Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5905.pdf: 1907881 bytes, checksum: 316c0379a3333dccd30de1cd2334cae6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-21 / Universidade Federal de Sao Carlos / Recent research and advances in analytical chemistry show that the total content determination of an element, although it is essential, is limited since it is not sufficient to provide information about the bioavailability and toxicity of the species. Furthermore, plants are usually the main route of chemical elements (essential or toxic) entry in the food chain. Arsenic speciation in plants is important since it can be found in inorganic forms, more toxic, or methylated forms, less toxic. Moreover, both As and Cd can bind to phytochelatins (tri peptides) that are formed in plant tissue as a defense mechanism to the stress caused by potentially toxic elements. This research project aimed the determination and speciation of As and Cd in Brachiaria brizantha cv. Marandu forage grown in previously contaminated soil. In the first part of the work, these contaminants were added to the soil and after a certain period of time the forages were harvested, frozen-dried and ground in freezer mill containing liquid N2. As well as it was determined the total content of As and Cd by ICP-QMS. The mean concentrations found were 2.3 ± 0.27 mg kg-1 of As and 2.9 ± 0.07 mg kg-1 of Cd. In the second part of the work, the separation and identification of As(III), As(V), MMA (monomethylarsonic acid), and DMA (dimethylarsinic acid) species were performed using an anion exchange column and HPLC-ICPMS. Different sample preparation involving water, diluted nitric acid solution and a water methanol mixtures were evaluated in order to extract As species in plant samples. The interference standard (IFS) method using 83Kr+, was employed to minimize spectral interferences on 75As+ determination caused by polyatomic species such as 40Ar35Cl+. The procedure that presented the best xiv performance was the one using nitric acid solution with extractions carried out at 90 ºC, an efficiency of 90 % and quantitative extraction of all four As species were achieved. Improvement in accuracy from 77 % to 94 % was obtained using the IFS method. The third part of the work evaluated the As species stability in samples stored under different temperatures along 12 months, with periodical determination of them (each two months). It can be concluded that for As species evaluated, lyophilization and frozen-dried were the best sample preparation strategies. Sample storage at low temperatures resulted in poor extraction efficiency, furthermore, the sample particle size was the critical factor for choosing the best processing and storage procedure of sample. The fourth part addressed the evaluation of As-phytochelatin and Cd-phytochelatins species using HPLC-ICP-MS for the isotopes determination and HPLC-ESI-MS in order to do the phytochelatins analysis. Phytochelatins were not found in the samples stored for long periods, even at low temperatures, which demonstrates the species instability. Freshly-harvested and extracted samples were analyzed by ESI-MS and mainly glutathione (m/z 308); the phytochelatins PC2 (m/z 540) and PC3 (m/z 772), their respective oxidized forms and the compound As-PC3 (m/z 844) were found among roots, leaves and stems. The new legal requirements and trade restrictions require the development of analytical procedures to measure metalloid species in a variety of animal and plant tissues. With the combination of techniques such as ICP-MS and ESI-MS coupled to HPLC has become feasible the determination of uncommon species. / As recentes pesquisas e progressos em química analítica evidenciam que a determinação do teor total de um elemento, embora essencial, é limitada uma vez que não é suficiente para fornecer informações a respeito de biodisponibilidade e toxicidade das espécies. Geralmente, as plantas são a principal via de entrada de elementos químicos (essenciais ou tóxicos) na cadeia alimentar. A especiação de arsênio em plantas é importante uma vez que o mesmo pode ser encontrado nas formas inorgânicas, mais tóxicas ou formas metiladas, menos tóxicas. Além disso, tanto o As como o Cd podem se ligar a fitoquelatinas (tri peptídeos) que são formados no tecido vegetal como um mecanismo de defesa ao estresse causado por elementos potencialmente tóxicos. Este projeto de pesquisa visou a determinação e a especiação dos elementos As e Cd em forrageira do gênero Brachiaria brizantha cv. Marandu cultivada em solo previamente contaminado com esses elementos. Na primeira parte do trabalho os contaminantes foram adicionados ao solo e após determinado período as forragens foram cortadas, liofilizadas e moídas em moinho criogênico, bem como determinados os teores totais de As e Cd por ICP-QMS, sendo obtidos 2,3 ± 0,27 mg kg-1 de As e 2,9 ± 0,07 mg kg-1 de Cd. Na segunda parte do trabalho, a separação e a identificação das espécies As(III), As(V), MMA (ácido monometilarsênico) e DMA (ácido dimetilarsônico) foram realizadas utilizando coluna de troca aniônica e o acoplamento HPLC-ICP-MS. Diferentes preparos de amostra envolvendo os extratores água, metanol e ácido nítrico diluído foram avaliados para a especiação de As. O método do padrão de interferência (IFS), utilizando 83Kr+, foi empregado para corrigir interferências xii espectrais sobre 75As+ causadas por espécies poliatômicas, como 40Ar35Cl+. O procedimento de extração que utilizou solução de ácido nítrico diluído a 90 ºC foi o mais eficiente, com recuperação quantitativa (~90 %) das quatro espécies de As avaliadas. Melhoria na exatidão de 77 % para 94 % foi obtida utilizando o método IFS. A terceira parte do trabalho envolveu o estudo da estabilidade de espécies de As ao longo de 12 meses em amostras armazenadas sob diferentes condições e temperaturas, com determinações realizadas bimestralmente. Para as espécies de arsênio avaliadas, a liofilização seguida por moagem criogênica foi o procedimento de preparo que forneceu os melhores resultados. Baixas temperaturas isoladamente não se mostraram adequadas para o armazenamento das amostras, pois resultaram em recuperações pouco eficientes, sendo o tamanho de partícula da amostra determinante na escolha do melhor procedimento de armazenamento. A quarta parte do trabalho abordou a avaliação de espécies de As-fitoquelatinas e Cd-fitoquelatinas empregando HPLC-ICP-MS na determinação dos isótopos e HPLC-ESI-MS na determinação das fitoquelatinas. Não foram encontradas fitoquelatinas nas amostras armazenadas por longo período, mesmo que em baixas temperaturas, o que evidencia a instabilidade das espécies. Amostras recém-cortadas e extraídas foram analisadas por ESI-MS, sendo encontradas entre raízes, folhas e caule, principalmente glutationa (m/z 308); as fitoquelatinas PC2 (m/z 540) e PC3(m/z 772), as respectivas formas oxidadas dessas e o composto As-PC3 (m/z 844). As novas exigências legais e restrições ao comércio exigem o desenvolvimento de procedimentos analíticos para medir espécies metalóides em grande variedade de tecidos animais e vegetais. Com o uso complementar de técnicas como ICPMS e ESI-MS acopladas à HPLC tem se tornado viável a determinação de espécies pouco exploradas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1998.pdf: 730604 bytes, checksum: c9a3af679c55c32e121ac6f6d44b9de1 (MD5) Previous issue date: 2008-08-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / In this work, Thermospray Flame Furnace Atomic Absorption Spectrometry (TS-FF-AAS) and Flame Atomic Absorption Spectrometry (FAAS) were employed in order to propose methods for determination of total and bioavailability concentration of Cd and Pb in environmental samples. The sediments were collected in the basin of the Jundiaí river and the sewage sludge (industrial and home) in the Jundiaí sewage treatment station. The metals bioavailability contents were determined by extraction using 1.0 g of sample and 25.0 mL HCl 0.1 mol/L for 2 hours in horizontal stirrer 600 rpm. The total concentrations were determined using pre-digestion step for 12h followed by a microwave digestion of 0.1 g sample with 2.0 mL mixture concentrated HNO3 HCl (1:3 v/v) and 1.0 mL of H2O2 using heating program for 34 minutes. In determinations by TS-FF-AAS, 200 μL of sample was carried out into a nickel atomization tube with a flow rate of 0.5 mL/min. During Cd and Pb determinations in extracts HNO3 0.014 mol/L solution was used as carrier. In the case of the digested samples, EDTA 0.5% (m/v) and Triton X-100 0.1% (v/v) solution was used as carrier. The method accuracy was checked by Cd and Pb determination in in three certified samples: NIST 2782 and NIST 146R (industrials sludge) and NIST 8704 (Buffalo river sediment). The bioavailability and total concentrations range in sediments were 0.08-1.7 and 0.44- 2.47 mg/kg for Cd; 2.91- 13.6 and 8.9-24.7 mg/kg for Pb, respectively. Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) for TS-FF-AAS were 1.13 and 3.75 μg/L for Cd, 16.5 and 55.1 μg/L for Pb, respectively (n=3). In FAAS, limits of detection and quantification were 63.0 and 210 μg/L for Cd, 119 and 395 μg/L for Pb, respectively (n=3). The repeatability and reproducibility obtained were 1.0-8.0% and 7.0-24% for Cd, 2.4- 14% and 5.4-32% for Pb, presented as relative standard deviation (RSD, %). / Neste trabalho, empregaram-se a Espectrometria de Absorção Atômica com Forno Tubular na Chama e Aerossol Térmico (TS-FF-AAS) e a Espectrometria de Absorção Atômica com Chama (FAAS), na proposição de metodologias para a determinação de concentrações biodisponíveis e totais de Cd e Pb, em amostras de interesse ambiental. Os sedimentos foram coletados na bacia do Rio Jundiaí e o lodo de esgoto (industrial e doméstico) na Companhia Saneamento Jundiaí (CSJ). Os conteúdos biodisponíveis dos metais foram determinados por extração de 1,0 g de amostra com 25,0 mL de HCl 0,1 mol/L, por 2 horas, em um agitador horizontal a 600 rpm. As concentrações totais (0,1 g de amostra) foram determinadas com o emprego de uma etapa de pré-digestão por 12h, e digestão em forno de microondas fechado, com 2,0 mL de água régia e 1,0 mL de H2O2, utilizando um programa de aquecimento de 34 minutos. Nas determinações por TS-FF-AAS, introduziu-se um volume de amostra de 200 μL no interior de um tubo atomizador de Ni, com uma vazão de 0,5 mL/min. Na quantificação de Cd e Pb nos extratos, utilizou-se solução de HNO3 0,014 mol/L como carregador, e nos digeridos, solução de EDTA 0,5% (m/v) e Triton X-100 0,1% (v/v). Com o intuito de avaliar a exatidão das metodologias aplicadas, foram analisadas 3 amostras certificadas: NIST 2782 e NIST 146R (lodos industriais) e NIST 8704 (sedimento do Rio Buffalo). As faixas de concentrações biodisponíveis e totais, em sedimentos foram de 0,08-1,7 e 0,44- 2,47 mg/kg para Cd, 2,91-13,6 e 8,9-24,7 mg/kg para Pb, respectivamente. Os limites de detecção e quantificação para TS-FF-AAS foram 1,13 e 3,75 μg/L para Cd, 16,5 e 55,1 μg/L para Pb, respectivamente (n=3). No caso da FAAS, os limites de detecção e quantificação foram 63,0 e 210 μg/L para Cd, 119 e 395 μg/L para Pb, respectivamente (n=3). As repetibilidades e reprodutibilidades ficaram entre 1,0-8,0% e 7,0-24% para Cd, 2,4- 14% e 5,4-32% para Pb, representadas como desvio padrão relativo (RSD).

Considerando o potencial biotecnológico do fungo Trichoderma harzianum no processo de metabolização de compostos xenobióticos e sua resistência a metais pesados, o presente trabalho teve como finalidade estabelecer conhecimentos bioquímicos e ultraestruturais associados ao processo de remoção de cádmio. O microrganismo foi cultivado em meio contendo diferentes concentrações de cádmio: 1mM, 2mM e 3mM. O perfil de crescimento foi estabelecido em função da biomassa produzida, do consumo de glicose e fosfato, conteúdo intracelular de polifosfato, atividade das enzimas fosfatases ácida e alcalina, perfil de proteínas totais e remoção do metal. Os resultados obtidos sugerem efeitos do metal sobre o crescimento do organismo em diferentes meios de cultura. O crescimento em meio padrão revela a tolerância do organismo frente a altas concentrações de cádmio, e que tal cultivo induz variações no consumo de glicose e atividade das fosfatases. A utilização da microscopia óptica revelou variação na morfologia do organismo como resposta a variação do meio de cultivo e da presença e ausência do metal. Modificações relativas a processo de ramificação, textura e espessura das hifas foram visualizadas. Os aspectos ultraestruturais através de varredura demonstraram que T. harzianum cultivado na presença de cádmio apresentou variações associadas a eletrondensidade, densidade micelial, maior ramificação e menor número de clamidósporos. A análise do perfil de proteínas totais revelou que o cultivo em cádmio induziu a diminuição do conteúdo de proteínas dependendo da concentração. O isolado foi capaz de acumular polifosfato, e a presença do metal induziu a degradação do polímero em função da concentração. A remoção de cádmio do meio foi avaliada, revelando variação em função da concentração. Os resultados demonstram o efeito do cádmio sobre T. harzianum, pela primeira vez, e demonstram o potencial do microrganismo em acumular polifosfato e sua possível aplicação na remediação de metais pesados / Considering the biotechnological potential of Trichoderma harzianum in the xenobiotic metabolization and its resistance to heavy metals, the aim of this work was to evaluate the utrastructural and biochemical behavior related to cadmium tolerance and removal. The microorganism was grown in different media, containing 1mM, 2mM and 3mM of cadmium. Aspects of the growth profile was obtained by biomass production, glucose consumption, acid and alkaline phosphatase activities, morphology by optical microscopy, ultrastructure by scanning electron microscopy, total protein profile, polyphosphate acumulation and metal removal were evaluated. The results obtained revealed the inhibitory effects of the heavy metal on the microbial growth and the aspects of the tolerance to cadmium. The glucose consumption and the enzymes activities were also affected by cadmium and its different concentrations. The morphological analysis revealed variations related to hyphae thickness, branching pattern, texture and homogenity, electrondensity, and presence of granular structures. The ultrastructural aspects revealed alterations related to cell electrondensity, mycelia density, branching pattern and reduced chlamidospores number. The grown in presence of the metal induced a reduction in the total protein content related to cadmium concentration. The isolate was able to accumulate polyphosphate, and its grown in cadmium induced the polymer degradation. The cadmium removal was observed and revealed variations related to metal concentrations. The results for the first time revealed the effects of cadmium on T. harzianum polyphosphate accumulation and its potential application in the metal remediation

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O aumento da poluição/degradação ambiental tem sido observado com uma crescente preocupação pelas comunidades globais, considerando como sua principal resultante os problemas de saúde e perdas significativas dos sistemas naturais. Dentre os contaminantes, os metais pesados vêm obtendo destaque por sua toxicidade e acumulação nas cadeias tróficas. Dentre os métodos de remoção/minimização de metais, a biorremediação vem ganhando espaço como alternativa viável para o tratamento de ambientes poluídos. O cádmio é um metal de altíssima toxicidade, e induz alterações celulares, que atingem a morfologia, bem como a atividade de polímeros e sistemas enzimáticos dos sistemas vivos. Contudo, alguns sistemas exibem tolerância á presença do cádmio e o estudo dessas modificações poderá fornecer dados importantes para contribuir com a biorremediação de metais pesados. Dessa formal, a presente proposta visa avaliar o comportamento de enzimas oxidativas, bem como proteínas totais, polifosfatos e estrutura celular e sorção do íon metálico em Aspergillus nidulans como resposta ao crescimento em presença de 1mM, 2mM e 3mM de cádmio. Os resultados servirão como elemento de base para o entendimento dos mecanismos metabólicos associados á sobrevivência e manutenção e viabilidade celular, que podem ser aplicados em protocolos de biorremediação de ambientes contaminados com metais pesados. Com isso, a fim de uma melhor compreensão do potencial tóxico de um componente ambiental e seus efeitos sobre a biota local, é necessária um visão ampla que envolva conhecimentos relacionados à genética, proteômica, metabolismo celular e de níveis de organização biológica mais elevada, a fim de tornar este tipo de estudo com biomarcadores uma ferramenta fundamental para o manejo e conservação do meio ambiente. / Increased pollution / environmental degradation has been observed with a growing concern for global communities , considering its main resulting health problems and significant losses of natural systems . Among the contaminants , heavy metals have been gaining prominence for its toxicity and accumulation in food chains . Among the methods of removing / minimizing metals , bioremediation is gaining momentum as a viable alternative for the treatment of polluted environments . Cadmium is a metal of high toxicity , and induces cellular changes that affect the morphology and activity of polymers and enzyme systems of living systems . However , some systems exhibit tolerance to the presence of cadmium and the study of these changes may provide important data to contribute to the bioremediation of heavy metals . This formal, this proposal aims to evaluate the behavior of oxidative enzymes and total proteins , polyphosphates and cellular structure and sorption of metal ion in Aspergillus nidulans in response to growth in the presence of 1 mM , 2 mM and 3 mM cadmium. The results will serve as input for understanding the metabolic mechanisms associated with survival and maintenance and cell viability , which can be applied in bioremediation of heavy metal contaminated environments protocols . Thus , in order to better understand the potential toxicity of an environmental component and its effects on local biota , one broad view is needed that involves knowledge related to genetics, proteomics , cellular metabolism and higher levels of biological organization, order to make this type of study biomarkers with an essential tool for the management and conservation of the environment .

A poluição ambiental causada por resíduos de metais tóxicos é muito relevante pelo seu amplo uso em processos industriais e agrícolas, sendo que muitos efluentes chegam ao ambiente aquático sem qualquer tratamento. A contaminação da água com estes poluentes tornaram-se iminentes e, consequentemente efeitos adversos são inevitáveis em humanos, plantas e animais, onde um dos táxons mais atingidos são os peixes. O peixe zebra (Danio rerio) é uma espécie muito utilizada como modelo experimental em diversas áreas, como neurociências e toxicologia. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos da adenina exercem efeitos sinalizadores no espaço extracelular por meio da ativação de receptores específicos. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases, na qual se destacam as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5'-nucleotidase. Após hidrólise pelas ectonucleotidases, o ATP produz o nucleosídeo adenosina. A adenosina pode ser desaminada pela enzima adenosina desaminase (ADA), gerando inosina. Evidências demonstram que o ATP é coliberado com a acetilcolina em terminais colinérgicos. A acetilcolina é uma molécula transmissora que age nos receptores muscarínicos e nicotínicos e seu catabolismo é promovido pela enzima acetilcolinesterase (AChE). Nosso laboratório já demonstrou a presença de diferentes membros da família das NTPDases e da família da ADA, além de uma ecto-5'-nucleotidase em cérebro de peixe zebra. A presença da enzima AChE também já foi descrita nesta espécie. No capítulo I foi testado o efeito in vitro do zinco e cádmio na atividade da AChE e das ectonucleotidases em cérebro de peixe zebra. Ambos os metais não alteraram a atividade da AChE. A hidrólise de ATP teve um aumento na presença de 1 µM de zinco (17 %) e a hidrólise de AMP teve um aumento dose dependente nas concentrações 0,5 e 1 µM de zinco (188 % e 199 %). Após a exposição a 0,5 e 1 µM de cádmio, a atividade ATPásica foi aumentada significativamente (53 % e 48 %). O cádmio na faixa de 0,25 a 1 µM inibiu a hidrólise de ADP de forma dose-dependente (13,4 - 69 %). A atividade da ecto-5'-nucleotidase foi inibida (38 %) apenas na presença de 1 µM de cádmio. No capítulo II foi investigado o efeito da exposição ao alumínio na atividade da AChE cerebral e em parâmetros comportamentais em peixe zebra. A exposição in vivo a 50 µg/L de AlCl3 durante 96 h a pH 5,8 aumentou significativamente (36 %) a hidrólise de acetiltiocolina em cérebro de peixe zebra. Não foram observadas mudanças na atividade da AChE quando os peixes foram expostos a mesma concentração de AlCl3 em pH 6,8. RT-PCR semi-quantitativo não demonstrou alterações significativas nos níveis de expressão do RNAm do gene da ache em cérebro de peixe zebra. Concentrações in vitro de AlCl3 variando de 50 a 250 µM aumentaram a atividade da AChE (28 a 33 %). Além disso, animais expostos ao AlCl3 em pH 5,8 apresentaram uma diminuição na atividade locomotora, avaliada pelo número de cruzamentos (25 %), distância viajada (14,1 %) e velocidade máxima (24 %). No capítulo III, foi verificado o efeito de metais tóxicos na atividade e expressão da ADA em frações solúveis e de membrana em cérebro de peixe zebra. Dos metais testados, apenas o mercúrio foi capaz de inibir a desaminação da adenosina em ambas as frações in vitro. A inibição foi observada de 5 a 250 µM de HgCl2 (84,6 - 92,6 %) na fração solúvel enquanto nas frações de membrana a inibição variou de 50 a 250 µM (20,9 - 26 %). A exposição in vivo do peixe zebra a 20 µg/L de HgCl2 foi avaliada após exposição aguda (24 h) e subcrônica (96 h). A atividade da ADA na fração solúvel foi inibida após a exposição aguda (24,5%) e subcrônica (40,8%) enquanto que a atividade da ADA na fração de membrana foi inibida somente após a exposição subcrônica (21,9 %). Em contraste, não foram observadas mudanças na expressão dos genes da ADA após os tratamentos. Nossos resultados apresentados demonstraram que as enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (NTPDase, 5'-nucleotidase e ADA) e a acetilcolinesterase são afetadas por metais tóxicos em cérebro de peixe zebra. Além de serem possíveis alvos da neurotoxicidade dos metais, a alteração destas atividades enzimáticas pode ser utilizada como bioindicador da presença ambiental destes poluentes. / The environmental pollution caused by toxic metals is relevant due to its widespread use in industrial and agricultural process, and many effluents enter in the aquatic environment without treatment. The contamination of water by toxic metals has become imminent and, consequently, adverse effects are inevitable in humans, plants, and animals, which fish are one of the most affected taxons. Zebrafish (Danio rerio) is a specie consolidated as a model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. Evidence has show that nucleotides and nucleosides exert signaling effects at the extracellular space by the activation of specific receptors. The inactivation of extracellular ATP signaling is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, whivh inlude NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5'-nucleotidase. After hydrolysis promoted by ectonucleotidases, ATP forms the nucleoside adenosine. The adenosine could be deaminated by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Evidence demonstrates that ATP is coreleased with acetylcholine in cholinergic terminals. Acetylcholine is a transmitter molecule that acts on muscarinic and nicotinic receptors and its catabolism is promoted by acetylcholinesterase (AChE) activity. Our laboratory has already characterized NTPDases, ecto-5'-nucleotidase and ADA activity in zebrafish brain. The AChE activity has been reported in this specie. In chapter I we tested the in vitro effect of zinc and cadmium on AChE and ectonucleotidase (NTPDase and ecto-5-nucleotidase) activities in zebrafish brain. Both zinc and cadmium treatments did not alter significantly the zebrafish brain AChE activity. ATP hydrolysis presented a significant increase at 1 mM zinc (17 %) and the AMPase activity had a dose-dependent increase at 0.5 and 1µM zinc exposure (188 % and 199 %). After cadmium treatment, ATPase activity was significantly increased (53 % and 48 %) at 0.5 and 1 µM, respectively. Cadmium, in the range 0.25-1 µM, inhibited ADP hydrolysis in a dose-dependent manner (13.4-69 %). Ecto-5-nucleotidase activity was only inhibited (38 %) in the presence of 1 µM cadmium. In chapter II we have investigated the effect of aluminum exposure on brain AChE activity and behavior parameters in zebrafish. In vivo exposure of zebrafish to 50 µg/L AlCl3 during 96 h at pH 5.8 significantly increased (36 %) acetylthiocholine hydrolysis in zebrafish brain. There were no changes on AChE activity when fish were exposed to the same concentration of AlCl3 at pH 6.8. Semi-quantitative RT-PCR has not shown significant alterations on the expression levels of ache mRNA gene in zebrafish brain. In vitro concentrations of AlCl3 varying from 50 to 250 µM have increased AChE activity (28 to 33 %, respectively) Moreover, we observed that animals exposed to AlCl3 at pH 5.8 presented a significant decrease in locomotor activity, as evaluated by the number of line crossings (25 %), distance traveled (14.1 %) and maximum speed (24 %). In chapter III we have investigated the effects of toxic metals on soluble and membrane ADA activity and gene expression in zebrafish brain. Regarding the metals tested, only HgCl2 was able to inhibit the adenosine deamination in vitro in both fractions. The inhibition was observed from 5 to 250 µM HgCl2 (84.6 - 92.6 %) in soluble fraction while in membrane fractions the inhibition varied from 50 to 250 µM (20.9 - 26 %). The in vivo exposure of zebrafish to 20 µg/L of HgCl2 was evaluated after acute (24 h) and subchronic (96 h) treatments on ADA activity in soluble and membrane fractions. The ADA activity from soluble fraction was inhibited after both acute (24.5 %) and subchronic (40.8 %) exposures whereas the ADA activity from brain membranes was inhibited only after subchronic exposure (21.9 %). In contrast, semi-quantitative RT-PCR analysis showed that HgCl2 was not able to modulate the ADA gene expression. Our results have show that the enzymes involved in the degradation of nucleotides and nucleosides (NTPDase, 5'-nucleotidase and ADA) and AChE are modulated by toxic metals in zebrafish brain. Besides been a possible target in the neurotoxicity mediated by metals, the alteration of these enzyme activities can be used as bioindicator of the environmental presence of these pollutants.

É bem conhecido que muitos efeitos tóxicos do cádmio (Cd) resultem da ação da interação com metais essenciais, incluindo zinco (Zn). Sendo um poluente ambiental, a exposição à Cd conduz a distúrbios no conteúdo e atividade de Zn no organismo, representando importante via para o desenvolvimento de sua toxicidade. Evidências suportam que Zn pode reduzir os efeitos do Cd, prevendo ou reduzindo a ação tóxica deste metal, enquanto que a deficiência de Zn pode intensificar a toxicidade de Cd. Com base nisto, este trabalho buscou investigar (1) o efeito da interação Zn-Cd sobre o tecido hepático de ratos adultos, por representar um importante alvo biológico à ação dos metais e (2) se estes efeitos são estendidos ao SNC mesmo protegido pela barreira hemato-encefálica. Através da avaliação de parâmetros bioquímicos, como [delta]-aminolevulinato-desidratase e metalotioneína, os resultados encontrados suportam a sobreposição do efeito tóxico de Cd sobre as funções essenciais de Zn, entretanto existe diferença entre os tecidos quanto ao mecanismo protetivo exercido sobre a toxicidade de Cd. Além disso, obtemos dados sobre os níveis de MT que contrapõem suas funções benéficas previamente descritas. Em resumo, essa dissertação reforça a ação tóxica de Cd por vias biológicas comuns ao Zn e expõe diferenças entre o tecido hepático e o SNC quanto ao mecanismo interativo. / It is well known that many toxic effects of cadmium (Cd) results from the action of the interaction with essential metals, for example zinc (Zn). Cd is an environmental pollutant, which exposure leads to disturbance in the content and atividade of Zn in the body. Evidences indicate that Zn can reduce the effects of Cd for provide or reduce the toxic action of this metal, whereas Zn deficiency can intensify the toxicity of Cd. On account of this, our study aimed investigate (1) the effect of Zn-Cd interaction on the liver tissue of adult rats, which represents important biological target for action of the metals and (2) if these effects are extended to the CNS even protected by the blood-brain barrier. Through the evaluation of biochemical parameters, as [delta]-aminolevulinate-dehydratase ([delta]-ALA-D) and metallothionein (MT), the results support the overlap of the toxic effect of Cd on the essential functions of Zn; however there is difference between the tissues on the protective mechanism exerted on the toxicity of Cd. Furthermore, we obtain data on the levels of MT that contrast to their beneficial functions previously described. In summary, this work reinforces the toxic effect of Cd by biological pathways common to the Zn and explains differences between the liver tissue and CNS in relation to the interactive mechanism.

Na atualidade pesquisam-se métodos que possam avaliar apropriadamente o risco potencial ao ambiente e ao homem de elementostraço contidos em fertilizantes que são adicionados ao solo. Cádmio, níquel e chumbo são tóxicos aos vegetais, aos animais e ao homem. Seus teores naturais no solo não oferecem risco, porém são aumentados no ambiente devido a adições antropogênicas de agrotóxicos, de lodos de estações de tratamentos, de fertilizantes, entre outros. Os objetivos deste trabalho foram: a) avaliar os teores de Cd, Ni e Pb em fertilizantes fosfatados e em áreas aonde houve aplicação de altas doses deste insumo; b) avaliar, mediante extrações seqüenciais em quais frações do solo o Cd, o Ni e o Pb estão associadas e c) avaliar a capacidade de adsorção do cádmio, chumbo e níquel em dez amostras de solos. Os teores de Cd e Pb das amostras de fertilizantes fosfatados avaliadas com extração pelo método USEPA 3051A e por ácido cítrico 20 g L-¹ foram inferiores aos limites considerados como seguros pela legislação brasileira, assim como os encontrados em áreas que receberam altas taxas de aplicação de fertilizantes. Os atributos químicos e mineralógicos das amostras de solos afetaram a distribuição dos elementos-traço nas frações extraídas seqüencialmente. Os solos apresentaram capacidades diferenciadas em adsorver Cd, Ni e Pb e houve competição entre eles pelos sítios de adsorção do complexo sortivo do solo, sendo o cádmio o metal mais afetado. / Current studies are searching for methods that can properly evaluate the potential risk to the environment and humans from trace-elements contained in fertilizers that are added to soil. Cadmium, nickel, and lead are toxic to plants, animals, and humans. Their natural levels in soils do not offer risk, but are increased in the environment due to anthropogenic additions of pesticides, of mud from treatment plants, sewage sludge, and fertilizer, among others. The objectives of this study were: a) to evaluate Cd, Ni and Pb concentrations in phosphate fertilizers and in soils where there were applied in high doses, b) to evaluate by sequential extractions in which fractions of soil Cd, Ni and the Pb were associated c) to evaluate the capacity for adsorption of cadmium, lead and nickel in ten soil samples. The levels of Cd and Pb samples of phosphate fertilizers evaluated with USEPA 3051A method and citric acid 20 g L-¹ were below the limits deemed safe by the Brazilian legislation, as well as those found in areas that received heavy fertilization. The mineralogical and chemical attributes of soil samples affected the distribution of trace elements in the fractions extracted sequentially. The soils had different capacities to adsorb Cd, Ni and Pb and there was a competition between them for the sites of adsorption of the soil sortive complex and cadmium was the metal most affected.

The main objective of this study was to use alternative systems for the analysis of solids by graphite furnace atomic absorption spectrometry (DSS-GF AAS) and with flame (SS-F AAS) for cadmium, copper and lead in determination of medicinal plants samples. For DSS-GF AAS procedure the solid sample was introduced, directly, into the atomizer. For cadmium and lead determinations Pd was used as chemical modifier and a deuterium background corrector system was employed. For copper determination it was used a Zeeman effect background correction system. The calibration was performed against aqueous standards and certified reference materials. Sample masses up to 0.9 mg were applied for DSS-GF AAS, procedure a limits of quantification of 0.11 and 0.3 μg g-1 and characteristic masses of 1 and 70 pg were obtained for cadmium and copper, respectively. Lead determination by DSS-GF AAS was not possible, due to the different sensitivities between the samples. For cadmium, copper and lead the determination by SS-F AAS the samples were mixed with graphite and pressed in the pastille form. The pastilles were introduced in a system that consists basically into a quartz cell adapted above the air-acetylene flame. Oxygen was introduced in the quartz cell to improve the pastille (sample and graphite mixture) combustion. All the elements were determinate using a deuterium background correction system. Calibration was performed against aqueous standards and certified reference materials. With this system it was possible to use sample masses up to 50 mg, limits of quantification of 0.03, 0.52 and 0.34 μg g-1 and characteristic masses of 0.05, 0.9 and 1 ng were obtained for cadmium, copper and lead, respectively. It can be concluded that both used systems presents advantages, as high sample throve put for SS-F AAS and ´better detection limits for DSS-GF AAS. However, the detection limit obtained for the SS-F AAS system it is enough for the quality control of the metals studied in medicinal plants. For DSS-GF AAS procedure the main disadvantage is the relatively high instrumental cost, however, better detection limits were obtained in relation to the system by SS-F AAS. However, both systems were adequate for cadmium, copper and lead determinations in medicinal plants samples / Este estudo teve como objetivo principal a utilização de sistemas para a análise direta de amostras sólidas por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (DSS-GF AAS) e com chama (SS-F AAS) para a determinação de cádmio, cobre e chumbo em amostras de plantas medicinais. Para o procedimento empregando DSS-GF AAS a amostra sólida em pó foi introduzida, diretamente, no sistema de atomização. Para a determinação de cádmio e chumbo, foi empregado Pd como modificador químico e foi utilizado o corretor de fundo com lâmpada de deutério. Para cobre foi empregado um corretor baseado no efeito Zeeman. Para a obtenção das curvas analíticas foram utilizadas soluções de referência e materiais de referência certificados. Para o sistema DSS-GF AAS foram utilizadas massas de amostra de até 0,9 mg, resultando em um limite de quantificação de 0,11 e 0,3 μg g-1 e massas características de 1 e 70 pg de cádmio e cobre, respectivamente. Não foi possível a determinação de chumbo por DSS-GF AAS, devido à dificuldades de calibração. Para a determinação de cádmio, cobre e chumbo, por SS-F AAS, as amostras foram misturadas com grafite, prensadas na forma de pastilhas e, após, introduzidas em um sistema especial para a introdução de sólidos no atomizador (chama ar+acetileno). Oxigênio foi introduzido na cela de quartzo para auxiliar a combustão da pastilha (mistura de amostra e grafite). Para todos os elementos foi empregado o corretor de fundo com lâmpada de deutério. Para a obtenção da curva analítica foram utilizadas soluções de referência e materiais de referência certificados. Para este sistema foi possível a utilização de até 50 mg de amostra, resultando em um limite de quantificação de 0,03, 0,52 e 0,34 μg g-1 e massas características de 0,05, 0,9 e 1 ng para cádmio, cobre e chumbo, respectivamente. Pode-se concluir que os dois sistemas utilizados apresentam vantagens, como a boa freqüência analítica para determinação por SS-F AAS e menor limite de detecção para DSS-GF AAS. Entretanto, o limite de detecção do sistema por SS-F AAS é suficiente para o controle de qualidade dos metais estudados em plantas medicinais. O sistema DSS-GF AAS, apesar dos melhores limites de detecção em relação ao sistema SS-F AAS, apresentou como principal desvantagem o custo instrumental relativamente maior. Contudo, ambos os sistemas são adequados para a determinação por DSS-GF AAS (cádmio e cobre) e por SS-F AAS (cádmio, cobre e chumbo) em amostras de plantas medicinais

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cadmium (Cd) is one of the most toxic heavy metals by their ability to affect the vital organs like liver, kidney, brain and other. This metal can trigger a framework of oxidative stress by increase of reactive oxygen species and also affect cholinergic and purinergic neurotransmission. Quercetin (Querc), a flavonoid found in various foods has several functions in the body as a therapeutic antioxidant and neuroprotective action. The aim of this study was to evaluate the activity of ectoenzymes and acetylcholinesterase (AChE) activity in synaptosomes of the cerebral cortex of adult rats exposed to cadmium chloride at a dose of 2.5 mg/kg and treated with Querc at doses of 5, 25 and 50mg/kg, both solutions were orally administered in a volume of 1 mL/kg for 45 days. Results showed that the hydrolysis of ATP, ADP, AMP and ADA activity in the synaptosome cerebral cortex in the Cd/ethanol group increased compared to the saline/ethanol group (p<0.05). The treatment with all doses of Querc prevented the increase in the hydrolysis of ATP, ADP, and AMP as well as the ADA activity (p<0.05). In vitro assay with Querc 25 and 50 μM showed a decrease in the activities of these enzymes except of ADA (p<0.05). The AChE activity ex vivo was not significantly different in the Cd/ethanol group when compared to the saline/ethanol group. The treatment with Querc 25 and 50 mg/kg significantly decreased the AChE activity when compared to the Cd/ethanol group (p<0.05). In vitro assay showed a decrease in the AChE activity only with 100 and 200 μM of Querc (p<0.05). These results suggest that Querc prevented the alterations caused by Cd in purinergic and cholinergic system. Thus, the results reported here suggest that Querc is a promising compound that can be clinically investigated in order to be used in alternative therapies for the treatment of neurodegenerative diseases or brain diseases associated with poisoning by heavy metals. / O cádmio (Cd) é um dos metais pesados de maior toxicidade pela sua capacidade de afetar órgãos vitais como o fígado, os rins, o encéfalo entre outros. Este metal pode desencadear um quadro de estresse oxidativo pelo aumento de espécies reativas de oxigênio, e também afetar a neurotransmissão colinérgica e purinérgica. A quercetina (Querc), um flavonóide presente em vários alimentos exerce diversas funções terapêuticas no organismo como atividade antioxidante e ação neuroprotetora. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade de ectoenzimas e da acetilcolinesterase (AChE) em sinaptossomas do córtex cerebral de ratos adultos expostos ao cloreto de cádmio na dose de 2,5 mg/kg e tratados com Querc nas doses de 5, 25 e 50mg/kg, ambas por via oral e administradas no volume de 1 mL/kg por 45 dias. Os resultados demonstraram que a hidrólise de ATP, ADP, AMP e a atividade da ADA no sinaptossoma do córtex cerebral do grupo Cd/etanol aumentaram quando comparado com o grupo salina/etanol (p<0,05). O tratamento com todas as doses de Querc preveniu o aumento da hidrólise de ATP, ADP e AMP bem como a atividade da ADA (p<0,05). Ensaios in vitro com a Querc 25 e 50 μM demonstraram uma diminuição na atividade destas enzimas exceto na atividade da ADA (p<0,05). A atividade da AChE ex vivo não foi significativamente diferente no grupo Cd/etanol quando comparado com o grupo salina/etanol. O tratamento com Querc 25 e 50 mg/kg diminuiu significativamente a atividade da AChE quando comparado com o grupo Cd/etanol (p<0,05). Ensaios in vitro demonstraram uma diminuição na atividade da AChE somente com 100 e 200μM de Querc (p<0,05). Estes resultados sugerem que a Querc preveniu as alterações causadas pelo Cd no sistema purinérgico e colinérgico. Deste modo, os resultados descritos neste estudo sugerem que a Querc é um composto promissor que pode ser investigada clinicamente a fim de ser utilizado em terapias alternativas para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou doenças cerebrais associadas à intoxicação por metais pesados.

The black necked swan (Cygnus melanocoryphus) belongs to the Anseriforme order, Anatidae family, which includes swans, ducks and geese. This swan is endemic to South America and it is present in Brazil, Paraguay, Uruguay, Argentina and Chile. In Brazil this swan is found in the southern region, remaining throughout the year in Ecological Station Taim (ESEC TAIM). The objective of this study was to identify the concentrations of copper (Cu), cadmium (Cd) and lead (Pb) in feather samples is related to sex and age and determine the amount of micronuclei varies with the concentration of Cu, Cd and Pb and with age and sex. Were captured 18 individuals of black necked swan in the summer of 2012 and 39 individuals in the summer of 2013. Of these, 22 adult males, 19 adult females, nine chicks males, four chicks females and three chicks with indeterminate sex. Samples of blood and feathers were collected. The blood samples were used for sex molecular and preparation of cytologic slides for analysis of micronucleus. The feather samples were used to measure the presence of heavy metals Cu, Cd and Pb. Significant differences between ages were found for concentrations in feathers of Cu, Cd and Pb (p <0.05). There was no significant differences between sex for concentrations in feathers of Cu, Cd and Pb(p > 0.05). There was no relationship between the amount of micronuclei in the concentration of these metals feathers and with age and sex (p> 0.05). / O cisne de pescoço preto (Cygnus melanocoryphus) pertence à ordem Anseriforme, família Anatidae, da qual fazem parte cisnes, patos e gansos. É endêmico da América do Sul e está presente no Brasil, Paraguai, Uruguai, Argentina e Chile. No Brasil este cisne é encontrado na região sul, permanecendo durante o ano todo na Estação Ecológica do Taim (ESEC Taim). O objetivo do presente estudo foi identificar se as concentrações de cobre (Cu), cádmio (Cd) e chumbo (Pb) em amostras de penas tem relação com o sexo e a idade, determinar se a quantidade de micronúcleos varia com as concentrações de Cu, Cd e Pb e com a idade e sexo. Foram capturados 18 indivíduos de cisne de pescoço preto no verão de 2012 e 39 indivíduos no verão de 2013. Desses, 22 machos adultos, 19 fêmeas adultas, nove machos filhotes, quatro fêmeas filhotes e três filhotes com sexo indeterminado. Foram coletadas amostras de sangue e de penas. As amostras de sangue foram utilizadas para a sexagem molecular e confecção de lâminas citológicas para a análise de micronúcleos. As amostras de penas foram utilizadas para medir a presença dos metais pesados Cu, Cd e Pb. Foram encontradas diferenças significativas entre idades para as concentrações nas penas de Cu, Cd e Pb (p<0.05). Não houve diferenças significativas entre o sexo e as concentrações em penas de Cu, Cd, Pb (p>0.05). Não houve nenhuma relação entre a quantidade de micronúcleos com a concentração desses metais e com a idade e sexo (p>0.05).