A contaminação ambiental por metais pesados é um sério problema enfrentado atualmente pela humanidade, e tem causado grande preocupação, devido ao seu acúmulo em plantas cultivadas, podendo afetar a cadeia alimentar de homens e animais. O metal pesado Cádmio (Cd) é um dos contaminantes mais difundidos no ambiente, devido às diversas atividades humanas, e pode causar sérios danos ao metabolismo celular com a inibição de processos fisiológicos importantes. Este trabalho teve como objetivo estudar a resposta do sistema antioxidante de cafeeiros expostos às concentrações de 15, 45 e 90 mg de Cd/planta. De acordo com os resultados as plantas que receberam 90mg/planta de metal foram mais afetadas, apresentando altas taxas de peroxidação lipídica. As atividades das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa redutase (GR), foram reduzidas na presença do metal em todas as concentrações de Cd utilizadas. Os resultados sugerem que o sistema antioxidante dessas plantas responde conforme o tempo de exposição ao metal e de acordo com a concentração. / Environmental heavy metal contamination is a serious problem currently faced by humanity and has caused great concern due to its accumulation in cultivated plants, being able to affect human and animals food chain. The heavy metal Cadmium (Cd) is one of the most widespread contaminants in the environment due to a variety of human activities and may cause severe damage to the cellular metabolism through inhibition of important physiological processes. This project aimed to study the antioxidative system response of coffee trees exposed to concentrations of 15, 45 and 90 mg of Cd per plant. According with results obtained, plants which received the higher concentration of Cd were more affected, showing great rates of lipid peroxidation. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione reductase (GR), were reduced in the presence of the metal for each Cd concentration used. The results suggest that these enzymes respond according to time length of exposure and to the concentration of metal used.

A poluição por metais pesados, particularmente pelo cádmio, considerado um dos mais tóxicos é gerada principalmente pelas atividades de mineração e industriais, utilização de lodo de esgoto e fertilizantes fosfatados. Estes últimos contém o Cd em sua composição e sua utilização na agricultura tem aumentado a concentração desse metal no solo, reservas hídricas e plantas, o que pode aumentar a bioacumulação via cadeia alimentar. Identificou-se um grupo de peptídeos denominados fitoquelatinas (PCs), capazes de se ligar aos íons de metais pesados, incluindo o Cd e assim desintoxicando as células pela diminuição dos íons livres no citoplasma. Entretanto, danos oxidativos frequentemente ocorrem quando há exposição aos metais pesados, devido a intensificação na produção de espécies ativas de oxigênio. Também uma classe de enzimas antioxidantes tem sido relatada no combate às EAOs decorrentes do estresse oxidativo. Plantas expostas aos metais pesados apresentam alterações nas atividades dessas enzimas. Portanto, o estudo dessas alterações pode fornecer dados importantes relativos aos níveis de tolerância, especificidade da resposta em diferentes espécies e níveis de poluição no ambiente. Esses dados podem ser úteis em programas de melhoramento para obtenção de plantas mais tolerantes, além de estudos relacionados a bioacumulação e fitorremediação, uma vez que plantas tolerantes podem ajudar a diminuir a quantidade de metais nos solos contaminados. Neste trabalho, foi observado alterações nas atividades de CAT e peroxidases em células de BY-2 e um aumento expressivo na atividade de GR. A SOD apresentou alterações em isoformas específicas. Os resultados sugerem que o mecanismo principal de defesa ao estresse por Cd em células BY-2 foi variável durante o tempo de exposição ao metal. Possivelmente a síntese de GSH tanto como substrato para fitoquelatinas quanto para GST foi significativa durante a fase inicial de estresse, sendo que a atividade de CAT e peroxidases são importantes durante o período final, onde provavelmente o estresse tornou-se mais severo. / The contamination of environments by heavy metal pollution, mainly by cádmium (Cd), considered one of the more toxic, is generated by mining and industrial activities, and sewage sludge and phosphated fertilizers used in agriculture. The latter contains Cd in its composition and with continuous agricultural utilization an increase in the heavy metals levels in soils, plants and water sources, have been observed which may contribute to the bioaccumulation and biomagnification in the food chain. A group of peptides termed phytochelatins (PCs) has been identified and are capable of binding heavy metal ions, including Cd and detoxifying the cells by the reduction of free ions in the cytosol. However, oxidative damage often occurs due to the generation of oxygen reactive species induced by heavy metals. A class of antioxidant enzymes has been reported for the scavenging of the oxygen reactive species. Plants exposed to heavy metals may exhibit alteration in enzyme activity. The study of such a response may allow the evaluation levels of tolerance, specificity the response of distinct plant species to levels of pollution in the environment. These data may be useful in breeding programs to select tolerant plants. Moreover, tolerant plants may be used in phytorremediation, by reducing the amount of heavy metals in contaminated soils. In this study, it was observed alterations in CAT and peroxidases activities in BY-2 cells and an extensive increase in GR activity. SOD activity was altered in the isoforms analysed. The results suggest that in BY-2 cells the main defence system to Cd stress is variable during the heavy metal exposure time. The synthesis of GSH, which is used in the synthesis of phytochelatins and substrate for GST is evident during the onset of the stress with CAT and peroxidases taking over the antioxidative responses once the stress becomes severe.

A exposição das plantas a estresses bióticos e abióticos pode levar ao aumento dos níveis de espécies ativas de oxigênio (EAOs) nas células, gerando estresse oxidativo. Dentre os causadores de estresses abióticos mais estudados, estão a salinidade e o cádmio (Cd). A salinidade pode causar um desequilíbrio de íons nas células, resultando estresse osmótico. Já o Cd gera distúrbios nutricionais, estruturais e bioquímicos, levando ao aumento de EAOs. Para combater este excesso, as plantas desenvolveram um complexo sistema de defesa que inclui mecanismos enzimáticos e não enzimáticos de desintoxicação. Os hormônios vegetais, como o etileno, controlam importantes vias do metabolismo celular, fazendo com que as plantas respondam de diferentes maneiras às condições de estresse. Fatores de estresse distintos podem resultar em respostas diferenciadas por parte das células e dos diferentes tecidos das plantas. O presente trabalho utilizou o tomateiro cv. Micro-Tom e seu mutante hormonal para etileno Never ripe (Nr) cultivados em solução nutritiva e submetidos aos estresses por 100 mM de NaCl e 0,5 mM de CdCl2 em coletas distintas (sete, 20 e 36 dias). Neste trabalho, as respostas das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), ascorbato peroxidase (APX) e guaiacol peroxidase (GPOX) foram analisadas. Além disso, outros parâmetros importantes como quantificação de Cd e Na, peroxidação lipídica, peróxido de hidrogênio (H2O2), análise do perfil protéico por SDS-PAGE e teor de clorofila foram avaliados. De acordo com os resultados, o Cd acumulou-se mais nas raízes, e o Na foi absorvido pela plantas e transportado até as folhas e frutos. O estresse provocado pelo Cd foi mais prejudicial ao desenvolvimento do MT, aumentando os níveis de H2O2 e MDA, assim como a atividade das enzimas antioxidantes. Alterações nos perfis protéicos dos tecidos submetidos aos tratamentos com Cd e Na também foram observadas. A absorção de Na pelos frutos foi elevada, alterando a atividade das enzimas antioxidantes. A enzima que mais apresentou aumento de atividade foi a GR, tanto em folhas quanto em raízes, nos três períodos analisados, sugerindo que essa enzima pode estar associada à síntese de fitoquelatinas (PCs) nos tecidos. Isso mostra que as enzimas antioxidantes agem de maneira particular, conforme o período de estresse ao qual as plantas estão submetidas, de maneira que a resposta antioxidante é dinâmica e particular a cada tecido da planta. / Plant exposure to abiotic and biotic stresses can lead to enhanced production of Reactive Oxygen Species (ROS) in cells, causing oxidative stress. Cadmium (Cd) and salt (NaCl) are among the most studied abiotic stresses. Salinity can cause ion disturb in the cell, resulting in osmotic stress. In the case of Cd, it can induce nutritional, structural and biochemistry changes, leading to increased ROS levels. Plants have developed efficient antioxidant systems to act against ROS, including a series of enzymatic and non-enzymatic detoxification mechanisms. Plant hormones, such as ethylene, can control important pathways, which may result in different manners for the plant to respond to stressful conditions. Different stress factors can result in different responses depending of plant cells and tissues. This work used the miniature tomato Micro-Tom and its hormonal mutant to ethylene counterpart, Never ripe (Nr), which were maintained in nutritional solution and submitted to 100 mM of Na Cl and 0.5 mM of CdCl2 for 7, 20 and 36 days. Antioxidant enzymes responses mainly by changes in activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), gluthathione reductase (GR), ascorbate peroxidase (APX) and guaiacol peroxidase (GPOX) were analyzed. Moreover, others important evaluation parameters such as Cd and Na quantification, lipid peroxidation, level of H2O2, SDS-PAGE and chlorophyll amount, were assessed. According to the results, Cd accumulated in roots while Na was uptaked and translocated to the leaves and fruits. The stress caused by Cd was the most damaging to MT plant development, increasing H2O2 and lipid peroxidation, as well as antioxidant enzymes activities. Alterations in SDS-PAGE protein profiles were also observed. The uptake of Na in fruits was high, modifying antioxidant enzymes activities. GR was the enzyme that exhibited the highest increase in activity in leaves and roots during all periods analyzed, suggesting that this enzyme can be related to phytochelatin synthesis (PCs) in tissues and/or increased glutathione synthesis. The results confirmed that the enzymes may respond differently depending on the tissue, organ, time length of exposure and concentrations of the stressful agent.

A contaminação de ambientes aquáticos por metais pesados é uma ameaça cada vez mais presente em muitos ecossistemas, especialmente próximo a áreas industriais e urbanas. Utilizando a capacidade que os fungos têm de biosorver metais pesados alguns pesquisadores preocupados com esse problema, começaram a estudar técnicas de biorremediação usando microrganismos, dentre eles os fungos. Essa técnica consiste em remover íons tóxicos do ambiente com o auxílio de organismos vivos. Porém, esses íons promovem a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS), as quais estimulam a produção de enzimas responsáveis por sua desintoxicação, dentre elas as peroxidases, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), guaiacol peroxidase, e outras. Este trabalho teve como proposta estudar variações nas enzimas antioxidantes em resposta à administração do Cd em uma linhagem do fungo Aspergillus nidulans (MSE), por possuir marcadores em todos os cromossomos e ser considerada um modelo de estudos genéticos. Paralelamente, uma linhagem mutante denominada CadG1 foi selecionada por ser tolerante ao Cd e incluída nos estudos de resposta ao Cd. Foram estudadas as respostas antioxidantes destas linhagens na presença do Cd. O primeiro propósito foi conhecer o comportamento enzimático da linhagem MSE em resposta ao Cd, e para isso foi realizado um experimento básico dividido em duas partes; a primeira envolvendo a determinação de peso seco e a segunda com o propósito de estudar as atividades enzimáticas, nas concentrações de 0, 0,005, 0,01, 0,025 e 0,05 mM de CdCl2, e períodos de tempo de 6, 9, 12 e 24 horas, a partir de um crescimento de 12 horas em meio completo (MC). O segundo propósito do trabalho consistiu numa comparação entre a linhagem MSE, previamente caracterizada, e a linhagem mutante resistente ao Cd (CadG1), utilizando-se concentrações de 0, 0,05, 0,025 e 0,05 CdCl2, pelo período de 24 horas. A linhagem MSE apresentou resposta positiva para as enzimas CAT e GR com o aumento do Cd, a enzima SOD apresentou um aumento não significativo e ainda, houve uma redução significativa na quantidade total de proteínas na concentração de 0,05 mM. O período de tempo que melhor expressou a resposta enzimática ao Cd foi de 24 horas. A linhagem CadG1, tolerante ao Cd, mostrou um aumento de 3,6 vezes na enzima GR, enquanto a MSE aumentou em 2 vezes, no mesmo experimento. Houve uma resposta negativa da CadG1 em relação ao aumento do Cd para a enzima CAT, e não houve resposta significativa para a SOD. Ambas as linhagens não apresentaram a enzima guaiacol peroxidase, tanto no controle como na presença do Cd. Os resultados obtidos sugerem que na linhagem mais sensível ao Cd, a MSE, este metal induziu a formação de peróxido de hidrogênio e, por conseqüência, induziu a atividade de CAT e, em menor escala, a GR. Na linhagem mais tolerante, a CadG1, o mecanismo principal de resposta antioxidante foi a enzima GR, sugerindo que ocorreu eliminação de ROS por meio da glutationa reduzida. / The contamination of aquatic environments by heavy metals has became a serious threat to distinct ecossystems, particularly those nearby urban and industrial areas. Based on the ability of fungi to uptake heavy metals from the environment, research has been focused on bioremediation techniques involving microrganisms such as fungi. Such technique involve the removal of toxic ions from the environment by living organisms. These toxic ions can induce the formation of reactive oxygen species (ROS), which can stimulate enzymes such as, peroxidases, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), guaiacol peroxidase, among others, that involved in the defense system. The aim of this work was to study the response of antioxidant enzymes of Aspergillus nidulans to Cd exposure. The strain used was the MSE which contains several markers in all cromossomes and has been studied in detail. A Cd-resistant strain, denominated CadG1, was isolated and also used in this study. The first aspect studied was the enzimatic response of the strain MSE to Cd exposure. Initially, the dry weight was determined for MSE in the presence of Cd. After initial growth for 12 h in complete medium, MSE was further grown in the presence of varying concentrations of CdCl2 (0, 0.005, 0.01, 0.025 and 0.05 mM) for 6, 9, 12 and 24 hours. The activities of antioxidant enzymes were analysed in the different treatments. In a separate experiment using 0, 0.05, 0.025 and 0.05 mM CdCl2 for 24 h, the responses of MSE and CadG1 to Cd exposure were compared. MSE exhibited increased CAT and GR activities in response to Cd, whereas SOD also exhibited some increase in activity, but not significant. Soluble protein content was also shown to be reduced in 0.05 mM CdCl2 treatment. The 24 h CdCl2 treatment was shown to be effective to analysed the response to Cd stress. The Cd-resistant CadG1 strain exhibited a 3.6-fold increase in GR activity, while in MSE the increase was in the range of 2-fold. For CAT a negative response was observed for CadG1 whereas for SOD a significant change in activity was not observed. In both, MSE and CadG1 strains, the activity of guaiacol peroxidase was not observed. The results suggest that Cd induces the formation of hydrogen peroxide in MSE, inducing CAT activity and to a lesser extent, GR activity. However, for the Cd-resistant CadG1 strain, the main effect was observed for Gr activity, which was enhanced, suggesting that in this mutant the dismutation of ROS is mainly due to the mechanism involving GR and reduced glutathione.

O metal pesado cádmio (Cd) é um contaminante ambiental de grande relevância devido aos vários problemas que pode causar para a agricultura, como perdas na produção e na qualidade dos alimentos, podendo oferecer riscos à saúde humana através do consumo de vegetais contaminados. Neste trabalho abordamos duas formas diferentes e independentes para o estudo do estresse oxidativo. Exploramos métodos para compreender melhor: a interação do Cd com o sistema antioxidante de pimentas; bem como os mecanismos responsáveis pela tolerância ao metal utilizando tomateiros com diferentes graus de tolerância em diferentes combinações de enxertia. Resultados interessantes foram obtidos para a combinação de uma variedade sensível enxertada em uma variedade tolerante ao Cd, que apresentou melhor crescimento enxertada em relação a cada uma das variedades enxertadas como controle, inclusive na presença de Cd. Tais resultados podem indicar novos caminhos de pesquisa. No estudo com a pimenta também encontramos respostas notáveis com relação ao sistema antioxidante, em especial, na resposta do ciclo ascorbato-glutationa, cujos compostos antioxidantes foram os principais protagonistas na defesa da planta contra o estresse por Cd. / The heavy metal cadmium (Cd) is an environmental contaminant of great relevance because this element can cause several problems to agriculture, such as production decrease and poor food quality, thereby posing risk to human health through consumption of contaminated vegetables. In this research, we used two different and independent approaches to study the oxidative stress. We explored methods: to better understand Cd interaction with the antioxidant system of pepper; as well as the mechanisms responsible for conferring tolerance to this metal, using tomatoes with different degrees of tolerance grafted in different combinations. Interesting results were obtained, especially when the sensitive tomato line was grafted onto the most tolerant one, presenting a better growth index even in the presence of Cd. These results might lead to new research alternatives and approaches. The results from the study with pepper revealed noteworthy responses regarding the antioxidant system, especially in the ascorbate-glutathione cycle response, whose antioxidant compounds were the main protagonists in the plant defense against stress by Cd.

O crescente aumento da contaminação do solo por metais pesados, em especial o cádmio (Cd), associado à importância dos cereais, sendo estes nos países subdesenvolvidos e alguns em desenvolvimento a maior fonte protéica, são aspectos importantes que originaram a ideia deste estudo que procura analisar o metabolismo do aminoácido essencial lisina em milho (Zea mays), submetido à contaminação por Cd. Foram realizados vários ensaios a fim de se avaliar a atividade das principais enzimas do sistema antioxidante, a quantidade de aminoácidos solúveis totais e a atividade das enzimas da via do anabolismo e catabolismo da lisina. Os resultados foram apresentados na forma de dois capítulos. O capítulo 1 apresenta a caracterização bioquímica das plantas de milho (linhagem 161) submetidas ao estresse pelo Cd analisando-se a quantificação do metal nos diferentes tecidos vegetais, análise das principais enzimas do sistema antioxidante, quantificação de proteínas de reserva e aminoácidos solúveis totais, além da análise das principais enzimas da via da lisina. Os resultados da caracterização bioquímica mostraram que estes parâmetros avaliados não diferiram significativamente entre as plantas contaminadas e as do controle. No capítulo 2 foi realizada a análise das principais enzimas da via da lisina em um outro genótipo de milho, sendo uma variedade comercial (AL Avaré). De maneira geral, os resultados mostraram que o Cd induziu leves alterações nas atividades de algumas enzimas da via da lisina. Além disso, foram observadas diferenças entre os dois genótipos, tanto nas atividades específicas de enzimas como na quantificação de aminoácidos livres. Além dos dois capítulos, foram incluídos dois estudos complementares, que trouxeram análises adicionais ao estudo principal. O estudo complementar 1, apresenta os resultados de um estudo com plântulas de milho, de diferentes genótipos, sendo um com maiores teores de lisina (opaco2) e os outros para alta eficiência no uso de nitrogênio (EUN) e para baixa EUN. Tanto os resultados da peroxidação lipídica, quanto a quantidade de aminoácidos solúveis totais apresentaram diferenças entre os genótipos e doses de Cd utilizadas. O estudo complementar 2 apresenta alguns dados de enzimas antioxidantes, em PAGE não-desnaturante, de coleóptilos e radículas de embriões imaturos (sem a presença de endosperma) e germinados na presença de Cd. Estes dados mostraram uma nítida resposta antioxidante. Além disso, foram analisadas algumas células provenientes de radículas de sementes de milho germinada na presença de Cd, a fim de se avaliar os danos do metal sobre o DNA. Em resumo, os resultados obtidos neste estudo nos ajudaram a entender um pouco mais sobre o efeito do Cd nos processos fisiológicos e bioquímicos das plantas analisadas. Entretanto, estes dados podem ser considerados o ponto de partida para estudos mais detalhados. / The increase of soil contamination by heavy metals, especially cadmium (Cd), associated with the importance of cereals, which are the major source of protein in the underdeveloped and some developing countries, are important aspects that gave rise to the idea for this study which tries to analyze the metabolism of the essential amino acid lysine in maize (Zea mays), submitted to the contamination by Cd. Several tests were carried out to evaluate the activity of the main enzymes of the antioxidant system, the amount of total soluble amino acids and the activity of enzymes of lysine metabolism. The results were presented two chapters. Chapter 1 reports the biochemical characterization of the maize plants (a line with higher levels of lysine, L161) submitted to stress by Cd analyzing the metal quantification in different plant tissues, analysis of the main enzymes of the antioxidant system, quantification of reserve proteins and total soluble amino acids, in addition to the analysis of the main enzymes of lysine pathway The results showed that these parameters did not differ significantly between contaminated plants and those of the control. In Chapter 2 the main enzymes of lysine metabolism were analyzed in a commercial variety of maize (AL Avaré). Overall, the results showed that Cd induced slight changes in the activities of some enzymes of lysine pathway. In addition, differences were observed between the two genotypes, both in the specific activities of enzymes and on quantification of soluble amino acids. In addition to the two chapters, two complementary studies were included, which provided additional analyzes to the main study. Complementary study 1 presents the results of a study with maize seedlings of different genotypes, one with higher lysine (opaque2) and others for high efficiency in nitrogen use (EUN) and low EUN. Lipid peroxidation results and the amount of total soluble amino acids showed differences between the genotypes and the Cd concentrations used. Complementary study 2 presents some non-denaturing antioxidant enzyme data from coleoptiles and immature embryo rootlets (without the presence of endosperm) and germinated in the presence of Cd. These data showed a clear antioxidant response. In addition, some cells from germinated maize seedlings were analyzed in presence of Cd in order to evaluate the damage of the metal on the DNA. In summary, the results obtained in this study helped us to understand a little more about the effect of Cd on the physiological and biochemical processes of the plants analyzed. However, these data can be considered the starting point for more detailed studies.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this work two voltammetric methods were investigated to study the interaction between metals, Cd and Pb, and fat-soluble vitamins (retinol palmitate VA; cholecalciferol VD; α-tocopherol acetate VE; filloquinona - VK). Due to hydrophobic characteristic of these vitamins, the voltammetric measurements were conducted in non aqueous media. In the first method (Method I) acetone was used was used as organic media, tetrabutylamonium iodide (ITBA) 0.2 mol L-1 as electrolyte and an electrode modified reference with double liquid junction - Ag/AgCl/LiCl saturated in ethanol/ITBA 0.02 mol L-1 in N,N - dimetylformamide (DMF). In the second method (Method II) ethanol was used as organic media, acetate buffer pH the 4.6 (in ethanol) as electrolyte and an electrode modified reference with double liquid junction - Ag/AgCl/LiCl saturated in ethanol/acetate buffer pH 4,6 (in ethanol). During the method development the behavior of Cd and Pb in studied conditions was evaluated. Each vitamin was studied individually. Method I was not the more adequate to study the interaction metal-vitamin because in most of the case the vitamin additions caused an increase on the voltammetric signals. Method II presented reduction of the Cd and Pb signals and the anodic shift of peak potentials in presence of the vitamins. The reduction of the signals increased in the order: VK < VD < VE < VA. High peak reduction was observed for Pb with the VA, VE and VD and for Cd with the VK. Measurements of alternating current voltammetry were also investigated to study the adsorption of vitamins on the electrode surface. Comparing the results obtained by the anodic stripping voltammetry with the results by alternated current, it was observed that the variations on the voltammetric signals are related predominantly with to adsorptions of VA and VD while to VE and VK the effect of adsorption was not predominant. / No presente trabalho dois métodos voltamétricos foram investigados para o estudo da interação entre os metais, Cd e Pb, e vitaminas lipossolúveis (palmitato de retinol VA; colecalciferol VD; acetato de α-tocoferol VE; filoquinona - VK). Devido à característica hidrofóbica destas vitaminas, a voltametria foi conduzida em meio orgânico. No primeiro método (Método I) utilizou-se acetona como meio, iodeto de tetrabutilamônio (ITBA) 0,2 mol L-1 como eletrólito e um eletrodo de referência modificado de dupla junção líquida Ag/AgCl/LiCl saturado em etanol/ITBA 0,02 mol L-1 em N,N dimetilformamida (DMF). No segundo método (Método II) utilizouse etanol como meio, o tampão acetato pH 4,6 (em etanol) e o eletrodo de referência modificado de dupla junção líquida Ag/AgCl/LiCl saturado em etanol/Tampão acetato pH 4,6 (em etanol). Na etapa de desenvolvimento dos métodos o comportamento dos metais nas condições estudadas foi avaliado e, após a otimização, estudou-se a modificação dos sinais voltamétricos em função das adições das vitaminas sobre os metais. Cada vitamina foi estudada individualmente. O Método I não foi o mais adequado ao estudo da interação metal-vitamina porque em muitos casos as vitaminas causaram um aumento dos sinais, comportamento contrário ao esperado. O Método II apresentou diminuição dos sinais do Cd e do Pb e ainda o deslocamento anódico dos potencias de pico destes metais na presença de todas as vitaminas. A diminuição dos sinais para Cd e Pb aumentou na ordem: VK < VD < VE < VA, sendo que esta diminuição foi maior para o Pb com VA, VE e VD e maior para o Cd com VK. Medidas por voltametria de corrente alternada foram também realizadas para estudar a adsorção das vitaminas no eletrodo de mercúrio. Comparando os resultados obtidos pela voltametria de redissolução com aqueles de corrente alternada, observou-se que as variações nos sinais voltamétricos estão relacionadas predominantemente ao efeito de adsorção para VA e VD enquanto que para VE e VK o efeito da adsorção não é predominante.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work deals with the synthesis and structural analysis of clusters derivative from cadmium bis(phenylselenolate) - Cd(SePh)2. The methodology for the synthesis was based on the use of Cd(SePh)2 as a starting material, as well as in the in situ generation of the chemical intermediary PhSeCdX (X = Cl, Br, I). These compounds are considered basic building blocks for the synthesized clusters. Through solvothermal conditions and the use of different kinds of phosphine ligands, five new cadmium clusters were obtained. The compounds synthesized were: [Cd4(SePh)7(PPh3)Cl]n (1), [Cd4(SePh)7(PPh3)Br]n (2), [Cd(SePh)(PCy3)Br]2 (3), [Cd(SePh)(PCy3)I]2 (4) and [Cd4(SePh)7(PCy3)Br]n (5). A structural study in the solid state of these compounds was carried out using the X-ray diffraction on single crystal method. All compounds were characterized by elemental analysis, infrared spectroscopy and energy dispersive X-ray spectroscopy. / Este trabalho apresenta o estudo relacionado à síntese e a análise estrutural de clusters derivados de bis(fenilseleneto) de cádmio - Cd(SePh)2. A metodologia de síntese baseou-se na utilização do Cd(SePh)2 como material de partida e na geração in situ do intermediário químico PhSeCdX (X = Cl, Br, I). Estes são considerados blocos de montagem básicos dos clusters sintetizados. Através de condições solvotermais e do uso de diferentes ligantes do tipo fosfina, cinco novos clusters de cádmio foram obtidos. Os compostos sintetizados foram: [Cd4(SePh)7(PPh3)Cl]n (1), [Cd4(SePh)7(PPh3)Br]n (2), [Cd(SePh)(PCy3)Br]2 (3), [Cd(SePh)(PCy3)I]2 (4) e [Cd4(SePh)7(PCy3)Br]n (5). Efetuou-se um estudo estrutural desses compostos no estado sólido, utilizando como ferramenta principal a difração de raios-X em monocristal. Todos os compostos foram caracterizados por análise elementar, espectroscopia no infravermelho e espectroscopia de energia dispersiva de raios-X.

Neste trabalho realizamos um programa de seqüenciamento em larga escala de cDNAs obtidos de bibliotecas construídas a partir de mRNA de células de B. emersonii submetidas ao choque térmico e ao estresse por cádmio. Obtivemos 6350 seqüências expressas (ESTs) de alta qualidade, que representam 2326 seqüências únicas putativas (unigenes) do fungo. Destes unigenes putativos, 1282 genes foram classificados em pelo menos uma das categorias do Consórcio Gene Ontology (GO). A análise do transcriptoma parcial de B. emersonii determinado até o momento permitiu a identificação de 78 unigenes codificando chaperones moleculares de todas as famílias conhecidas. Para avaliarmos a expressão global dos genes em resposta a estresses ambientais, como o choque térmico e o cádmio, realizamos ensaios de microarranjos de DNA nestas condições de estresse. Observamos que em resposta ao choque térmico, B. emersonii induz a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas com o enovelamento de proteínas e com a proteólise, o que seria esperado em condições de temperaturas elevadas, assim como genes que codificam proteínas com propriedades antioxidantes, além de proteínas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos e no metabolismo de carboidratos. Em resposta ao estresse por cádmio, verificou-se a indução de genes que codificam principalmente proteínas com propriedades antioxidantes, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas relacionadas com o transporte celular e proteínas envolvidas no enovelamento de proteínas e proteólise. Uma das conseqüências do estresse por cádmio é o aumento do estresse oxidativo e proteínas antioxidantes têm um papel fundamental na resposta a este tipo de estresse. Dentre os genes observados durante o seqüenciamento das ESTs de B. emersonii, observamos dez genes codificando proteínas distintas da família Hsp70. Nove genes hsp70 são expressos em pelo menos um dos estágios do desenvolvimento do fungo e sete apresentam uma indução significativa após o choque térmico. Estes dados sugerem que estes genes desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse térmico em B. emersonii. Outro dado interessante obtido neste trabalho foi o enriquecimento de ESTs que continham íntrons em sua seqüência nas bibliotecas de estresse. Portanto, o choque térmico e o estresse por cádmio em B. emersonii diminuem a eficiência de processamento dos íntrons permitindo sua caracterização. O cDNA da proteína Hsp17 foi o que apresentou o maior número de ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse. Experimentos de Northern blot indicaram que o gene hsp17 possui um nível de expressão muito baixo durante o ciclo de vida de B. emersonii, no entanto, como esperado sua expressão aumenta drasticamente quando as células de esporulação ou germinação são submetidas a choque térmico. Os níveis da proteína Hsp17 acompanham os níveis do seu mRNA, indicando que o controle da expressão do gene hsp17 deve ocorrer em nível de transcrição. / In this work we realized a large scale, sequencing program of cDNAs libraries obtained from mRNA of B. emersonii cells submitted to heat shock and cadmium stress. A total of 6350 high quality expressed sequence tags (ESTs) were obtained, representing 2326 unique putative genes (unigenes) of this fungus. From these putative unigenes, 1282 genes were classified at least in one of the three Gene Ontology Consortium (GO) categories. The analysis of the partial transcriptome of B. emersonii, determined until now, allowed the identification of 78 unigenes encoding molecular chaperones of all known protein families. To evaluate the global expression of the genes in response to environmental stresses, such as heat shock and cadmium, DNA microarray assays were performed. We observed that in response to heat shock B. emersonii induces the expreession of genes encoding proteins related to protein folding and proteolysis, as expected under high temperature conditions, as well as genes encoding proteins with antioxidant properties and proteins involved in nucleotide and carbohydrate metabolism. In response to cadmium stress, we mainly verified the induction of genes for proteins with antioxidant properties, proteins involved in amino acid metabolism, proteins related to cellular transport and proteins related to protein folding and proteolysis. One of the consequences of the exposure to cadmium is the increase of oxidative stress, and antioxidant proteins have a fundamental role in the response to this kind of injury. Amongst the genes observed during the B. emersonii EST sequencing program, ten genes encoding distinct proteins from the Hsp70 family were observed. Nine of them are expressed at least in one stage of the fungus development and seven genes presented a significant induction during heat shock treatment. These data suggest that the hsp70 genes perform an important role during development and in response to heat stress in B. emersonii. Another interesting result from this work was the enrichment of ESTs containing introns in the stress libraries. Thus, heat shock and cadmium stress decrease the efficiency of intron processing in B. emersonii, allowing for intron characterization. The cDNA for the Hsp17 protein presented the highest number of ESTs sequenced from the stress libraries. Northern blot experiments indicated that the hsp17 gene is expressed at very low levels throughout the life cycle of B. emersonii, however, as expected its expression increases drastically when sporulation or germination cells are submitted to heat shock. Hsp17 protein levels accompany its mRNA levels, indicating that the control of expression of the hsp17 gene occurs at a transcriptional level.

O presente trabalho tem como objetivo caracterizar três agrupamentos de genes da alfa proteobactéria Caulobacter crescentus envolvidos na resposta a metais e antibióticos. Analisamos o agrupamento composto pelos genes CC1637-CC1640, que contém um sistema BlaR/BlaI de transdução de sinal, e realizamos uma análise comparativa de dois sistemas de efluxo da família RND composto pelos genes CC2720-CC2725 e CC2388-CC2390 que estariam envolvidos na resposta a metais cádmio e zinco. Mutantes simples e duplos com deleção em fase foram obtidos, e o estudo da atividade promotora foi realizado através de ensaio de <font face=\"Symbol\">b-galactosidase utilizando gene repórter lacZ . Ensaios de RT-PCR e atividade <font face=\"Symbol\">b-galactosidase mostraram que o gene CC1638 provavelmente não possui promotor próprio e que os genes CC1637- CC1640 podem consituir um operon. A atividade promotora do gene CC1640 não responde a H2O2, Cd2+ e Zn2+, mas a linhagem <font face=\"Symbol\">DCC1640 apresentou baixa viabilidade na presença de Cd2+. As linhagens <font face=\"Symbol\">DCC1637 e <font face=\"Symbol\">DCC1638 mostraram sensibilidade a t-butil-hidroperóxido. A linhagem <font face=\"Symbol\">DCC1640 mostrou-se sensível aos antibióticos CTX e PPT, e ensaios de <font face=\"Symbol\">b-galactosidase em placa e em meio liquido mostraram indução da expressão pelos antibióticos CTX e CFE. Observamos uma auto-regulação do operon pela proteína codificada pelo gene CC1640 (BlaI), confirmado por ensaios de EMSA. A presença de BlaR inibe a ligação da proteína BlaI ao promotor, sugerindo que ambas BlaI/BlaR regulem em conjunto o promotor do gene CC1640. Análise in silico do consenso TTACGNNCGTAA localizado no promotor de CC1640 identificou esta sequência na região promotora de outros genes. A análise da expressão relativa sugere que os genes CC1568, CC1230 e CC2661 são regulados pela proteína BlaI, sugerindo que BlaI regula a expressão de outros genes possivelmente envolvidos na resposta a antibióticos <font face=\"Symbol\">b-lactâmicos. Ensaios de atividade <font face=\"Symbol\">b-galactosidase da região intergênica CC2720-CC2721 mostraram que esta não possui atividade promotora, e análise por RT-PCR confirmou que os genes CC2720-CC2721 são co-transcritos e que fazem parte do operon CC2720-CC2725. A expressão do operon mostrou indução significativa na presença de Cd2+, moderada indução na presença de Zn2+ e Co2+, e pouca indução na presença de Ni2+. A expressão do operon CC2388-CC2390 é altamente induzida na presença de níquel e cobalto, não é induzida por cádmio e moderadamente induzida por zinco. A linhagem <font face=\"Symbol\">DCC2724 não é sensível a zinco, cobalto ou níquel. A linhagem <font face=\"Symbol\">DCC2390 é sensível a cobalto, pouco sensível a níquel e não sensível a zinco, e ambas as linhagens foram sensíveis a cádmio. A obtenção do duplo mutante, assim como sua complementação, foram realizadas, e os resultados sugerem que se trata de dois sistemas de efluxo com diferentes respostas a metal. / The aim of this work is to characterize three clusters of genes from the alpha proteobacterium Caulobacter crescentus involved in metal and antibiotics response. We analyzed the cluster comprising genes CC1637-CC1640, which contains a BlaR/BlaI signal transduction system, and we performed a comparative analysis with two RND efflux systems consisting on genes CC2720-CC2725 and CC2388-CC2390, which are probably involved in cadmium and zinc response. Mutant strains for one or two of these genes were obtained, and the study of promoter activity was performed by <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays using lacZ as reporter gene. RT-PCR and <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays revealed that the CC1638 gene probably does not possess an exclusive promoter, and that the genes CC1637-CC1640 may constitute an operon. The promoter of CC1640 does not respond to H2O2, Cd2+ and Zn2+, but the <font face=\"Symbol\">DCC1640 strain presented low viability in the presence of Cd2+. The <font face=\"Symbol\">DCC1637 and <font face=\"Symbol\">DCC1638 strains showed sensitivity to t-butyl-hydroperoxide. The <font face=\"Symbol\">DCC1640 strain showed sensitivity to the antibiotics CTX and PPT, and <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays performed both on plates and liquid medium showed induction of the expression by the presence of antibiotics CTX and CFE. We observed auto-regulation of the operon by the protein encoded by the CC1640 gene (BlaI), which was confirmed by EMSA assays. The presence of BlaR inhibits the binding of the BlaI protein to the promoter, suggesting that both BlaI/BlaR regulate the CC1640 gene promoter. In silico analyses for the TTACGNNCGTAA consensus, located on CC1640 promoter, identified this sequence in promoter regions of other genes. Relative expression analyses indicate that the genes CC1568, CC1230 and CC2661 are regulated by the BlaI protein, suggesting that BlaI regulates the expression of other genes, possibly involved in <font face=\"Symbol\">b-lactamic antibiotics response. <font face=\"Symbol\">b-galactosidase activity assays of the intergenic region CC2720-CC2721 showed that it does not possess promoter activity, and a RT-PCR analysis confirmed that the genes CC2720-CC2721 are co-transcribed and belong to the CC2720-CC2725 operon. The expression of the operon showed significant induction in the presence of Cd2+, moderate induction in the presence of Zn2+ and Co2+, and a slight induction in the presence of Ni2+. The expression of the CC2388-CC2390 operon is highly induced in the presence of nickel and cobalt, not induced by cadmium and moderately induced by zinc. The <font face=\"Symbol\">DCC2724 strain is not sensitive to zinc, cobalt or nickel. The <font face=\"Symbol\">DCC2390 strain is sensitive to cobalt, slightly sensitive to nickel and not sensitive to zinc, and both strains are sensitive to cadmium. A double mutant was constructed, as well as a complemented strain, and results suggest that these are two efflux systems with distinct metal responses.