Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Taís Nitsch Mazzola / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T10:36:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernachi_JessicaSantana_M.pdf: 2518686 bytes, checksum: 58cf0214c9aa6fb37c051da8088bd63a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A vacinação terapêutica com células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC) têm sido associada com o controle da carga viral em adultos infectados pelo HIV, mas os seus efeitos em crianças não foram explanados. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar a função das MDDC isoladas de crianças e adolescentes verticalmente infectados pelo HIV sob terapia antiretroviral combinada. Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, sendo 25 com carga viral indetectável e 14 com carga viral ?1000 cópias de RNA/mL. Além disso, 20 crianças e adolescentes saudáveis participaram como controles. Monócitos obtidos do sangue periférico foram cultivados durante seis dias com GM-CSF e IL-4 para a obtenção das MDDC, as quais foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à expressão de CD40, CD80, CD83, CD86, DC-SIGN e HLA-DR. As MDDC foram pulsadas com HIV-1 inativado por aldritiol-2 e cocultivadas com linfócitos autólogos para avaliação da expressão gênica e proteica de citocinas e da linfoproliferação HIV específica. Foram avaliados também hemogramas, subpopulações de células dendríticas mielóides e plasmocitóides e de linfócitos CD3, CD4 e CD8. As MDDC dos pacientes infectados pelo HIV apresentaram um fenótipo semelhante aos controles saudáveis e foram capazes de induzir a produção de citocinas do tipo Th1; no entanto, crianças com carga viral ?1000 cópias de RNA/mL apresentaram menor linfoproliferação HIV-específica. Em geral, as MDDC de crianças verticalmente infectadas pelo HIV geradas in vitro foram capazes de induzir resposta imune celular HIV específica, mostrando-se potenciais candidatos para imunização terapêutica usando MDDC / Abstract: Therapeutic vaccination with monocyte-derived dendritic cells (MDDC) has been associated with viral load control in immunized HIV-infected adults, but its effects in children were not explored yet. We aimed to evaluate the function of MDDC isolated from vertically HIV-infected children and adolescents under combined antiretroviral therapy. Patients were recruited at the Out-Patients Unit at the University of Campinas, which 25 patients had undetectable viral load and 14 patients had viral load ?1000 RNA copies/mL. In addition, 20 healthy children and adolescents served as controls. Monocytes obtained from peripheral blood were cultured for six days with GM-CSF and IL-4 to get the MDDC, which were assessed by flow cytometry for CD40, CD80, CD83, CD86, DC-SIGN and HLA-DR expression. T cell proliferation and cytokine expression and production were evaluated in cocultures of MDDC pulsed with aldrithiol-2-inactivated HIV-1 and autologous lymphocytes. Hemogram, myeloid and plasmacytoid dendritic cells and CD3, CD4 and CD8 lymphocytes were evaluated in the peripheral blood. MDDC from HIV-infected children exhibited a similar phenotype to those in healthy individuals and were able to induce a Th1-type cytokine production; however, T lymphoproliferation was impaired in children with viral load ?1,000 RNA copies/mL. MDDC generated in vitro boosted HIV-specific cellular immune responses in vertically HIV-infected children and could be potential candidates for MDDC therapeutic immunization / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestra em Ciências

Grado de doctor en ciencias biomédicas. / Melanoma es la neoplasia cutánea más agresiva, con una incidencia ascendente a pesar de numerosos esfuerzos de prevención. En la actualidad existen diversas estrategias de tratamiento, sin embargo, no todos los pacientes responden a ellas. En nuestro laboratorio se ha ensayado una inmunoterapia basada en células dendríticas (DCs) maduradas con un lisado de líneas celulares de melanoma (TRIMEL), que ha incrementado hasta 3 veces la sobrevida en pacientes que desarrollan una respuesta inmunológica de hipersensibilidad retardada (DTH+). Hasta la fecha no se han desarrollado avances en el estudio de la fracción no peptídica de este lisado ni de su capacidad de activar células iNKT, capaces de reconocer antígenos glicolipídicas en contexto CD1d. Hipótesis: Células iNKT infiltran tumores de pacientes con melanoma avanzado y son capaces de ser activadas in vitro por células dendríticas utilizadas en inmunoterapia antitumoral. Objetivo General: Determinar el rol en pacientes con melanoma de células iNKT infiltrantes de tumor y activadas por células dendríticas maduradas ex vivo utilizadas en inmunoterapia antimelanoma. Métodos: Se determinaron células iNKT infiltrantes de tumor mediante inmunofluorescencia y se correlacionó su presencia en lesiones de melanoma primario en todos los estadios según Breslow con la sobrevida de la enfermedad. Se evaluó la capacidad de las fracciones glicolipídica y proteica de TRIMEL para inducir maduración en células dendríticas. Para este fin, las fracciones se obtuvieron mediante gradiente de densidad con MTBE (Metil-terbutil-éter) y se usaron para estimular DCs generadas en base a rhIL-4 y GM-CSF. En estas condiciones se evaluó la presencia de diversas moléculas de superficie y la producción de citoquinas. Para evaluar la capacidad de estas DCs de activar células iNKT, desde PBMC se aisló la población CD3+ mediante cell-sorting y cultivadas con distintas DCs generadas. Se analizó la proliferación celular utilizando el ensayo CFSE. También se evaluó la presencia de células iNKT mediante inmunofluorescencia en tacos de parafina de las DTH realizadas a pacientes de inmunoterapia. Resultados: Encontramos infiltración por células iNKT en todos los estadíos de la enfermedad, siendo mayor en Breslow avanzados, sin una correlación con la sobrevida global. Al evaluar la maduración de DCs, esta fue mayor en el grupo estimulada con la fracción peptídica de TRIMEL. DCs estimuladas con la fracción glicolipídica de TRIMEL no mostraron diferencias con la condición no tratada. Al evaluar mediante ensayo de proliferación realizado con CFSE, se evidenció mayor proliferación en la condición tratada con la fracción peptídica. Finalmente, sólo en 1 de 3 pacientes en los que se analizó la presencia de iNKT en las DTH se encontraron estas células. Conclusiones: unificando todos los hallazgos discutidos previamente, células iNKT infiltran tumores de melanoma, las que podrían ser inducidas a proliferar por DCs estimuladas con la fracción peptídica de TRIMEL y de esa forma migrar a sitios inflamados como representan las lesiones DTH. / Melanoma is the most aggressive skin tumor, with a growing incidence worldwide, despite of prevention strategies. Nowadays, there are several new therapies to treat it, however the overall survival continues to be low. Our lab has been studying a Dendritic Cell (DC) based immunotherapy maturated with a melanoma cell lines lysate (TRIMEL), which has increased survival up to 3 times in patients that developed a delayed type hypersensitivity response (DTH+). To this date no studies have been made regarding the non peptidic fraction of this lysate or its capability to activate a subpopulation of T Cells called iNKT cells, characterized by their ability to recognize glycolipids in a CD1d manner. Hypothesis: iNKT Cells infiltrate melanoma patient’s tumors and are capable to be activated in vitro by Dendritic cells Main Objective: To determinate the role of tumor infiltrating iNKT cells activated by matured Dendritic Cells ex vivo used in antimelanoma immunotherapy in melanoma patients Methods: The presence of tumor infiltrating iNKT Cells in primary melanoma in all of Breslow stages was evaluated by expression of TCR Vα24Jα18 by Immunofluorescence microscopy. To evaluate the capability of glycolipid and peptidic TRIMEL fraction to induce DCs maturation, they were isolated from TRIMEL using a MTBE (Metil-terbutil-ether) density gradient. Afterwards, these fractions were used to stimulate DCs generated with a rhIL-4 and GM-CSF protocol and surface molecules expression were assessed, as well as cytokine secretion. To evaluate DCs effectiveness to activate iNKT Cells’ proliferation, CD3+ population was isolated from Buffy Coats using cell-sorting technology and they were cultured with DCs. Proliferation was accessed with CFSE dye assay. Finally, DTH infiltrating iNKT cells were asessed in paraffined embedded samples by immunofluorescence microscopy. Results: We found that iNKT cells infiltrated melanoma tumors in every Breslow stage, with higher infiltration on advanced stages,with no correlation with overall survival. The peptidic fraction of TRIMEL induced higher expression of maturation related surface molecules in addition to cytokine secretion, whereas glycolipidic fraction showed no difference with the untreated condition. iNKT cell had a higher proliferation rate when cultured with DCs treated with the peptidic fraction of TRIMEL. And finally, we found the infiltration of iNKT in 1 of the 3 patients DTH. Conclusions: Taking together all the previous results, iNKT cells infiltrate melanoma Tumors, and they could be induced to proliferate by DCs stimulated with the peptidic fraction of TRIMEL and as well supporting their migration to inflamed tissues like the DTH samples. / 2022

Introdução: A infecção pelo HIV causa um profundo comprometimento da resposta imune do hospedeiro, podendo levar à aids. Várias estratégias terapêuticas têm sido testadas ao longo dos anos, entre elas a imunoterapia com células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos (MoDCs), pulsadas com HIV-1 inativado. Neste caso, a produção de vírus para o pulso das MoDCs consiste inicialmente no isolamento do vírus a partir de amostras de sangue do paciente e, em seguida, sua expansão em culturas de células CD4. Também deve ser considerado que quantidade excessiva de vírus pode ser tóxica para as MoDCs a serem pulsadas e do mesmo modo, quantidade insuficiente de vírus pode não ser efetiva para ativar uma resposta imune especifica. Neste contexto, a investigação do efeito de diferentes concentrações de vírus sobre o perfil fenotípico e funcional de MoDCs poderia auxiliar na determinação de uma quantidade ótima de vírus para o pulso das MoDCs e contribuir para o aperfeiçoamento da vacina terapêutica. Objetivo: Avaliar o efeito de diferentes quantidades de partículas virais, sobre o perfil fenotípico e funcional das MoDCs. Metodologia: Monócitos obtidos de indivíduos HIV+ foram diferenciados em MoDCs e pulsadas com HIV quimicamente inativado (3 partículas/MoDC, 30 partículas/MoDC, 300 partículas/MoDC). As células foram analisadas com relação ao perfil fenotípico, capacidade de internalizar p24, expressão de CD38, HLA-DR e CD69 e a produção de IFN-y por linfócitos T CD4+ e CD8+ autólogos. Resultados: O pulso com concentrações crescentes de vírus parece não interferir no perfil fenotípico e funcional das MoDCs. Conclusão: As diferentes quantidades de partículas virais utilizadas para o pulso parecem não ser tóxicas para as MoDCs estudadas, não tendo sido observadas diferenças com relação ao perfil fenotípico ou funcional das MoDCs / Introduction: The infection from HIV causes a profound impairment of the host immune response, which can lead to aids. Several therapeutic strategies have been tested over the years, including immunotherapy with monocyte - derived dendritic cells (MoDCs), pulsed with inactivated HIV-1. In this case, the production of virus for the pulse of the MoDCs initially consists of isolating the vírus from the patient\'s blood samples and then it into CD4+ cell cultures. It should also be considered that excessive amount of virus can be toxic to the MoDCs to be pulsed and likewise, insufficiently amount may not be effective for properly activate a specific immune response. In this context, the investigation of the effect of different virus concentrations on the phenotypic and functional profile of MoDCs could assist in the determination of an optimal amount of virus for the pulse of the MoDCs and contribute to the improvement of the therapeutic vaccine. Objectives: To evaluate the effect of different amounts of viral particles on the phenotypic and functional profile of MoDCs. Methods: MoDCs generated from HIV+ individuals were differentiated into MoDCs and pulsed with chemically inactivated HIV (3 particles /MoDC, 30 particles /MoDC, 300 particles /MoDC). Cells were analyzed for phenotypic profile, ability to internalize p24, expression of CD38, HLA-DR and CD69, and the production of IFN-y by autologous CD4 + and CD8 + T lymphocytes. Results: The pulse with increasing concentrations of virus does not seem to interfere in the phenotypic and functional profile of the MoDCs. Conclusion: The different amounts of viral particles used for the pulse appear to be non-toxic to the MoDCs studied, and no differences were observed regarding the phenotypic or functional profile of the MoDCs

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A esporotricose é uma micose de distribuição universal causada por fungos termodimórficos do complexo de espécies Sporothrix schenckii (S. schenckii). No Brasil, a esporotricose é considerada endêmica, sendo normalmente adquirida pela inoculação acidental do seu agente causal através da pele ou através da transmissão zoonótica por gatos infectados. As formas clínicas podem variar entre cutânea, linfocutânea e sistêmica, esta última sendo mais comumente observada em pacientes imunodeprimidos. A ineficácia do tratamento antifúngico contra esta micose, especialmente em pacientes imunocomprometidos, tem levado à busca de terapias mais eficazes e seguras. Com base em vários estudos que mostram a eficiente utilização de células dendríticas como ferramenta para o desenvolvimento de vacinas contra diferentes fungos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) ativadas com as proteínas da superfície celular de S. schenckii (PSCs) em camundongos infectados com S. schenckii strictu sensu. As BMDCs foram estimuladas com PSCs e analisadas quanto à expressão superficial de moléculas co-estimulatórias, bem como à secreção de citocinas pró-inflamatórias. Posteriormente, camundongos sádios foram vacinados com uma ou duas doses de BMDCs para avaliar a sua imunogenicidade e, por último, foi avaliado o efeito das BMDCs em camundongos infectados por S. schenckii. Nossos resultados mostram que as PSCs foram capazes de ativar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is a universally distributed mycosis caused by thermodimorphic fungi of the Sporothrix schenckii (S. schenckii) species complex. In Brazil, sporotrichosis is considered endemic and is usually acquired by accidental inoculation of its causative agent through the skin or through zoonotic transmission by infected cats. Clinical forms may vary between cutaneous, lymphocutaneous and systemic, the latter being more commonly observed in immunosuppressed patients. The ineffectiveness of antifungal treatment against this mycosis, especially in immunocompromised patients, has led to the search for more effective and safe therapies. Based on several studies showing the efficient use of dendritic cells as a tool for the development of different fungal vaccines, the aim of this work was to evaluate the protective capacity of bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) activated with cell surface proteins of S. schenckii (ScCWP) in mice infected with S. schenckii strictu sensu. The BMDCs were stimulated with PSCs and analyzed for surface expression of costimulatory molecules and the secretion of proinflammatory cytokines. Subsequently, healthy mice were vaccinated with one or two doses of BMDCs to assess their immunogenicity, and finally the effect of BMDCs on S. schenckii infected mice was evaluated. Our results show that the ScCWPs were able to activate BMDCs. Immunization of healthy mice with ScCWPs-stimulated BMDCs induced a Th17 profile immune response, with increased T... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

A comunicação entre sistema nervoso e imune contribui para a homeostasia. Em humanos, a convivência com portadores de doenças crônicas (\"caregiving\") é agente causador de alterações inclusive imunológicas. Modelos animais podem contribuir para a compreensão dos mecanismos aí envolvidos. Avaliamos aqui, em fêmeas sadias, as alterações decorrentes do convívio com parceira singenêica (C57/Bl6) portadora do melanoma B16F10. Os resultados mostraram que esta convivência, por 20 dias: 1) alterou o comportamento, sem modificar a concentração sérica de corticosterona; 2) aumentou a expressão de CD80 nas populações MHCII+CD11c+, no baço, mas não nos linfonodos; 3) diminuiu o percentual de células MHCII+CD80+ após cultura de medula óssea, por sete dias em meio com GM-CSF, IL-4 e LPS; 4) inibiu, parcialmente, a indução de uma reação de hipersensibilidade tardia; 5) não modificou o estabelecimento do melanoma. Assim, este modelo pode, com cautela, ser usado para o estudo das alterações imunes observadas em \"caregivers\". / The communication between the nervous and immune systems contributes to the homeostasis. In humans, living with chronic disease bearers (caregiving) is the causing agent of alterations including the immunological ones. Animal models can contribute for understanding the involved mechanisms. Herein, we evaluated, in healthy females, the alterations caused by cohabiting with a syngeneic (C57Bl/6) partner bearing the B16F10 melanoma. The results showed that such cohabitation for 20 days: 1) altered the behavior without modifying the corticosterone seric level; 2) increased the CD80 expression on MHC+CD11c+ cells at the spleen, but not those at the lymph node; 3) decreased the percentage of MHCII+CD80+ bone marrow cells cultured for 7 days in a GM-CSF, IL-4 and LPS medium. 4) partially inhibited the induction of a delayed type hypersensitivity; 5) did not modified the melanoma establishment. So forth, this model may cautiously be taken as a means for the study of immune alteration observed in caregivers.

O papel do complemento na modulação da resposta de células dendríticas não é bem entendido. Neste trabalho observamos que estas células produzirem proteínas do complemento e que o componente C3 regula positivamente a expressão de DC-SIGN, HLA-DR, CD1a, CD80 e CD86 e a produção de IL-6 e IL-12 por células dendríticas humanas. Também observamos, em modelo murino, menor expressão de MHC-II em células dendríticas C5aR-/-, a qual está associada com menor expressão do transativador de MHC-II; menor expressão de moléculas coestimuladoras nas células C3aR-/-, C5aR-/- e C5L2-/- e menor produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-6 em resposta a ligantes de TLR2 pelas células C3aR-/- e C5aR-/-. Conseqüentemente, a ausência de sinal pelos C3aR e C5aR, regula negativamente a habilidade destas células na indução da resposta de linfócitos T CD4+, modificando os níveis de proliferação e citocinas produzidas. De maneira conjunta, observamos participação do complemento na diferenciação e maturação de células dendríticas e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. / The role of complement in the modulation of dendritic cells functions remains elusive. Here we show that these cells are able to produce complement proteins and that complement C3 upregulates the expression of DC-SIGN, HLA-DR, CD1a, CD80 and CD86 and the production of IL-6 e IL-12 by human dendritic cells. We also observed, in a mouse model, lower expression of MHC-II in C5aR-/- dendritic cells, which is correlated to lower expression of MHC-II transactivator; lower expression of costimmulatory molecules in C3aR-/-, C5aR-/- and C5L2-/- cells and lower production of IL-12p40, IL-12p70 and IL-6 by C3aR-/- and C5aR-/- cells in response to TLR2 stimulation. In consequence to the absence of C3aR and/or C5aR signaling we observed that these cells have lower ability to induce CD4+ T cells proliferation and production of Th1 cytokines. Together our data show a participation of complement in dendritic cell differentiation and maturation and in the polarization of adaptative immune responses.

Imunidade protetora depende da geração e manutenção do repertório de linfócitos T de memória. A geração dessas células está correlacionada com a apresentação de antígenos pelas células dendríticas (DCs). O direcionamento de antígenos tem sido estudado como um novo método vacinal que consiste em entregar antígenos diretamente para DCs usando anticorpos monoclonais. O principal objetivo desse trabalho foi direcionar uma proteína de Plasmodium para a subpopulação DEC205+ de DCs. Camundongos foram imunizados e então desafiados dias depois, com esporozoítos de P. yoelii. A proteína direcionada não protegeu camundongos do desafio, mas a proteína não direcionada protegeu, alcançando níveis de proteção estéril em torno de 100% em alguns casos. Observamos correlação entre a quantidade dos anticorpos e a proteção relativa dos animais imunizados com a proteína não direcionada. Além disso, utilizando anticorpos monoclonais demonstramos que a região conhecida como major repeat pode ser utilizada como alvo direto de pesquisas em vacinas contra malária. / In general, protective immunity against many pathogens depends on the generation of memory T cells, and the survival of cells for a long period of time after initial contact with pathogens. We know that the generation of these cells is correlated with the activation of parasite-specific immune cells and the presentation of antigens for dendritic cell (DCs). Targeting antigens to DCs has been studied as a new vaccination method, delivering antigens directly to DCs using monoclonal antibodies. The goal was target circunsporozoite protein (CSP), from Plasmodium, to a DEC205+ (DC) subset. Mice were immunized and challenged days later using P. yoelii sporozoites. Targeting protein did not protect mice from challenge, but non-targeting CS lead to 100% of protection. We found correlation between levels of antibody with protection, and high levels of anti-CS IgG in mice immunized with non-targeting protein. Using monoclonal antibodies we were able to map major repeat as a potential target for new researches in malaria vaccine.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis e é considerada a 10º causa de morte dentre doenças infecciosas e parasitárias no Brasil. As células dendríticas (DCs) são as mais eficientes na apresentação de antígenos, e sendo de 100 a 1000 vezes mais eficientes que um adjuvante não específico. P10, motivo específico de 15 aminoácidos derivado da gp43 excretada pelo fungo, é reconhecido por linfócitos T, direciona para resposta Th1 e confere proteção no modelo experimental. Nesse sentido, analisamos a capacidade de DCs pulsadas com P10 em ativar uma resposta protetora. In vitro observamos que a proliferação de esplenócitos foi maior quando a reestimução era feira com P10 e DCs juntos. In vivo, camundongos infectados e tratados com DCs pulsadas com P10 apresentaram diminuição da carga fúngica e melhoria do tecido pulmonar, aumento de IFN-<font face=\"Symbol\">g/IL-12 e diminuição de IL-4/IL-10. Esses resultados evidenciam o potencial das DCs atuando como adjuvante para o P10 em uma vacina para o tratamento e cura da PCM. / Paracoccidiodomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis. In Brazil, it is ranked as the tenth cause of death among the chronic infectious and parasitic diseases. Dendritic cells (DCs) are the most efficient antigen presenting cells, and they are at least 100-1000 times more efficient than a non specific adjuvant. The P10, 15-amino acid peptide motif derived from gp43 secreted by the fungus, is recognized by T cells, induces Th1 response and protects mice in a murine model of the disease. In the present work we analyzed the ability of DCs pulsed with P10 to elicit a protective response. In vitro results showed that a stronger proliferation of the splenocytes was reached when induced by DCs with P10. In vivo, mice infected and treated with DCs pulsed with P10 showed reduce of the fungi burden with less inflamed areas, higher levels of IFN-<font face=\"Symbol\">g/IL-12 and lower levels of IL-10/IL-4. All that point out the importance of the adjuvant role of DCs when developing a vaccine using P10 for the treatment or cure of PCM.

A paracoccidioidomicose (PCM) é a micose sistêmica mais frequente no Brasil. Na última década, foi demonstrado que é possível enviar antígenos diretamente para as células dendríticas utilizando o anticorpo &#945;DEC205 e na presença de um estímulo de maturação, o resultado é a indução de uma resposta imunológica. Verificamos que o anticorpo &#945;DEC fusionado ao peptídeo P10 induziu uma resposta por células produtoras de IFN-&#947; após uma única dose em relação à administração de P10, mesmo tendo sido administrado em uma concentração menor. Entretanto, essa resposta não se manteve após segunda dose do anticorpo. Após desafio dos animais com P. brasiliensis, imunizados com duas doses do anticorpo quimérico, detectamos níveis de IFN-&#947; e IL-4 no tecido pulmonar estatisticamente maiores no grupo &#945;DEC/P10 e ISO/P10 em relação à administração de P10, todos em presença de Poly I:C. Em ensaios de terapia, verificamos no pulmão de camundongos tratados com o anticorpo quimérico, principal órgão envolvido em modelo animal de PCM, baixa concentração de IFN-&#947; e IL-10 em relação aos controles. Em adição, ficou evidente que nos animais tratados com o anticorpo &#945;DEC/P10 o tecido pulmonar está compatível com o tecido de animais não infectados, enquanto que na ausência de tratamento adequado encontramos aglomerados de leveduras e um tecido com aumento no infiltrado celular. Esses achados indicam uma boa evolução clínica em animais tratados e indicam que o direcionamento do P10 através do anticorpo quimérico &#945;DEC/P10, na presença de Poly I:C, é uma estratégia promissora para terapia contra P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most common systemic mycosis in Brazil. In the last decade, it was demonstrated that antigens can be directly target to the dendritic cells using the antibody &#945;DEC205 in the presence of a maturation stimulus, resulting in the induction of a strong immune response. We found that &#945;DEC205 antibody fused to peptide P10 induced great response by IFN-&#947; producing cells after a single dose in relation to the administration of P10, although it has been administered in a lower concentration. However, this response was not maintained after second dose of antibody. Animals challenge with P. brasiliensis, after immunization with two doses of the chimeric antibody, produced high levels IFN-&#947; and IL-4 in lung tissue significantly higher in &#945;DEC/P10 group in relation to the administration of P10, all in the presence of Poly I:C. In therapy assays, we found in the lungs of mice treated with the chimeric antibody, the main organ involved in an animal model of PCM, low concentration of IFN-&#947; and IL-10 compared to controls. In addition, it became evident that animals treated with &#945;DEC/P10 antibody have a lung tissue much closer to that of non-infected tissue, while in the absence of suitable treatment we find clusters of yeasts and tissue filled with cellular infiltrates. Altogether, these findings show a clinical improvement in treated animals and indicate that targeting of P10 through the chimeric antibody &#945;DEC/P10 in the presence of Poly I:C, is a promising strategy for therapy against P. brasiliensis.