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Evaluación de un sistema de co-cultivo de células de Sertoli para diferenciación germinal de células madre mesenquimales (MSC) fetales bovina

Nunda Segunda, Moisés January 2017 (has links)
Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC) pueden ser candidatas adecuadas para la derivación de gametos in vitro debido a su abundancia y a su alto potencial de diferenciación. La diferenciación de las células germinales es un proceso complejo que requiere tanto de regulación endocrina y auto-paracrina en un entorno específico, como de interacciones directas celulares proporcionadas por las células somáticas del testículo. Las células de Sertoli (CS) juegan un papel esencial formando nichos para las células germinales y proporcionando factores esenciales para su diferenciación. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del co-cultivo de CS en la diferenciación de MSC derivadas de tejido adiposo (MSC-TA) y medula ósea (MSC-MO) fetales bovinas hacia linaje de células germinales. Las CS fueron aisladas desde parénquima de testículo de toro adulto y fueron caracterizadas mediante cuantificación de la expresión del biomarcador de CS, Wilms tumor 1 (WT1) y de los niveles de mRNA de Receptor de Andrógeno (AR) utilizando citometría de flujo (FC) y PCR cuantitativo (Q-PCR). Las MSC fueron aisladas desde tejido adiposo y médula ósea mediante adherencia al plástico y posteriormente fueron co-cultivadas sobre monocapas de CS durante 21 días. Muestras de cultivos celulares fueron obtenidas cada 7 días y analizadas para determinación de niveles de mRNA de genes endógenos β-ACTINA y GAPDH, genes de pluripotencia OCT4 y NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, SRY, PIWIL2 y STRA8 mediante Q-PCR. Adicionalmente se evaluó la expresión de Dazl, Nanog y Oct4 mediante FC e IF. Una alta proporción (85,5%±5,5) de CS fueron positivas para WT1. Los niveles mRNA DAZL y PIWIL2 aumentaron el día 14 de diferenciación en co-cultivos de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos y co-cultivos de MSC-MO/CS. Los niveles de mRNA de NANOG fueron activados en MSC-MO y MSC-TA co-cultivadas con CS luego de 7 y 14 días de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 aumentaron (P<0,05) el día 14 en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos. Los niveles de mRNA de CD73 aumentaron (P<0,05) en los co-cultivos el día 21 en comparación con los monocultivos de MSC-MO y MSC-TA, mientras los niveles de mRNA de CD105 disminuyeron (P<0,05) en el co-cultivo de MSC-TA/CS al día 21en comparación con el monocultivos de MSC-TA. Adicionalmente, los niveles de mRNA de SCP3 disminuyeron (P<0,05) en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS el día 7 y 14 en comparación con el monocultivo de MSC-TA y no se detectó en el día 21. Los patrones de expresión génica en los co-cultivos sugieren que las MSC fetales bovinas poseen potencial de diferenciación germinal y que las MSC-TA fetales bovinas tienen mayor capacidad de diferenciación en comparación a las MSC-MO. Considerando la disminución en la expresión de SCP3 en los co-cultivos, estos resultados sugieren que las MSC alcanzaron un estado de diferenciación germinal premeiótico temprano / Mesenchymal stem cells (MSC) may be suitable candidates for in vitro gamete derivation due to their abundant source and wide differentiation potential. Germ cell differentiation requires endocrine and auto/paracrine regulation in a specific environment, as well as direct cell-to-cell interactions provided by the somatic cells of the testis. Sertoli cells (SC) play an essential role by forming niches and providing essential factors for germ cell differentiation. The aim of the present study was to evaluate the effect of co-culture of SC on the germ cell differentiation potential of bovine fetal MSC derived from adipose tissue (MSC-TA) and bone marrow (MSC-BM). Sertoli cells were isolated from bull testis parenchyma and characterized by quantification of biomarker wilms tumor 1 (WT1) expression and androgen receptor (AR) mRNA levels using flow-cytometry (FC) and quantitative-PCR (Q-PCR) analyses. bfMSC were isolated from adipose tissue and bone marrow and were co-cultured over monolayers of SC for 21 days. Cell culture samples were obtained every 7 days and analyzed for endogenous genes β-ACTIN y GAPDH, pluripotency genes OCT4 y NANOG, germinal genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germinal genes DAZL, SRY, PIWIL2 and STRA8 using Q-PCR. A high (P < 0.05) proportion of SC (85,5%±5,5) were positive for WT1 and expressed high levels of WT1 and AR mRNA levels. Levels of DAZL and PIWIL2 mRNA were up-regulated at day 14 of differentiation in bfMSC-SC co-cultures compared to monocultures and co-cultures of MSC-BM/CS. NANOG mRNA levels were activated in MSC-BM and MSC-TA co-cultured with SC at days 7 and 14 of culture. OCT4 mRNA levels increased (P <0.05) at day 14 in co-cultures of MSC-BM/CS and MSC-TA/CS compared to monocultures. CD73 mRNA levels increased (P <0.05) in the co-cultures at day 21. CD105 mRNA levels were decreased (P < 0.05) in the co-culture of MSC-TA/CS at day 21 of culture compared to monoculture of MSC-TA. SCP3 mRNA levels were down-regulated in the co-cultures of MSC-BM/CS and of MSC-TA/CS at 14 day compared to monoculture and were not detected at day 21. Thus, the gene expression patterns in MSC suggest that they have the potential for germinal differentiation and that bfMSC-TA have greater differentiation capacity towards germinal lineage in relation to MSC-BM. Moreover, reduction in SCP3 mRNA throughout the process of germinal differentiation suggest that MSC achieved an early premeiotic germ cell differentiation state / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1161251.
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Localización en dominios de membrana y biosíntesis de los esfingolípidos con ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena de células espermatogénicas en diferenciación

Santiago Valtierra, Florencia Ximena 22 March 2019 (has links)
El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la fisiología del sistema reproductor masculino a través del estudio de cómo esfingolípidos que son específicos de las células espermatogénicas (o células germinales, CG) cambian con el avance de la maduración sexual y la diferenciación celular. El foco estuvo sobre las especies moleculares de esfingomielina (SM) y de ceramida (Cer) con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de muy larga cadena (VLCPUFA), que se presentan como VLCPUFA no hidroxilados (n-V) y 2-hidroxilados (h-V) de hasta 32 átomos de carbono en las CG de rata. Los objetivos específicos fueron i) investigar cómo se distribuyen estas especies moleculares entre las membranas de las CG, ii) determinar cómo cambia con el desarrollo testicular y la diferenciación celular la expresión de los genes que codifican a las enzimas responsables de la biosíntesis de los n-V y los h-V, iii) establecer si las CG aisladas son capaces de biosintetizar por sí mismas estas especies de Cer y de SM entre otras a través de la vía de novo y de expresar las correspondientes sintasas, y iv) inquirir sobre factores endocrinos y/o paracrinos capaces de modular dicha actividad y/o expresión. Los efectos del desarrollo se estudiaron en testículos de animales de distintas edades postnatales (P), y los de la diferenciación en poblaciones de CG en los estadios de espermatocitos en paquiteno (EP), espermátidas redondas (ER), y espermátidas elongadas o tardías (ET), aisladas a partir de las células totales (CT) del epitelio seminífero de ratas adultas. En algunas mediciones se incluyeron a los cuerpos residuales (CR) y a las células de Sertoli (SC). Las poblaciones de CG se aislaron utilizando gradientes continuos de albúmina. Los estudios que requirieron separación, aislamiento e identificación de clases de lípidos y especies moleculares se hicieron por técnicas cromatográficas de alta resolución y sensibilidad. Las investigaciones sobre biosíntesis de n-V o de esfingolípidos (SL) se hicieron en CG mantenidas en cultivo primario, siguiendo las transformaciones biológicas de sustratos radioactivos. La expresión de genes a nivel ARNm se comparó aplicando PCR cuantitativa, y a nivel proteína se evaluó utilizando técnicas de Western blot seguida de inmunomarcación con anticuerpos, y en cortes de tejido por microscopía de inmunofluorescencia. En la primera parte de la tesis se compararon la localización y la distribución de glicerofosfolípidos (GPL), colesterol y SM entre fracciones de membrana obtenidas de EP, ER y ET. El foco estuvo puesto en la distribución lateral de las especies moleculares de SM y Cer con VLCPUFA entre fracciones de membrana conteniendo dominios tipo raft y no-raft, partiendo de la hipótesis de que estas especies se verían excluidas de los primeros. Utilizando preparaciones de CT, inicialmente comparamos dos métodos, originalmente diseñados para estudiar la separación lateral de proteínas en membranas, para decidir cuál sería más apropiado para evaluar la distribución lateral de los lípidos. El método clásico, que utiliza detergente en frío para obtener fracciones de membrana ricas en dominios tipo raft, mostró bajas recuperaciones de lípido y proteína, separación incompleta de los lípidos entre dominios, interferencia del detergente en los análisis, e hidrólisis parcial de GPL y SM. Se encontró preferible un método que usa gradientes de sacarosa para separar fracciones de membrana sobre la base de su densidad a partir de homogenados totales (HT), pues permitió separar fracciones de membrana livianas, pesadas, y extra-pesadas (ML, MP y MEP, respectivamente) además de una fracción aún más pesada en el pellet o sedimento de la homogenización. La recuperación, tanto del fósforo lipídico como de la proteína, alcanzó, en promedio, un 85% del originalmente presente en los HT. Proteínas marcadoras mostraron que las pequeñas ML contenían dominios tipo-raft/caveolas, y las abundantes MP dominios no-raft, principalmente derivados de la membrana plasmática, mientras las MEP eran ricas en membranas intracelulares. Consistente con su rol como precursoras de esfingolípidos con VLCPUFA, especies de Cer con n-V y h-V se hallaron más concentradas en las MEP. Como se esperaba, las ML contenían GPL y SM con AG saturados, mientras las MP eran ricas en GPL con PUFA y SM con VLCPUFA. Llamativamente, tal vez debido a la alta insaturación de esos ácidos grasos, la relación colesterol/fosfolípidos fue más alta en las MP que en las ML. Con el avance de la diferenciación, el contenido de Cer con VLCPUFA, especialmente h-V Cer, tendió a aumentar en las MP de las CG en el sentido EP→ER→ET. En el mismo sentido, mientras los ácidos grasos de los lípidos de ML no variaron, en los de las MP las relaciones 22:5n-6/20:4n-6 en GPL y h-V/n-V en SM y en Cer aumentaron en forma altamente significativa. En la segunda parte, se determinó la expresión de enzimas que se espera jueguen un papel en la biosíntesis de los n-V y los h-V de SM y Cer. El foco estuvo puesto en la Elovl4 y la Fa2h, con la hipótesis, basada en lo que habían mostrado los lípidos, de que sus expresiones aumentarían con el desarrollo postnatal en el testículo y que, en las CG de animales adultos, variarían en sentidos opuestos, la primera disminuyendo y la segunda aumentando con la diferenciación. Seis de los 7 miembros de la familia de genes Elovl, se expresaron a nivel ARNm en CG. Los genes Elovl5 y Elovl2 se incluyeron en el estudio por codificar elongasas cuya actividad parcialmente se superpone, colaborando en la biosíntesis de PUFA, y porque Elovl2 es esencial en la formación de PUFA de 24 carbonos que sirven de sustrato a la Elovl4. Contrario a lo esperado, el nivel de ARNm de Elovl4 se halló elevado en testículos que virtualmente carecían de CG (y de SM o Cer con n-V), como lo fueron los de animales en edades infantiles (P14) y los de adultos (P90) que habían sido despojados de CG por exposiciones repetidas a episodios de hipertermia. Esta aparente inconsistencia se debió a que el nivel de ARNm de Elovl4 fue inesperadamente alto en las SC. Con la maduración sexual, los niveles de Elovl4-ARNm en el testículo decrecieron hasta la adultez, para permanecer luego relativamente constantes. Entre las células espermatogénicas del adulto, los contenidos más altos de este ARNm aparecieron en las ET y en los CR. En contraste con Elovl4, Fa2h no se expresó como ARNm en el testículo hasta la edad de aparición de las ER (P26), y sus niveles aumentaron con el crecimiento y la diferenciación celular. Como proteínas, ni Elovl4 ni Fa2h se expresaron en las SC. Elovl4 estuvo más concentrada en EP que en ER, en las que mostró una localización perinuclear. En el citoplasma de las ET apareció concentrada en pequeñas estructuras esféricas que podrían ser CR en formación. Como proteína, Fa2h se encontró especialmente concentrada en las ET, asociada a una estructura supranuclear que juega un rol importante en dar la forma definitiva a la cabeza de los futuros espermatozoides. Elovl4 y Fa2h no se detectaron en las gametas liberadas desde el epitelio seminífero. La actividad combinada de las elongasas en estudio (Elovl5, Elovl2 y Elovl4) se evaluó comparando las conversiones sufridas por el [3H]20:4n-6 en cultivos de EP, ER y ET, así como de SC. Este PUFA fue elongado en las cuatro poblaciones celulares a [3H]22:4 y [3H]24:4, y estos productos fueron activamente desaturados a [3H]22:5 y [3H]24:5. Como se esperaba, se encontraron n-V tetraenoicos y pentaenoicos marcados con [3H] de 26 y hasta 32 carbonos sólo en las CG. La actividad de elongación de PUFA decreció en el sentido EP→ER→ET. En la tercera parte, con la hipótesis de que las CG serían capaces de producir sus propios esfingolípidos, investigamos cómo espermatocitos y espermátidas biosintetizan Cer, SM y GlcCer, y cómo dicha actividad, así como la expresión de los genes de las correspondientes sintasas, cambian con la diferenciación. Paralelamente evaluamos la posibilidad de que la biosíntesis y/o la expresión génica estuvieran afectadas por la testosterona (Tes) y por factores solubles liberados desde las SC. Empleando como precursor al [3H]16:0 y dos inhibidores específicos de la ruta biosintética de novo (Lcicloserina y fumonisina B1) hallamos que las CG, aisladas y en cultivo, son capaces de biosintetizar sus propias Cer y SM, incluyendo sus especies moleculares con VLCPUFA, además de GlcCer. Estas actividades biosintéticas fueron máximas en los EP, disminuyendo con la diferenciación (EP>>ER). La Tes estimuló la biosíntesis de [3H]SM sólo en las ER. La suplementación con el medio condicionado obtenido de cultivos de SC (MCS) estimuló significativamente la formación de [3H]Cer tanto en EP como en ER, la de [3H]SM sólo en ER, y la de [3H]GlcCer sólo en EP. La Tes y el MCS incrementaron a todas las especies moleculares de Cer y de SM, incluyendo las n-V. En comparación con el MCS sólo, la combinación Tes+MCS promovió significativamente la biosíntesis de [3H]SM en los EP, mientras la redujo en las ER, en las cuales incrementó la marcación de [3H]Cer y de [3H]GlcCer. El estímulo sobre la marcación de Cer y SM fue específico para las [3H]n-V Cer y [3H]n-V SM. El significativo fomento que sobre la biosíntesis de novo ejerció el MCS indica que factores solubles (o transportados en microvesículas) provenientes de las SC (incluyendo tal vez distintas formas de ARN), juegan un rol en promover, en las CG, la biosíntesis de esfingolípidos destinados a sus membranas. En esta tercera parte de la tesis también se investigó la expresión a nivel ARNm de genes que codifican para cuatro sintasas (S) clave implicadas en la biosíntesis de SL (CerS3, SMS1, SMS2, y GlcCerS), de tres elongasas de ácidos grasos (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), y de Fa2h. Se encontró que los niveles de ARNm de CerS3 fueron máximos en EP y los de SMS2 máximos en ER, ambos disminuyendo en las ET. Los de GlcCerS disminuyeron menos que éstos con la diferenciación, y los de SMS1 no variaron. Los cuatro ARNm también aparecieron en los CR. Mientras CerS3 no se expresó en las SC, los ARNm de las demás sintasas se encontraron en ellas, aunque en cantidades menores que en las CG. En la última parte de esta sección se estudiaron, en las células espermatogénicas totales, los efectos de la Tes, del MCS, y de Tes+MCS sobre los niveles de ARNm de las enzimas mencionadas. Las expresiones como ARNm de Elovl2 y Elovl4 mostraron ser reguladas por el MCS, las de SMS2 y Elovl5 por MCS y Tes, y la de Fa2h sólo por Tes. La Tes y el MCS, tanto por separado como combinados, no afectaron los niveles de ARNm de CerS3, SMS1, o GlcCerS, mientras tendieron a reducir los de SMS2. La presencia de Tes no afectó el ARNm de Elovl2 ni el de Elovl4, mientras tendió a aumentar el de Elovl5. El MCS, por su parte, redujo significativamente los ARNm de las tres elongasas. Cuando Tes y MCS se combinaron, el ARNm de Elovl5 aumentó, y los de Elovl2 y Elovl4 continuaron bajos, recapitulando la influencia de Tes y del MCS, respectivamente. El efecto más significativo de la Tes, tanto sola como combinada con el MCS, fue el de estimular la expresión de Fa2h. Tomados en conjunto, estos resultados muestran por primera vez que factores que juegan roles fisiológicos en la espermatogénesis, como lo son la testosterona y moléculas liberadas desde las células de Sertoli, son capaces de estimular la biosíntesis de novo de esfingolípidos en las células espermatogénicas y de regular, en algunos casos a la alta y en otros a la baja, la expresión génica de algunas de las enzimas responsables de dicha biosíntesis. / The overall objective of this work was to contribute to the knowledge of the physiology of the male reproductive system by examining how molecular species of sphingolipids that are specific of spermatogenic cells (or germ cells, GC) change with the progress of sexual maturation and cell differentiation. The focus was on the sphingomyelins (SM) and ceramides (Cer) having polyunsaturated fatty acids (PUFA) with very long chains (VLCPUFA), which occur in their non-hydroxy (n-V) and 2-hydroxy (h-V) forms and have up to 32 carbon atoms in rat GC. The specific aims were i) to investigate how these molecular species distribute among the GC membranes, ii) to determine how the expression of genes that code for the enzymes responsible for the biosynthesis of n-V and h-V changes with testis maturation and GC differentiation; iii) to ascertain whether isolated GC are able to biosynthesize these species of Cer and SM among others through the de novo pathway and to express the corresponding synthases, and iv) to inquire into endocrine and/or paracrine factors that are capable of modulating such an activity and/or expression. The effects of development were studied in testes at specific postnatal ages, and those of differentiation in GC populations at the stages of pachytene spermatocytes (PtS), round spermatids (RS), and elongated or late spermatids (LS) that were isolated from the total cells (TC) of the seminiferous epithelium of adult rats. In some analyses the residual bodies (RB) and the Sertoli cells (SC) were included. The GC populations were isolated using continuous gradients of albumin. The studies that required separation, isolation, and identification of lipid classes and molecular species were performed using chromatographic techniques of high resolution and sensitivity. The investigations about biosynthesis of n-V and of sphingolipids (SL) were done in GC maintained in primary culture by following the biological transformations of radioactive substrates. Gene expression at the mRNA level was compared by applying quantitative PCR, and at the protein level it was evaluated using Western blot followed by immunolabeling with antibodies, and in tissue sections by immunofluorescence microscopy. In the first part of the thesis the localization and distribution of glycerophospholipids (GPL), cholesterol, and SM among membrane fractions obtained from PtS, RS, and LS were compared. The focus was on the lateral distribution of the molecular species of SM and Cer with VLCPUFA between membrane fractions containing raft-like and non-raft domains, with the hypothesis that these species would be excluded from the former. Using TC preparations, initially we compared two methods, originally designed to study the lateral separation of proteins in membranes, in order to decide which one would be most suitable to evaluate the lateral distribution of lipids. The classic method that uses detergent at low temperature to obtain fractions rich in raft-like domains showed poor recuperation of lipid and protein, incomplete separation of lipids between membrane fractions, interference of the detergent in lipid analyses, and partial hydrolysis of GPL and SM. A method that employs sucrose gradients to separate membrane fractions from total homogenates (TH) on the basis of their densities was preferred, as it allows separation of light, heavy, and extra-heavy membrane fractions (LM, HM, and EHM, respectively) and an even heavier fraction in the pellet or sediment of homogenization. The recovery of lipid phosphorus and protein amounted, in average, to an 85% of that originally present in the TH. Protein markers showed that the small LM fractions contained raft-like/caveolae domains, and that the abundant HM had non-raft domains, mostly derived from cell plasma membranes, whereas the EHM were rich in intracellular membranes. Consistent with their role as precursors of sphingolipids with VLCPUFA, Cer species with n-V and h-V were found most concentrated in EHM. As expected, the LH contained GPL and SM with saturated fatty acids, whereas the HM fractions were rich in GPL with PUFA and SM with VLCPUFA. Interestingly, perhaps because of the high unsaturation of these fatty acids, the cholesterol/phospholipid ratio was higher in HM than in LH. The content of Cer with VLCPUFA, especially h-V Cer, tended to increase in the MP of GC with the progress of differentiation in the direction PtS→RS→LS. In the same direction, the fatty acids of LH lipids did not vary, while in those of MP the 22:5n-6/20:4n-6 ratio in GPL and the h-V/n-V ratio in SM and Cer increased in a highly significant form. In the second part, the expression of enzymes that are expected to play a role in the biosynthesis of the n-V and h-V of SM and Cer was determined. The focus was placed on Elovl4 and Fa2h, on the hypothesis, based on what lipids had shown, that their expressions would increase in testes with postnatal development and that, in adult animal GC, their expressions would vary in opposite directions, the former decreasing and the latter increasing with cell differentiation. Six of the 7 members of the Elovl gene family were expressed at the mRNA level in GC. The Elovl5 and Elovl2 genes were included in the survey as they code for elongases with partially overlapping activities, collaborating in the biosynthesis of PUFA, and because Elovl2 is essential in the formation of the 24 carbons PUFA that serve as substrates to Elovl4. Against our expectations, the Elovl4 mRNA level was found high in testes virtually lacking GC (and SM or Cer with n-V), as were those of animals in infantile ages (P14) and those of adults that had been deprived of their GC by repeated exposures to episodes of hyperthermia. This apparent inconsistency was due to the fact that the mRNA level of Elovl4 was unexpectedly high in SC. With sexual maturation, the Elovl4-mRNA levels in testes decreased up to adulthood, then remaining relatively constant. Among adult spermatogenic cells, the highest content of this mRNA appeared in LS and RB. In contrast with Elovl4, Fa2h did not express itself as mRNA in testes until the appearance of RS (P26), and their levels increased with cell growth and differentiation. As proteins, Elovl4 and Fa2h were not expressed in SC. Elovl4 showed a perinuclear localization, was more concentrated in PtS than in RS, and then appeared concentrated in small spherical structures in LS cytoplasm, which could be RB in formation. As a protein, Fa2h was found mainly concentrated in LS, associated to a supranuclear structure that plays an important role in giving the final shape to the heads of the sperm cells to-be. Elovl4 and Fa2h were not detected in the gametes released from the seminiferous epithelium. The combined activity of the elongases under study (Elovl5, Elovl2 and Elovl4) was evaluated by comparing the conversions undergone by [3H]20:4n-6 in cultures of PtS, RS and LS, as well as of SC. In the four cell populations this PUFA was elongated to [3H]22:4 and [3H]24:4, and these products were actively desaturated to [3H]22:5 and [3H]24:5. As expected, [3H]-labeled tetraenoic and pentaenoic n-V having 26 to 32 carbons were found only in GC. The activity of PUFA elongation decreased in the direction PtS→RS→LS. In the third part, with the hypothesis that GC would be able to produce their own SL, we investigated how spermatocytes and spermatids biosynthesize Cer, SM and GlcCer, and how such an activity, as well as the expression of genes of the corresponding synthases, would change with cell differentiation. In parallel we evaluated the possibility that biosynthesis and/or gene expression would be affected by testosterone (Tes) and by soluble factors released from SC. Employing [3H]16:0 as precursor and two specific inhibitors of the de novo biosynthetic pathway (L-cycloserine and fumonisin B1), we found that GC, isolated and in culture, are able to biosynthesize their own Cer and SM, including their molecular species with VLCPUFA, and also GlcCer. These biosynthetic activities were maximal in PtS, decreasing with differentiation (PtS>>RS). Tes stimulated the biosynthesis of [3H]SM, only in RS. Supplementation with the conditioned medium obtained from SC cultures (CMS), significantly stimulated the formation of [3H]Cer in PtS and RS, that of [3H]SM only in RS, and that of [3H]GlcCer only in PtS. All the molecular species of Cer and SM were increased by Tes and CMS, including the n-V. In comparison with CMS, the combination Tes+CMS significantly promoted the biosynthesis of [3H]SM in PtS, while reducing it in ER, in which cells it increased the labeling of [3H]Cer y de [3H]GlcCer. The stimuli on Cer and SM labeling was specific on the [3H]n-V Cer and [3H]n-V SM. The significant enhancement that CMS exerted on the de novo biosynthesis indicates that factors that are soluble (or transported in microvesicles) coming from SC (perhaps including different forms of RNA), play a role in promoting in CG the biosynthesis of SL destined to their membranes. In this third part of the thesis we also evaluated the expression, at the mRNA level, of genes that code for four key sinthases (S) involved in the biosynthesis of SL (CerS3, SMS1, SMS2, and GlcCerS), of three fatty acid elongases (Elovl5, Elovl2 y Elovl4), and of Fa2h. We found that the mRNA levels of CerS3 were maximal in PtS and those of SMS2 maximal in RS, while both decreased in LS. Those of GlcCerS varied less than these with differentiation and those of SMS1 did not vary. The four mRNA also appeared in RB. Whereas CerS3 was not expressed in SC, the mRNA of the other synthases was, although in lesser amounts than in GC. In the last part of this section the effects of Tes, CMS, and Tes+CMS on the mRNA levels of the above-mentioned enzymes were studied in total spermatogenic cells. The expressions as mRNA of Elovl2 and Elovl4 were regulated by CMS, those of SMS2 and Elovl5 by CMS and Tes, and that of Fa2h only by Tes. Tes and CMS, either separately or in combination, did not affect the mRNA levels of CerS3, SMS1, or GlcCerS, while tended to reduce those of SMS2. The presence of Tes did not affect the mRNA of Elovl2 or Elovl4, while tended to increase those of Elovl5. The CMS reduced significantly the mRNA levels of the three elongases. When Tes and CMS were together, the mRNA of Elovl5 increased, and those of Elovl2 and Elovl4 continued low, recapitulating the influence of Tes and CMS, respectively. The most significant effect of Tes, either alone or combined with CMS, was to stimulate the expression of Fa2h. Taken together, these results show for the first time that factors that play physiological roles in spermatogenesis, as testosterone and molecules released from Sertoli cells do, are able to stimulate the de novo biosynthesis of sphingolipids in spermatogenic cells, and to regulate, in some cases positively and in others negatively, the gene expression of some of the enzymes responsible for such biosynthesis.
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Metabolic engineering on IgG producing CHO cell: construction and comparative analysis of clones at a metabolic level

Wilkens Díaz-Muñoz, Camila January 2015 (has links)
Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / La venta de biofármacos representa una industria billonaria que ha crecido exponencialmente desde la década de los 70's debido al aumento de la demanda por estas proteínas terapéuticas altamente específicas. Estas proteínas recombinantes son sintetizadas por diferentes líneas celulares, especialmente aquella derivada de ovarios de hámster chino CHO ya que presentan altas tasas específicas de producción de proteína recombinante y son fácilmente adaptables a escalas industriales. Hoy en día, más de la mitad de los anticuerpos monoclonales que se encuentran en el mercado son producidos por células CHO. Para incrementar el rendimiento de los procesos productivos, diferentes metodologías han sido usadas por investigadores. Resultados positivos han sido obtenidos aplicando principios de ingeniería y utilizando herramientas de biología molecular para modificar reacciones bioquímicas. Proyectos de Ingeniería Metabólica han sido exitosos en reducir la producción de metabolitos indeseados, especialmente lactato, e incrementar la síntesis de proteína recombinante. En este trabajo se estudia el efecto que tienen diferentes estrategias de Ingeniería Metabólica sobre el metabolismo y cultivo de células CHO. Se ha probado que el metabolismo de carbono de células CHO es altamente ineficiente, consumiendo una cantidad de glucosa mayor de la necesaria para mantener el metabolismo energético y proliferación celular. En este trabajo se construyeron clones de células CHO productoras de IgG recombinante que sobre-expresan PYC2, MDH II y trasportador de fructosa. La expresión de estos genes permitiría aliviar cuellos de botella en el metabolismo central del carbono de las células. En este trabajo se estudiaron y contrastaron los efectos de la sobre-expresión de estos genes sobre la extensión de los cultivos, metabolismo y productividad. Los resultados indican que todos los clones estudiados presentan un metabolismo más eficiente, caracterizado por una menor producción de lactato por glucosa consumida y que no todos mejoraron su proliferación celular y/o productividad específica. Células CHO sobre expresando PYC2 mejoraron su tasa máxima de crecimiento, pero redujeron la tasa de producción de proteína recombinante; la sobre-expresión de MDH II conduce a la reducción del crecimiento celular y síntesis de proteína; finalmente, sobre-expresar el transportador de fructosa aumenta la proliferación celular y síntesis de proteína recombinante en medios con fructosa. Proponemos que las diferencias en producción de proteína se deben a alteraciones del estado RedOx de la célula que afectan en ensamblado de las cadenas peptídicas y la secreción de éstas. Reducir la expresión del gen Lactato deshidrogenasa A ha sido el objetivo de numerosos trabajos con el fin de reducir la síntesis de lactato e incrementar la producción de proteína recombinante. Utilizando el nuevo sistema para edición genómica CRISPR-Cas logramos interrumpir una de las copias del gen. Resultados del análisis de cultivos fed-batch de estas células indican que el crecimiento celular y el metabolismo fueron afectados y la síntesis específica y volumétrica de la proteína recombinante incrementó considerablemente. Se realizó un análisis a profundidad del metabolismo de las células deficientes en LDHa. Se midió la razón NAD+/NADH de éstas y el valor indicó que las células mutadas presentan niveles de NAD +/NADH menores que las del cultivo control, sugiriendo una mejora en su metabolismo energético debido a la mayor acumulación de NADH. Mediante Análisis de Flujos Metabólicos se estimó los flujos entre las reacciones más importantes del metabolismo central de las células. Los resultados confirmaron que en las células mutantes existen mayores flujos en el ciclo del TCA, debido principalmente a un mayor aporte de carbonos provenientes del catabolismo de amino ácidos. Estas células también presentan un menor flujo en la vía de la glicólisis, lo que se correlaciona con la menor proliferación que estas presentaron, y esto último puede explicar el aumento de síntesis de proteínas. En este trabajo se aplicaron exitosamente conceptos de Ingeniería Metabólica para la construcción de clones con distintos metabolismos. Este trabajo revela los efectos de varias modificaciones, lo que lo hace una fuente útil información acerca de los efectos que tienen variadas estrategias metabólicas sobre cultivos de células CHO. Finalmente, este trabajo resulta ser un aporte para la comunidad científica contribuyendo con la primera comparación de diferentes clones que sobre-expresan genes claves del metabolismo central del carbono y entregando el primer estudio en profundidad del efecto de reducir la expresión del gen de la LDHa.
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Comparación entre el esquema de quimioterapia BEP vs PEI en el tratamiento de pacientes con tumores de células germinales avanzado diseminado

Álvarez Barreda, Renzo January 2003 (has links)
El objetivo del presente estudio fue comparar el régimen de quimioterapia estándar BEP vs el régimen PEI en el tratamiento de pacientes con tumores de células germinales diseminado avanzado de alto riesgo, en cuanto a respuesta completa, respuesta favorable, sobrevida libre de enfermedad, sobrevida global y toxicidad. Pacientes y método: Un total de 35 pacientes con diagnostico de tumor de células germinales diseminado avanzado de mal pronostico (IGCCG)que recibieron quimioterapia con esquema BEP o PEI entre enero 1995 y diciembre 1999 en el Servicio de Oncología Medica del Hospital Rebagliatti fueron evaluados retrospectivamente. Resultados: 14 pacientes con esquema BEP y 21con esquema PEI fueron evaluados. Las tasa de respuesta completa (PEI,26%;BEP,28%), tasas de respuesta favorable (PEI,45%;BEP,42%) y sobrevida global a 3 años (PEI,71%;BEP,65%) no fueron significativamente diferentes entre los 2 tratamientos. La tasa de sobrevida libre de enfermedad a 3 años fue significativamente mayor para el esquema PEI (62 vs 56%). La toxicidad hematológica y genitourinaria fue significativamente mayor en los pacientes que recibieron PEI.
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Manejo del Trombo en Cava por Cancer Renal

Cadillo Chávez, Ronald Germán January 2002 (has links)
Se realizo un estudio retrospectivo en un total 23 pacientes de cáncer renal con presencia de trombo tumoral en la vena renal atendidos y tratados quirúrgicamente en el Hospital Nacional Edgardo Rebagliatti Martins en el período de 1995 – 2001. El presente trabajo se ha realizado se realizo con el objetivo de conocer los resultados del tratamiento quirúrgico empleado en pacientes con cáncer renal y compromiso por trombo tumoral en la vena renal. Se encontró que el sexo masculino (67%) es el mas afectado en una proporción de 2:1 , la edad mas frecuente es en mayores de 50años (89,4%). Asi mismo se encontró que no existe relación entre el tamaño tumoral y la presencia de compromiso por trombo tumoral en la vena cava, el estadio 3b fue el mas frecuente con 87%. La sobrevida de los pacientes fue a 1 año de 78% y a 5 años de 42% Las complicaciones postoperatorias más frecuentes fueron la infección de herida operatoria (8,7%), neumonia (4,4%). El mayor tiempo de estancia hospitalaria fue de 5 – 7 dias (73,9%). Por los resultados obtenidos vemos que el tratamiento quirúrgico del trombo tumoral en la vena cava por cáncer renal es un tratamiento efectivo y que ofrece a dichos pacientes una mejor sobrevida.
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Estudio de la señalización de insulina en cardiomiocitos hipertróficos

Gutiérrez Aceituno, Tomás Raúl January 2012 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magister en Bioquímica en el área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La hipertrofia cardiaca es un proceso fisiopatológico que busca compensar un incremento en la carga de trabajo del corazón. Este proceso se caracteriza por un incremento en el tamaño de los cardiomiocitos, células encargadas de la contracción del corazón, llevando a un aumento en el tamaño de este órgano. En un principio la hipertrofia busca mejorar la función cardiaca, fenómeno conocido como hipertrofia adaptativa. Si esta condición se mantiene en el tiempo se produce hipertrofia patológica, que se caracteriza por ser irreversible y predisponer al desarrollo de arritmias, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. Al mismo tiempo, el corazón hipertrófico presenta importantes cambios en su metabolismo energético, homeostasis del Ca2+ y un estado de resistencia a la insulina. La insulina es una hormona fundamental para la regulación del metabolismo energético del organismo y es clave en el control de los niveles plasmáticos de glucosa. En el corazón, su principal función es promover la entrada de glucosa al cardiomiocito y favorecer su uso como fuente energética, promoviendo la glicólisis y su posterior oxidación en la mitocondria. La resistencia a insulina en el corazón como la observada en hipertrofia, se asocia a una menor capacidad de trabajo y constituye un factor de riesgo para insuficiencia cardiaca y muerte post-isquemia, por lo que conocer con mayor profundidad sus características moleculares es de gran importancia. Recientemente se ha descrito que la salida de Ca2+ desde el retículo endoplasmático (principal reservorio intracelular de Ca2+) a través de los receptores/canales de inositol-1,4,5-trifosfato es un elemento clave para la acción metabólica de insulina, incluida la captación de glucosa. Por otro lado, se sabe que la mitocondria regula las señales mediadas por Ca2+, actuando como un amortiguador e incorporando Ca2+ luego de un incremento de sus niveles en el citoplasma. A su vez, este Ca2+ es un importante regulador del metabolismo mitocondrial. A pesar de su capacidad para generar una liberación de Ca2+ al citoplasma, se desconoce si insulina regula el metabolismo mitocondrial mediante un incremento en los niveles de Ca2+ en la mitocondria. Por otro lado, se desconoce si la resistencia a insulina generada por hipertrofia ocurre a consecuencia de una menor liberación de Ca2+ en respuesta a esta hormona. A fin de responder estas interrogantes, el principal objetivo de esta tesis consistió en evaluar si los cardiomiocitos hipertróficos presentan una menor señal de Ca2+ citoplasmático y/o mitocondrial en respuesta a insulina comparado con cardiomiocitos controles. Para evaluar esta posibilidad, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se estimularon con noradrenalina, un estímulo clásico para generar hipertrofia patológica, por 24 h y luego se midió la señal de Ca2+ en respuesta a insulina. Para comprobar que estos cardiomiocitos presentaban una menor respuesta a insulina se evaluaron la fosforilación de Akt, un marcador de los efectos metabólicos de esta hormona, y el consumo de oxígeno, un marcador de la actividad metabólica mitocondrial. Se observó una reducción de ambos parámetros en cardiomiocitos hipertróficos en respuesta a insulina. La señal de Ca2+ en respuesta a insulina se midió mediante microscopía confocal y sondas fluorescentes sensibles al Ca2+ destinadas específicamente al citoplasma y la mitocondria. Los cardiomiocitos hipertróficos mostraron una marcada reducción en el incremento del Ca2+ mitocondrial en respuesta a insulina, mientras que el incremento en el Ca2+ citoplasmático no se modificó. Mediante un estudio de colocalización usando microscopia confocal y sondas fluorescentes organelo-especificas, se determinó que la menor entrada de Ca2+ a la mitocondria se podría deber a un alejamiento entre el retículo endoplasmático y la mitocondria. Luego, mediante el uso de rojo rutenio, un inhibidor de la entrada de Ca2+ a la mitocondria, se determinó que este evento es necesario para la fosforilación de Akt y para el incremento en el consumo de oxígeno en respuesta a insulina. De esta forma, el incremento en el Ca2+ mitocondrial surge como un importante intermediario en la respuesta a insulina que regula la respuesta metabólica inducida por esta hormona, mientras que el bloqueo en el traspaso de Ca2+ a la mitocondria podría ser un importante mecanismo patológico que reduce la respuesta a insulina / Cardiac hypertrophy is a pathophysiological process that aims to compensate an increase in the working load of the heart. This process is characterized by an increase in cardiomyocyte size, the cells in charge of heart contraction, leading to an enlargement of this organ. In the beginning, hypertrophy aims to improve cardiac function, a process known as adaptative hypertrophy. If it is maintained in time it can turn into a pathological hypertrophy, which is irreversible and predisposes to arrhythmia, heart failure and sudden death. At the same time, the hypertrophic heart shows significant changes on energy metabolism, Ca2+ handling and an insulin resistant condition. Insulin is a key regulator of energy metabolism and plasma glucose levels. In the heart, its main function is to promote glucose entry to the cardiomyocytes and its use as an energy source through the activation of glycolysis and oxidation in the mitochondria. Insulin resistance observed in cardiac hypertrophy is associated with a reduced working capacity and is a risk factor for heart failure and post-ischemic cell death. That is the reason why a better understanding of its molecular characteristics is of great relevance. Recently, it has been described that Ca2+ exit from the endoplasmic reticulum (the main reserve of intracellular Ca2+) through inositol 1,4,5-triphosphate receptor/channel is a key element for insulin action, including glucose uptake. In addition, it is known that mitochondrion is very important in the regulation of Ca2+ signals, acting as a buffer and up taking Ca2+ after an increase in its cytoplasmic levels, especially following a release through this channel. At the same time, this Ca2+ is an important regulator of mitochondrial metabolism. In spite of its Ca2+-releasing capacity, it is not known if insulin regulates mitochondrial metabolism through an increase in mitochondrial Ca2+ levels. Additionally, it is also unknown if the insulin resistance generated by hypertrophy occurs in response to a reduced Ca2+ release in response to this hormone. In order to answer these queries, the main objective of this thesis consisted in evaluating if hypertrophic cardiomyocytes show a reduced mitochondrial and/or cytoplasmic Ca2+ signal after insulin stimulation compared to normal cardiomyocytes. To evaluate this possibility, neonatal rat cardiomyocytes where stimulated with norepinephrine, a classic stimulus to generate pathologic hypertrophy, for 24 h and then the Ca2+ signal in response to insulin was measured. In order to confirm the reduced insulin response of these cardiomyocytes, Akt phosphorilation, a marker of the metabolic action of insulin, and oxygen consumption, a measure of mitochondrial metabolic activity, were evaluated after insulin stimulation. Both parameters showed a reduction in hypertrophic cardiomyocytes in response to insulin. Insulin Ca2+-signal was measured by confocal microscopy and cytoplasm and mitochondrion-selective Ca2+- sensitive fluorescent probes. Hypertrophic cardiomyocytes showed a reduction in mitochondrial Ca2+ increase after insulin stimulation, whereas cytoplasmic Ca2+ increase was unaffected. By a colocalization analysis using confocal microscopy and organelle-specific fluorescent probes, it was determined that a reduction in contacts between both organelles could explain the reduction in Ca2+ transfer in hypertrophic cardiomyocytes. Finally, pharmacological blocking of Ca2+ entry to the mitochondria through the use of ruthenium red showed that this process was necessary to the increase of Akt phosphorilation and oxygen consumption after insulin stimulation. In this way, mitochondrial Ca2+ uptake comes as a novel and significant mediator in the regulation of insulin response, while the blockade of Ca2+ transfer to the mitochondria could by an important pathological mechanism that leads to insulin resistance / FONDAP; FONDECYT
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Estudio de las alfa-quimioquinas en la regulación del proceso de diferenciación de neuroesferas obtenidas de médula espinal de ratón

Cristi Muñoz, Francisca January 2012 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica en el área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El recambio de elementos celulares en el tejido nervioso es sustentado por la existencia de una célula troncal neural, responsable del proceso de neurogénesis a través del cual se generan neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Recientemente se han identificado algunas quimioquinas con la capacidad de regular el proceso de neurogénesis a partir de una célula troncal neural. En particular, se ha descrito que la alfa-quimioquina CXCL12 y su receptor CXCR4 participan en el desarrollo de estructuras del sistema nervioso central y regulan procesos de proliferación y diferenciación en el cerebro adulto. Sin embargo, el rol que cumplen las alfaquimioquinas y específicamente la quimioquina CXCL12 y sus dos receptores CXCR4 y CXCR7 regulando capacidades funcionales de las células troncales neurales de la médula espinal, aún no está claro. Por lo anterior, esta tesis postula que “las alfa-quimioquinas regulan el proceso de diferenciación de células troncales neurales cultivadas como neuroesferas obtenidas de médula espinal de ratones”. Para evaluar esta hipótesis se utilizaron neuroesferas derivadas de la médula espinal de embriones en estadio E18,5. Se demostró que estas neuroesferas contenían células troncales neurales evaluando las capacidades de autorrenovación y diferenciación. En ellas se determinó que sólo estaba presente el RNA mensajero de la alfa-quimioquina CXCL12 y sus receptores y no el de CXCL1 y sus receptores mediante RT-PCR. De esta manera el estudio se focalizó en CXCL12 y sus receptores CXCR4 y CXCR7. Mediante inmunofluorescencia se detectaron estos receptores en neuroesferas luego de 4 días de diferenciación y se observó que estaban en las células troncales neurales. Finalmente se analizó el proceso de diferenciación, evaluando mediante inmunofluorescencia marcadores de linajes neurales. Se observó que CXCL12 favoreció la diferenciación astroglial sobre la neuronal, comparando la intensidad de fluorescencia de marcadores neurales como GFAP y beta-III-tubulina y que, aparentemente, tanto CXCR4 como CXCR7 participan en el proceso de diferenciación, deducido de los resultados conseguidos con el uso del antagonista de CXCR4, AMD3100. En consecuencia, es posible proponer a la quimioquina CXCL12 como un blanco terapéutico pudiendo bloquearla en casos de lesión a la médula espinal, donde ésta se ve aumentada, para así impedir que las células troncales endógenas se diferencien a astrocitos / The renewal of cells in nervous tissue is sustained by neural stem cells, which are responsible for the neurogenesis that originates neurons, astrocytes and oligodendrocytes. The mechanisms that regulate the functional capabilities of neural stem cells in the spinal cord are unknown. Recently, some chemokines have been identified as regulating factors of neurogenesis of neural stem cells. In particular, the CXCL12 alpha-chemokine and its receptor CXCR4 participate in the development of central nervous system structures and regulate proliferation and differentiation processes in the adult brain. However, the role of alphachemokines and specifically of CXCL12 and its receptors CXCR4 and CXCR7, on the regulation of functional properties of neural stem cells from spinal cord is not clear yet. With this background, this thesis postulates that “alpha-chemokines regulates the differentiation of neural stem cells cultured as neurospheres obtained from mouse spinal cord”. To evaluate this hypothesis, neurospheres from E18,5 mouse spinal cord were used. It was shown that the neurospheres had neural stem cells by assessing their self-renewal and differentiation capabilities. The presence of mRNA of alpha chemokines CXCL1 and CXCL12 and their receptors in neurospheres was evaluated by RT-PCR. Showing that neurospheres have CXCL12 and its receptors mRNA and not CXCL1 and its receptors mRNA. Therefore, the investigation continued with CXCL12 and its receptors CXCR4 and CXCR7. Both receptors were detected on neural stem cells by immunofluorescence after 4 days of differentiation. Finally, the process of differentiation was analyzed by immunofluorescence of neural markers. The comparison between GFAP and beta-III-tubulin fluorescence intensity indicates that CXCL12 promotes astroglial over neuronal differentiation. Apparently, inferred from the use of the CXCR4 antagonist AMD3100, both CXCR4 and CXCR7 participate in the differentiation of the neural stem cells from spinal cord. Given the results obtained in this thesis, it is possible to propose CXCL12 as a potential therapeutic target: blocking it to promote neuronal differentiation, for example, in cases of spinal cord injury, in which CXCL12 mRNA is increased; preventing differentiation of neural stem cells to astrocytes / FONDECYT; MINREB
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Aplicación del control estadístico de procesos al recuento de células somáticas de leche de estanque para el monitoreo de la calidad de leche en la X Región

Saavedra Löwenberger, Sandra Katrin January 2006 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo del estudio fue evaluar la factibilidad del recuento diario de células somáticas de leche de estanque (RCSE), como herramienta de monitoreo y mejoramiento de la calidad láctea, basado en el cambio determinado en el nivel de RCSE de un grupo de predios, y la respuesta observada en cada uno a la recepción frecuente de información de RCSE, analizada mediante técnicas del control estadístico de procesos, con el fin de interpretar el comportamiento de los RCSE diarios y establecer posibles relaciones con cambios de manejo o factores de variación del recuento celular. Se seleccionaron 21 predios proveedores de la planta Nestlé, Osorno; en los que se evaluó el sistema de monitoreo diario del RCSE (SMD), entre Agosto de 2002 y Marzo de 2003, cuyos propietarios o administradores fueron capacitados en la utilización e interpretación de los gráficos de control de Shewhart, proporcionándoles además planillas para el registro diario de manejos, eventualmente asociables a los cambios de RCSE diario evidenciados en los gráficos. Durante el estudio se entregó periódicamente a los productores una interpretación de los gráficos y un comentario sobre factores aparentemente relacionados con el comportamiento del RCSE. Para evaluar el avance del mejoramiento en los predios bajo SMD, se seleccionaron 25 predios proveedores de la misma planta, con niveles similares de RCSE y volumen de entrega de leche quincenal en el trimestre previo al inicio del estudio, los cuales continuaron bajo el sistema tradicional de monitoreo quincenal de RCSE (SMQ). Las diferencias entre predios bajo SMD y SMQ, se analizaron utilizando los RCSE quincenales y sus valores transformados a puntajes de células somáticas (PCS), mediante modelos estadísticos que incluyeron dos expresiones del factor tiempo: 14 tiempos de análisis (quincenas) y 2 períodos de estudio (primera y segunda mitad). Además, dentro de cada grupo de predios (SMD y SMQ), se realizaron análisis de regresión entre el RCSE y PCS con el tiempo de análisis, comparándose posteriormente sus pendientes mediante la prueba de t de Student. 3 El sistema de monitoreo afectó el RCSE y PCS (p ≤ 0,0001), determinándose para todo el período de estudio medias de 271.327 cél/ml (SMD) y 339.246 cél/ml (SMQ), lo que indica un 20% menos de recuento en los predios bajo SMD. Independiente del sistema de monitoreo, los RCSE y PCS tendieron a disminuir durante las 14 quincenas analizadas (p>0,05), pudiendo establecerse una diferencia significativa entre las medias correspondientes a la primera y segunda mitad del estudio: 322.044 y 288.528 cél/ml, respectivamente (p 0,05). Se encontró relaciones negativas significativas, para ambos sistemas de monitoreo, entre el RCSE y PCS con el tiempo; estimándose para todo el estudio disminuciones de 77.420 y 49.280 cél/ml, en los predios bajo SMD y SMQ, respectivamente. Aun cuando ello representa una superioridad de 57% en la tasa de descenso del RCSE en los predios bajo SMD respecto a los con SMQ, al comparar las pendientes de las regresiones, no se encontraron diferencias significativas entre sistemas de monitoreo. Mediante análisis de regresión individual en los predios bajo SMD, se identificaron 3 grupos según la evolución del RCSE a través del estudio. En 10 predios se registró un descenso significativo del recuento diario, en 3 se mantuvo constante y en 8 casos los valores aumentaron significativamente. Sólo un 20% de los predios que mostraron una reducción del RCSE, presentaban valores de recuento correspondientes a la bonificación máxima estipulada por la pauta de pago (≤250.000 cél/ml), en el trimestre previo al estudio; condición en que se encontraba el 100 y 62,5% de aquellos en que el recuento se mantuvo estable o aumentó, respectivamente. Los gráficos de control permitieron analizar detalladamente el comportamiento del RCSE en todos los predios bajo SMD. Sin embargo, sólo en un 67% de los casos pudo obtenerse la información de manejos diarios, mayoritariamente sólo para parte del período en estudio. Aún así, en un 52% del total de casos, se logró establecer posibles relaciones entre cambios de manejo o factores específicos, con el comportamiento del RCSE evidenciado en los gráficos, tales como, cambio estacional de alojamiento de las vacas, cambio de ordeñadores, ordeña accidental de vacas con mastitis clínica, suspensión o postergación de la ordeña debido a la 4 interrupción del suministro eléctrico, eliminación de vacas con mastitis subclínica crónica o mastitis clínicas recurrentes, y desvío del estanque de la leche proveniente de las vacas con altos recuentos celulares. Se concluye que el descenso observado en el RCSE en los predios bajo SMD, refleja principalmente la disminución verificada en aquellos que exhibían previamente, niveles de recuento que no permitían acceder a la bonificación máxima estipulada en la pauta de pago. Los gráficos de control de Shewhart constituyen una herramienta útil para el monitoreo del RCSE diario, aunque la factibilidad de su aplicación al mejoramiento de la calidad láctea, depende de la información de manejo que registren los productores, la asesoría que reciban en su interpretación y en el análisis de su relación con cambios de manejo o medidas específicas de control de mastitis, y el estímulo que generen las pautas de pago de leche para lograra mayores avances en el mejoramiento de la calidad láctea. / Financiada por COOPRINSEM
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Regulación de la compartimentalización de la comunicación retículo endoplásmico-mitocondria en la línea tumoral hela

Bravo Sagua, Roberto January 2015 (has links)
Doctor en Bioquímica / El retículo endoplásmico (RE) y la mitocondria son organelos celulares que entablan una continua y dinámica conversación que permite a la célula responder coordinadamente a diversas situaciones fisiopatológicas. Datos previos de nuestro Laboratorio mostraron que ambos organelos incrementan los puntos de contacto físico durante la fase temprana del estrés de RE, permitiendo una mayor transferencia de Ca2+ desde el RE hacia la mitocondria y estimulando así el metabolismo de este último organelo y favoreciendo la sobrevida celular. El presente proyecto estudió la participación de proteína quinasa A (PKA) y caveolina-1 (Cav1) como agentes reguladores de esta interacción física y funcional entre el RE y la mitocondria. Como modelo de estudio se utilizaron células HeLa tratadas con tunicamicina como agente inductor de estrés de RE por 4 h. Primero, se investigó la participación de PKA en la fase temprana del estrés de RE. Esta quinasa se activó ante condiciones de estrés, medido por la fosforilación de DRP1 en Ser637 por Western blot y concomitante elongación mitocondrial (microscopía confocal). El inhibidor específico de PKA H89 previno estos cambios, comprobando que ambos son dependientes de PKA. Posteriormente, se estudió la participación de PKA en el acoplamiento RE-mitocondria a través de la medición de proximidad (microscopía confocal), contactos físicos (microscopía electrónica), transferencia de Ca2+ (microscopía de fluorescencia) y bioenergética mitocondrial (tasa de consumo de oxígeno). El papel de PKA en estos procesos se evaluó por modulación farmacológica con H89. Los resultados mostraron que la activación de PKA es necesaria para inducir la formación de contactos RE-mitocondria, y de esta forma, gatillar la respuesta adaptativa frente a estrés de RE. Luego se investigó el papel de Cav1 sobre la interface RE-mitocondria. La expresión de Cav1 abolió completamente la respuesta adaptativa frente a estrés de RE temprano, evidenciado mediante proximidad entre organelos, transferencia de Ca2+ y respiración mitocondrial. Además de alterar esta plasticidad organelar frente a condiciones de estrés, la expresión de Cav1 disminuyó significativamente la bioenergética mitocondrial basal, junto con inducir un remodelado basal de la interface RE-mitocondria medido por purificación de las membranas del RE asociadas a mitocondria (MAM). Finalmente, se determinó que la expresión de Cav1 antagonizó la señalización de PKA, impidiendo que ella fosforile a DRP1 y promueva la elongación mitocondrial en respuesta a estrés de RE. Más aún, mediante fraccionamiento subcelular, se estableció que Cav1 afectó la localización subcelular de PKA, evitando que se relocalice a las membranas microsomales en respuesta al estrés de RE. De este modo, Cav1 actúa como un regulador negativo de PKA, previniendo su activación frente a estrés de RE, evitando así la respuesta adaptativa celular / The endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria are two organelles that continuously communicate between one another. This organelle crosstalk allows mitochondria and ER to coordinate responses to a variety of physiological and pathophysiological situations. Data from a previous work show that during the early phase of ER stress, both organelles increase their contact sites, augmenting thereby calcium transfer from ER to mitochondria. This response boosts mitochondrial bioenergetics and ultimately promotes cell survival. Here, we sought to study the role of Protein Kinase A (PKA) and Caveolin-1 (Cav1) as regulators of such organelle crosstalk. As an experimental model, HeLa cells were treated with tunicamycin to induce ER stress. First, we observed that PKA was activated during early stages of ER stress, as assessed by increased phosphorylation of DRP1 at the inhibitory site Ser637 (Western blot), and that this event was followed by mitochondrial elongation (confocal microscopy). The specific PKA inhibitor H89 prevented these changes, thus confirming that they were due to PKA and not another kinase. Subsequently, we studied ER-mitochondria coupling by evaluating organelle proximity (confocal microscopy), physical contact sites (electron microscopy), Ca2+ transfer (fluorescence microscopy) and mitochondrial bioenergetics (oxygen consumption rate). PKA was again involved in these processes by pharmacological modulation using the inhibitor H89. Our results show that PKA activation is necessary to induce the formation of ERmitochondria contacts and to trigger the adaptive metabolic responses to ER stress. Next, we investigated the role of Cav1 as a modulator of the ER-mitochondria interface. Cav1 overexpression completely abolished the early adaptive response to ER stress, as assessed by evaluating the proximity between organelles, calcium transfer and mitochondrial respiration. In addition to altering organelle plasticity in response to stress conditions, Cav1 overexpression severely decreased baseline mitochondrial bioenergetics and induced basal remodelling of the ER-mitochondria interface, as determined by purification and analysis of mitochondria-associated ER membranes. Finally, we determined that Cav1 overexpression antagonizes PKA signalling, preventing PKA-dependent DRP1 phosphorylation and mitochondrial elongation in response to ER stress. Moreover, subcellular fractionation revealed that Cav1 affected PKA localization, prevented redistribution to microsomal membranes in response to ER stress, and altered the pattern of DRP1 phosphorylation. Thus, Cav1 functions as a negative regulator of PKA that precludes PKA activation during early ER stress and thereby prevents the adaptive cellular response / Fondecyt; Fondap;
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Rol de caveolina-1 en la quimiotaxis de las células dendríticas hacia los nódulos linfáticos

Cruz Gómez, Sebastián Matías January 2017 (has links)
Tesis para optar al grado de Magister en Bioquímica / Las células dendríticas (DCs) son células presentadoras de antígeno capaces de capturar y procesar antígenos que luego son presentados a linfocitos T específicos en órganos linfoides. Para activar a los linfocitos T, las DCs deben pasar por un proceso de maduración y migración hacia los nódulos linfáticos. Para esto, las DCs deben percibir el rastro de quimioquinas como CCL21, a través de receptores como CCR7, que las dirigen hacia los vasos linfáticos y finalmente al nódulo linfático. Dicho proceso se denomina quimiotaxis y es dependiente de la formación protrusiones celulares formadas por haces de filamentos de actina, que están especializadas en percibir el medio por el cual transita la célula. Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, la cual se ha relacionado con la migración celular, regulando a las GTPasas pequeñas Rac-1 y Cdc42, por lo tanto incidiendo en la capacidad de la célula de reorganizar el citoesqueleto y formar protrusiones celulares. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que caveolina-1 aumenta su expresión en DCs al ser estimuladas con LPS y que juega un rol fundamental en la llegada de las DC al nódulo linfático, así como en la generación de la respuestas de linfocitos T CD8+ citotóxicos in vivo. Sin embargo, caveolina-1 no participa en la maduración de las DCs ni en su capacidad de activar linfocitos T CD8+ in vitro. En este trabajo postulamos que caveolina-1 promueve la llegada de DCs al nódulo linfático regulando su capacidad quimiotáctica a través de la generación de filopodios vía Rac-1 o Cdc42. A través de ensayos de tinción cutánea con FITC, observamos que las DCs Cav-1-/- llegan en menor número al nódulo linfático en comparación a las DCs silvestres. Además, se evidenció que las DCs Cav-1-/- poseen una capacidad quimiotáctica disminuída en respuesta a CCL21 en cámaras de Boyden, no así en matrices de colágeno. A nivel molecular, se observó que las DCs Cav-1 -/- poseen menos actividad de Rac-1, pero no de Cdc42, y un menor número de filopodios con respecto a las DCs silvestres. Este trabajo sugiere que caveolina-1 favorece la llegada de las DCs al nódulo linfático, promoviendo la actividad de Rac1 y la formación de filopodios, lo que les permite entrar o migrar a través de los vasos linfáticos

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