed to these metals. The Paraíba do Sul river showed aluminum (Al) and manganese (Mn) concentrations above the values allowed by the Brazilian law and moreover abiotic factors, such as acidic water, can contribute to changing the toxicity potential and can result in damage to aquatic biota. The answers triggered by the animals to these environmental changes can lead to a stress state which has a high energetic cost due to the substrate reallocation, initially designated to activities with high energetic demand, as growth and reproduction, to activities that need to be intensified, to reestablish the homeostasis. The main goals of this study were to evaluate the effects of the metals Al and Mn in acidic pH, alone and in combination, during 96 hours (acute test) in the gills and in metabolic substrates in Astyanax bimaculatus vitelogenic females and, additionally, verify the ability of the animals to recover in the absence of the metals after the 96 hours in clear water. The animals were divided in 5 groups : CTR in neutral pH; acidic pH; Al; Mn; and Mn+Al. The results showed that when the animals were exposed to the isolate metals, there was a decrease in the Na+/K+ ATPase pump activity and in the amount of chloride cells, however when combined, these effects were not observed. Al, isolated or in association with Mn, promoted phospholipids peroxidation in gill membranes. Furthermore, in the animals exposed to both metals together, there were an increase in monounsaturated fatty acids (MUFA) and saturated fatty acids (STA) and decrease in polyunsaturated fatty acids (PUFA) which may have avoided alterations in pump activity and in the amount of chloride cells. In the metabolic substrates, Al exposition decreased plasma and ovaries protein concentration, muscle glycogen, and altered the percentage of MUFA and PUFA in the liver, and PUFA in the ovaries. Al also promoted liver lipoperoxidation, and in the recovery period lipid content decreased in most tissues analyzed. Mn exposition promoted a decrease in total protein content in all tissue analyzed, both in the acute and recovery periods, and there was no recovery of this substrate in liver and ovaries; Mn promoted lipoperoxidation in liver phospolipids and, in association with Al, interfered in the PUFA dynamic in ovaries membranes. Many interactions were observed between Al and Mn, evidencing antagonism, potentiation and also synergism, depending on the physiologic parameter analyzed, showing that the exposition of vitellogenic females to these metals can be harmful to reproductive process due to the observed actions, including in ovaries

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-18T09:48:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1370187 bytes, checksum: ceb35f582d1346864b2f244421578979 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-18T09:48:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1370187 bytes, checksum: ceb35f582d1346864b2f244421578979 (MD5) Previous issue date: 2015-07-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O uso intensivo de agrotóxicos na agricultura tem levado à contaminação dos ambientes aquáticos. O diflubenzuron (Dimilin®) é um inseticida bastante usado em áreas agrícolas no combate a pragas de insetos e tem sido frequentemente utilizado nas pisciculturas devido à sua eficácia no controle de ectoparasitas em peixes. O uso indiscriminado deste inseticida nas pisciculturas pode resultar em toxicidade causando danos à saúde dos peixes. O objetivo desse trabalho foi discriminar a possível influência do sexo dos peixes em resposta à ação do inseticida Dimilin®, e determinar se a exposição subletal a este inseticida causa alterações na morfologia das brânquias de machos e fêmeas de Hyphessobrycon eques. Os peixes foram expostos às concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0 mg.L-1 de Dimilin® por 96 h e 17 dias. No experimento de 96 h foi realizada uma única aplicação do tóxico na água, e no experimento de 17 dias foram realizadas duas aplicações, sendo uma no primeiro dia e a outra no quarto dia de experimento. Ao final do experimento, amostras do tecido branquial de 10 animais de cada grupo foram coletados e processados para estudo histológico. Foram analisados dados morfométricos e histopatológicos em 10 campos por animal. A análise da água mostrou-se em conformidade com as condições de cultivo e criação de peixes tropicais. Alterações histológicas foram encontradas nas brânquias de machos e fêmeas de H. eques. As análises histopatológicas e morfométricas mostraram diferenças estatísticas (P<0,05) entre as concentrações dentro de um mesmo experimento no mesmo sexo. O Índice de Alteração Histopatológica (IAH), tanto em machos quanto em fêmeas, foi maior nas maiores concentrações (0,1 e 1,0 mg.L-1) nos experimentos de 96 h e 17 dias, indicando diferenças na comparação com o grupo controle e entre as concentrações dentro de um mesmo experimento. O Valor Médio de Alteração (VMA) foi maior em todos os grupos expostos ao Dimilin® nos tempos de exposição de 96 h e 17 dias em comparação com grupo controle. O IAH, o VMA e as análises morfométricas não mostraram reação específica do sexo, indicando que as brânquias de machos e fêmeas não reagiram de maneira diferente (P>0,05) após exposição a concentrações subletais do inseticida Dimilin®. Os resultados mostraram que mesmo nas concentrações mais baixas, o inseticida causou alterações morfológicas leves a moderadas nas brânquias de machos e fêmeas, comprometendo a função deste tecido. Assim, H. eques pode ser considerado bioindicador da contaminação ambiental por Dimilin®, e ser utilizado como modelo em ensaios toxicológicos e avaliações ambientais. / The intensive use of pesticides in agriculture has caused contamination of aquatic environments. Diflubenzuron (Dimilin®) is a widely used insecticide for agricultural areas in combating insect pests, and has been frequently used in fish farms due to its effectiveness in the control of fish ectoparasites. The indiscriminate use of this pesticide in pisciculture can result in toxicity causing fish health problems. The aim of this study to discriminate the possible influence of sex of the fish in response to the action of Dimilin®, to determine whether sublethal exposure to this pesticide causes changes in the morphology of the gills of male and female Hyphessobrycon eques. The fish were exposed to concentrations of 0.01, 0.1 and 1.0 mg.L-1 Dimilin® for 96 hours and 17 days. In the 96 hour experiment a single application of toxic in water was carried out and in the 17 days experiment two applications were performed, one one the first day and another on the fourth day of the experiment. At the end of the experiment, gill tissue samples of 10 animals from each group were collected and processed for histological study. Morphometric and histopathological findings in 10 fields per animal were analyzed. Analysis of the water showed in to be in accordance with the conditions for cultivation and creation of tropical fish. Histological changes were found in the gills of male and female Hyphessobrycon eques. Histologic and morphometric analyses showed significant differences (P<0.05) between the concentrations within the same experiment in the same sex. The histopathological alteration index (HAI), in both males and females was greater at higher concentrations (0.1 and 1.0 mg.L-1) in the 96 hours and 17 days experiments, indicating differences in comparison with the control group and between the concentrations within the same experiment. The mean alteration value (MAV) was higher in all groups exposed to Dimilin® in exposure times of 96 hours and 17 days compared to the control group. The HAI, the MAV and the morphometric analysis did not show a specific reaction of sex, indicating that the gills of males and females do not respond differently (P>0.05) after exposure to sublethal concentrations of insecticide Dimilin®. The results showed that even at lower concentrations the insecticide caused mild to moderate morphological changes in the gills of males and females, compromising tissue function. So, Hyphessonbrycon eques can be considered bioindicator of environmental contamination by Dimilin® and be used as a model in toxicological tests and environmental assessments.

A avaliação da qualidade da água do rio Piracicaba foi realizada utilizando diferentes metodologias e organismos teste, e para tanto, de fevereiro de 2011 a janeiro de 2012 amostras de água foram coletadas em seis locais de amostragens ao longo do rio Piracicaba. Parâmetros físicos e químicos da água foram mensurados e de acordo com a condutividade elétrica e demanda bioquímica de oxigênio, baixa qualidade foi observada em locais próximos a Americana e Piracicaba. Efeitos sobre a reprodução de Ceriodaphnia dubia e Ceriodaphnia silvestrii foram observados em fevereiro e março de 2011 e janeiro de 2012, e ocorreram em amostras coletadas próximas às cidades de Americana e Piracicaba. A avaliação das brânquias do peixe Danio rerio mostrou que para todos os meses, exceto fevereiro, setembro e outubro para alguns pontos, as alterações não foram significativas. Amostras de água coletada em todos os locais, assim como em todos os meses apresentaram valores de clorofila a abaixo do estabelecido pela legislação ambiental brasileira. A água coletada nos meses de outubro e novembro e aquelas amostradas à montante e à jusante de Piracicaba apresentaram maiores valores de índice de estado trófico comparado aos outros pontos e meses do ano, no entanto, não foram classificadas como eutrofizadas. Concentrações dos herbicidas atrazina e ametrina também foram determinadas na água do rio Piracicaba e variaram de 0,11 a 1,92 \'mü\'g L-1 e 0,25 a 1,44 \'mü\'g L-1, respectivamente, e mostraram ter potencial mutagênico e genotóxico para D. rerio. Um estudo avaliando a toxicidade da vinhaça antes e após a correção do pH também foi realizado já que o rio Piracicaba está localizado em uma região influenciada por plantações de cana-de-açúcar. Os resultados apresentados confirmam que a vinhaça possui alta toxicidade aguda para organismos aquáticos, no entanto, esta pode ser reduzida através da correção do seu pH para 6,5 / An assessment of water quality of the Piracicaba River was performed using different methodologies and organisms, and therefore, from February 2011 to January 2012 water samples were collected at six sampling sites along the Piracicaba River. Physical chemical parameters of the water were measured and demonstred low water quality according to the conductivity and biochemical oxygen in places close to Americana and Piracicaba. Effects on the reproduction of Ceriodaphinia dubia and Ceriodaphnia silvestrii were observed in February and March 2011, and January 2012 and occurred in samples collected close to Americana and Piracicaba cities. Evaluation of the gills of Danio rerio showed no significant difference during all months, except in February, September and October for some locations. During the study period, water samples collected in all sampling sites and months presented values of chlorophyll a below the limit set by the Brazilian environmental law. Water collected in October and November and those sampled upstream and downstream of Piracicaba presented higher values of throfic state index than the other sites and months, however, were not classified as euthrofic. Concentrations of atrazine and ametrine during the sampling period were also measured and ranged from 0.11 to 1.92 \'mü\'g L-1 and from 0.25 to 1.44 \'mü\'g L-1, respectively, and showed genotoxic and mutagenic potentials to D. rerio. A study evaluating the acute toxicity of vinasse before and after the pH correction was conducted due to the influence of sugar cane cultures on the Piracicaba River area. The results confirmed the high acute toxicity of vinasse to aquatic organisms, however, this can be reduced by correcting its pH to 6.5

Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de Na+ a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por Na+ é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por Na+. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de Na+ através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não está estabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-ATPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21&#8240; ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5-21&#8240;), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da fração microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades K+-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de Na+. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duas bandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade &#945; da (Na,K)-ATPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio (nH= 1,4), com V= 43,4 ± 2,2 U mg-1 e K0,5= 1,13 ± 0,06 mmol L-1. A estimulação da atividade da enzima por K+ (V= 39,9 ± 1,9 U mg-1 e K0,5= 4,2 ± 0,2 mmol L-1), Mg2+ (V= 45,0 ± 2,2 U mg-1, K0,5= 0,82 ± 0,04 mmol L-1) e NH4+ (V= 31,7 ± 1,6 U mg-1, K0,5= 19,0 ± 0,9 mmol L-1) também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente da enzima pelo PNFF e Mg2+ foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons K+ que as outras espécies já estudadas. A atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por K+ e NH4+ sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol L-1) inibiu a atividade PNFFase total da preparação (&#8776; 89%), por meio de uma curva monofásica (KI= 225,6, ± 11,3 µ mol L-1), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1µmol L-1) inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 ± 0,32 U mg-1 e K0,5 = 0,34 ± 0,02 µmol L-1) e baixa afinidade (V= 127,1 ± 6,2 U mg-1e KM = 84 ± 4,1 µmol L-1). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons Na+ (V = 133,8 ± 7,3 U mg-1e K0,5= 4,7 ± 0,3 mmol L-1), Mg2+ (V= 136,5 ± 8,0 U mg-1, K0,5= 0,62 ± 0,04 mmol L-1), K+ (V = 131,7± 7,9 U mg-1 e K0,5= 0,47 ± 0,03 mmol L-1) e NH4+ (V= 125,6 ± 6,3 U mg-1, K0,5= 1,90 ± 0,09 mmol L-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente por Na+ da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por K+ é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por Na+. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de K+ expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de K+ na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por K+ e NH4+. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode ser importante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol L-1) inibiu a atividade ATPase total (&#8776; 78%) por meio de uma curva bifásica (KI= 6,21 ± 0,32 µmol L-1 e 101,2 ± 5,1 µmol L-1), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 µmol L-1), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 ± 1,3 U mg-1; K0,5= 3,9 ± 0,2 mmol L-1) e Mg2+ (V = 27,9 ± 1,4 U mg-1; K0,5 =0,80 ± 0,04 mmol L-1) ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina A1 ocorreu segundo uma curva monofásica (KI= 55,0 ± 2,8 nmol L-1). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21&#8240;. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21&#8240;, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21&#8240;. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A1. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg2+) quanto V0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de captura ativa de Na+ em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21&#8240; mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-ATPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5&#8240;) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e Mg2+. / Crustacean arose in the sea but, during evolution, several species invaded lower salinity biotopes, reaching fresh water. The ability of crustaceans to successfully colonize the freshwater biotope depends on efficient mechanisms of hyperosmoregulation. In dilute media, crustaceans\' hemolymph osmolality and ionic composition reflect a balance between diffusive and urinary ion losses, and active ion capture through the gills. The gill (Na,K)- ATPase plays a pivotal role in Na+ capture from dilute environments and its kinetic characteristics are under investigation in recent years, although freshwater crab enzymes are poorly known. According to the most recent model, the apparent affinity for Na+ is the most variable kinetic parameter among gill enzymes from different species, and reflects the salinity of the species\' habitat. Thus, enzymes from species which are well adapted to freshwater usually present higher affinities for Na+. However, several recent results are incompatible with this model. On the other hand, it has been proposed that a V-ATPase is also involved in Na+ capture through the gills of hololimnetic crustaceans. This enzyme is almost completely unknown: its kinetic characteristics have not been studied yet and the relationship between the magnitude of its activity in the gills and the external medium salinity has not been established. This work aimed to characterize the (Na,K)-ATPase and V-ATPase from the posterior gill from the holimnetic crab Dilocarcinus pagei, considered an old fresh water colonizer. The (Na,K)- ATPase was characterized in animals maintained in fresh water, in order to establish a comparison of its kinetic properties with those of enzymes from other crab species that inhabit more saline media. This comparison may enhance our understanding of the biochemical adaptations associated to fresh water invasion. V-ATPase was characterized in animals kept in fresh water or exposed for varying time intervals to a medium of 21? salinity, or else acclimated for 10 days to media of different salinities (5-21?), aiming to establish a relationship between the enzyme specific activity in the gill tissue and the external salinity, and also investigate the mechanisms involved in enzyme activity regulation. The analysis of D. pagei gill microsomes in a continuous-density sucrose gradient revealed two protein peaks (25-35% and 35-45% sucrose), both showing K+-phosphatase, (Na,K)-ATPase and V-ATPase activities. These results indicate the presence of membrane fractions of distinct densities, both presenting the main ion pumps involved in Na+ capture. These membranes may originate from different places in the asymmetric posterior gill epithelium from this crab. Western compared to those reported for other freshwater animals, but similar to those found for estuarine/marine species. In contrast, the apparent affinity for K+ is 2.5 to 5-fold higher than those estimated for species that inhabit more saline media, and is apparently more related to the animals\' habitat than Na+ affinity. This possibility is consistent with the location of the (Na,K)-ATPase in crabs gill tissue, with K+ binding sites exposed to the hemolymph, allowing the direct modulation of enzyme activity by hemolymph K+ concentration. In contrast to data reported for other crab species, D. pagei gill (Na,K)-ATPase activity was not synergistically stimulated by K+ and NH4 +. However, the presence of one of these ions in the reaction medium results in an increase of about 3-fold in the apparent affinity of the enzyme for the other. This kinetic characteristic may be physiologically relevant to assure the transport of both ions, even in the presence of elevated concentrations of the other. Ouabain (3 mmol L-1) inhibited total ATPase activity (? 78%) through a biphasic curve (KI= 6.21 ± 0.32 mol L-1 and 101.2 ± 5.1 mol L-1) reinforcing previous results suggesting the presence of two isoenzymes in the microsomal preparations. A biphasic inhibition by orthovanadate (10 mol L-1) to about 15% residual activity was also observed. Optimal pH for D. pagei gill V-ATPase activity was 7.5. The modulation of enzyme activity of the animal kept in fresh water by ATP (V= 26.5 ± 1.3 U mg-1; K0.5= 3.9 ± 0.2 mmol L-1) and Mg2+ (V = 27.9 ± 1.4 U mg-1; K0.5 =0.80 ± 0.04 mmol L-1) occurred with positive cooperativity. The inhibition of the orthovanadate insensitive ATPase activity by bafilomycin A1 followed a monophasic curve (KI= 55.0 ± 2.8 nmol L-1). About 44 % of total ATPase activity was inhibited, corresponding to the V-ATPase. Dilocarcinus pagei gill V-ATPase activity substantially decreased in response to animal\'s exposure to 21? salinity. After 1h exposure, the activity diminished about 3-fold, reaching 4- fold after 24h, indicating the action of efficient short-time regulation mechanisms. Interestingly, V-ATPase activity was about 2-fold higher after 120h exposure, compared to 24h, although 2- fold lower compared to that estimated in fresh water. After 240h, the activity returned to the low levels observed for 1 and 24 h, indicating efficient long-term regulation. Besides the decrease in specific activity, it was also observed an increase in enzyme\'s apparent affinity for ATP (12 fold) and Mg2+ (3 fold) in response to animal\'s exposure to 21? salinity. Simultaneously, the enzyme\'s affinity for bafilomycin A1 increased up to 190-fold. We propose that, in response to salinity alteration, conformational changes take place both in V1 (in which the ATP and Mg2+ binding sites are located) and V0 (which contains the bafilomycin A1 bindind site), resulting in higher exposition of the inhibitor binding site and also higher affinity for Mg2+ and ATP. As the affinity increases are observed after just 1h exposure, this regulatory mechanism seems to be independent of protein expression and, thus, should not be related to the expression of distinct isoforms of some enzyme subunit. The lowering of gill V-ATPase activity in D. pagei in response to exposure to an elevated salinity is consistent with the mechanisms proposed for the role of this enzyme in active Na+ capture in hololimnetic crustaceans. After 10 days at 21, the gill microsomal fractions still show a little V-ATPase activity, possibly related to acid-base regulation and ammonia excretion processes. The results obtained for the acclimation of D. pagei for 10 days at salinities in the range 5 to 21? also showed a substantial decrease of V-ATPase activity in response to the increase in medium salinity. However, except for 5?, it was not observed an increase of enzyme\'s affinity for bafilomycin, suggesting that this alteration is limited to shorter periods of exposure. However, a significant increase in the enzyme\'s affinity for ATP and Mg2+ was also observed.